腺苷酸环化酶相关蛋白(cap1)及其作为免疫调节靶标的应用的制作方法

专利名称：腺苷酸环化酶相关蛋白(cap1)及其作为免疫调节靶标的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)作为免疫调节靶标的应用。更具体而言，本发明涉及CAPl或与CAPl相互作用的化合物在用于治疗免疫病症的组合物和方法中的应用。
背景技术：
本申请中提及的所有出版文献都通过援引完整地并入本文中，包括其中所引用的所有参考文献。结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis)的65kDa热休克蛋白(HSP65)在自身免疫性关节炎的发病机理中起重要作用。其效果在佐剂性关节炎(AA)的实验模型中得到了良好的例证。通过皮内接种悬浮在弗氏佐剂中的热灭活的分枝杆菌，可以在诸如Lewis 或Wistar等大鼠的易感近交系中诱导AA。可以通过对HSP65的180 188残基有反应性的 T 细胞克隆来被动转移 AA(Holoshitz，J.等，Science 219:56-58(1983))。已有证据报道抵御疾病的保护可能归因于对HSP65的细胞应答(Lider， 0.等,Proc. Natl. Acad. Sci. 84 4577-4580 (1987) ；Moudgil, K.等,J. Exp. Med. 185 1307-1316(1997))，这表示该蛋白具有参与发病机理和抗性获得的不同表位。本发明人之前已揭示，对AA的抗性还可以通过针对HSP65的抗体来赋予，并且可以通过向易患关节炎的大鼠静脉内输注来自抗关节炎品系的免疫球蛋白来被动转移(Ulmansky，R.和 Y. Naparstek, Eur. J. Immunol. 25 :952_957 (1995))。进一步的分析明确了抗-HSP 保护性抗体对氨基酸残基31 46(称为肽-6，并且也由SEQ ID NO. 1表示)的表位特异性 (Ulmansky, R.和 Y. Naparstek, J. Immunol. 168 :6463_6469 (2002))。用此月太对 Lewis 大鼠进行的疫苗接种导致产生了针对整个分子的抗体以及针对疾病诱导的抗性。发明人之前已揭示，针对肽-6的多克隆抗体刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生 IL-10 (Ulmansky (2002)，同上)。抗炎细胞因子IL-10在先天性免疫中起重要作用，主要是由于其使炎性应答受到抑制的抑制效果。由本发明人制造的单克隆的以及嵌合和人源化的抗-肽-6抗体(Proximab)显示可以通过与PBMC结合并刺激细胞分泌IL-10而保留这种保护性效果。现在本发明人还揭示针对肽-6的抗体不仅与肽_6相互作用，而且还与单核细胞 (monocyte)上的表面配体直接交叉反应，并且这种相互作用是理解这些抗体的作用机制的关键。在抗-肽_6抗体与单核细胞结合后，会激活引起细胞因子特别是IL-10的产生和分泌增加的信号转导途径，IL-10作为抗炎细胞因子削弱并抑制炎性过程，从而引起改善和治疗炎性病症。这会使诸如肿瘤坏死因子α (THF-α)等促炎Thl细胞因子与诸如IL-10等抗炎Th2细胞因子间的平衡发生倾斜。因此本发明人已揭示，抗_肽_6抗体的使Thl/Th2 平衡偏向Th2抗炎应答的调节作用可以用于治疗炎性病症。如本发明所指出，抗-肽-6抗体的细胞靶标是CAPl蛋白。环化酶相关蛋白(CAP)在进化上是保守蛋白，其在调控肌动蛋白细胞骨架和信号转导途径中起作用。哺乳动物具有两个CAP基因，编码相关的CAPl和CAP2。CAPl显示出广范的组织分布，而CAP2仅在脑、 心脏及骨骼肌和皮肤中显著表达。人CAPl的cDNA已经被鉴定和克隆，并显示出编码与酵母CAP蛋白同源的具有475个氨基酸的蛋白。最初的CAP是作为酿酒酵母的腺苷酸环化酶复合体的组分被分离出的，所述复合体是营养信号传导过程中的Ras/环AMP途径的效应子。CAP是多功能分子，包含参与若干功能的结构域。NH2端对于针对激活的RAS蛋白的细胞应答性而言是必要且充分的，而COOH 端对正常的细胞形态和生长控制而言是必需的。在酵母中进行的遗传学研究暗示CAP与囊泡运输和内吞作用有关。CAP在多细胞生物中起发育上的作用，对果蝇属的研究已表明肌动蛋白细胞骨架在眼发育过程中和在建立卵母细胞极性中的重要性。人CAPl是肌动蛋白-丝切蛋白(cofilin)复合体的组分。人CAP是双功能蛋白， 其具有与Ras-应答性腺苷酸环化酶结合的N端结构域和抑制肌动蛋白聚合的C端结构域。 据观察，CAPl及其C端结构域可以促进肌丝在倒刺端(barbed end)的延伸并刺激球状(G) (单体)肌动蛋白亚基上的ADT-ATP交换，即容易地使聚合性G-肌动蛋白再生的过程。本发明首次揭示出抗-肽-6抗体与CAPl分子的直接相互作用会导致可能通过 cAMP依赖性蛋白激酶而诱导IL-10的表达，所述相互作用反映出CAPl作为关键要素参与该新途径。这些发现提供了这样一种可能使用CAPl作为对该特定途径进行免疫调节的靶标。此外，抗-CAPl抗体显示出诱导IL-10的表达，从而表明了使用CAPl结合化合物作为免疫调节剂的可行性。 因此，本发明的目标在于提供与CAPl特异性地结合并相互作用的化合物在用于治疗免疫相关病症的方法和组合物中的应用。本发明的另一目标在于提供CAPl及其任何片段作为免疫调节化合物的应用。在又一目标中，本发明提供CAPl在用于鉴定免疫调节化合物的筛选方法中的应用。此类化合物可以用于调节患有免疫相关病症的受试对象中的Thl/Th2平衡。本发明的这些目标或其它目标将随着说明的进行而变得明显。

发明内容
在第一方面，本发明涉及用于调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡的组合物。本发明的组合物包含免疫调节有效量的下述(a)和/或(b)中的至少一种或其任意组合作为活性成分(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。本发明的组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。根据一个具体实施方式
，本发明的组合物包含治疗有效量的抗-CAPl抗体作为活性成分。本发明还提供治疗组合物，所述组合物用于通过调节有需要的受试对象中的Thl/ Th2平衡而治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作。本发明的治疗组合物包含免疫调节有效量的下述(a)和/或(b)中的至少一种或其任意组合作为活性成分(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。该组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
本发明的另一方面涉及用于治疗、预防、改善或推迟有需要的受试对象中的免疫相关病症的发作的方法。本发明的方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的下述(a)和 /或(b)中的至少一种或者其任意组合或包含其的任意组合物的步骤(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。在另一方面，本发明涉及治疗有效量的下述(a)和/或(b)中的至少一种或其任意组合在制备用于治疗免疫相关病症的组合物中的应用(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白 (CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。在第五方面，本发明提供腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物，其调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡，并用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作。本发明还提供抗-CAPl抗体，所述抗-CAPl抗体特异性地识别并结合CAPl从而将有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节，并用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作。此外，本发明涉及免疫调节化合物的筛选方法，所述化合物调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡。本发明的方法包括以下步骤(a)获得与CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物结合的候选化合物；(b)确定步骤(a)中选择出的化合物对调节抗炎细胞因子表达的影响。由此，所述候选化合物对抗炎细胞因子或促炎细胞因子的表达的调节可指示该化合物调节受试对象中的Thl/Th2平衡的能力。本发明还提供与CAPl相互作用从而调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡的免疫调节化合物，其中该化合物是通过本发明的筛选方法而鉴定的。最后，本发明涉及一种药物单位剂型，所述药物单位剂型用于制备对于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作而言有效的药物，并包含治疗有效量的下述(a)和/或 (b)中的至少一种或其任意组合作为活性成分(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。本发明的剂型还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。借助于以下附图，本发明的其他方面将变得明显。


图 1鼠抗-肽-6抗体体外诱导IL-10的分泌使原态(naive)人单核细胞在RPMI中与鼠抗-肽_6单克隆抗体(mAb) —起温育(24h，37°C，5% C02)，并通过ELISA测量IL-10向培养基中的分泌。未处理的细胞作为对照。缩写Mon.ce·(单个核细胞)；α-ρ印6 (抗-肽_6 (SEQ ID NO. 1)抗体)；Un.(单位)；IL-10 (白细胞介素10)。图 2A 2B抗-肽-6抗体诱导IL-10转录的短暂上调
将人单核细胞(PBMC)与鼠B24抗-肽-6单克隆抗体、作为阴性对照的全原态 Lewis IgM抗体或作为阳性对照的脂多糖(LPS) —起温育。在暴露于B24、LPS或全原态 Lewis IgM对照4小时和24小时后收获细胞，并使用RT-PCR测定提取出的mRNA(图2A)。 与未处理的细胞和经原态Lewis IgM处理的细胞相比，暴露4小时后，LPS和抗-肽-6抗体均诱导IL-IOmRNA的增加。然而，在与抗体温育24小时后，用抗-肽-6处理的细胞中的表达水平减少，这与经LPS处理的细胞相反，在后者中mRNA水平在暴露后24小时保持恒定。 使用GAPDH cDNA作为对照以获得相等的载量(图2B)。缩写UT.(未处理的)；LPS (脂多糖)；IgM(原态Lewis IgM抗体)；α -pep 6(抗-肽-6抗体)；hr.(小时)。图 3Proximab在体内诱导IL-10的表达并减轻佐剂性关节炎用CFA中的Img MT H37Ra对6 8周龄雌性近交Lewis大鼠的尾基部进行皮内注射。用磷酸盐缓冲溶液(PBS阴性对照)、类固醇或Proximab对动物进行处理。通过佐剂性关节炎(AA)评分来评估关节炎的严重程度。每隔一天由单盲观察者(blinded observer) 对关节炎作下述评价0，无关节炎；1，关节发红；2，关节发红并肿胀。对每只爪的踝关节和跗骨-跖骨关节进行评分。可以获得16的最高评分。通过ELISA测量IL-IO水平。结果是每组2只大鼠的平均值士SE。缩写Cont. (PBS阴性对照)；PROX(Proximab抗体)；STR(类固醇)；AA Sc.(佐剂性关节炎评分)；pg/ml (皮克/毫升)。图 4A 4D嵌合抗-肽-6抗体与分离的⑶14+人单核细胞PBMC结合用⑶14磁珠从人PBMC中分离出⑶14+细胞，并用经FITC标记的嵌合抗-肽_6 抗体(图4B)或抗人CD14-PE (图4C)或同时使用两者(图4D)来对上述CD14+细胞染色。 未染色的细胞(图4A)作为阴性对照。通过FACS对细胞进行抗体结合分析。如图4D所示， 大多数为⑶14阳性的细胞也对嵌合抗-肽_6呈阳性。图 5A 5CProximab 结合人 CD14+PBMC从健康供体中分离出人PBMC并在Ficoll梯度液上进行离析(separate)。用与 APC缀合的抗⑶14抗体(图5A)或者同时用经FITC-标记的Proximab和APC缀合-抗-⑶14 抗体(图5B)对所分离的细胞进行染色。被FITC染色的细胞占CD14+群体的百分比示于图5C中(无Proximab-黑色，有Proximab-灰色)。缩写α -CD14(抗-CD14抗体)； PR0X(抗-肽-6人源化抗体)。图 6A 6B嵌合抗-肽-6抗体和抗-⑶14抗体与单核细胞的膜结合将⑶14+Mono Mac 6 (MM6)细胞与嵌合抗-肽_6抗体(CHM抗体)一起温育，随后单独使用与FITC缀合的抗-人IgG抗体(图6A)或将其与小鼠-抗人CD14-APC—起使用(图6B)对细胞进行染色。染色后，将细胞固定并置于载玻片上，在共聚焦显微镜下进行观察。CHM抗体的配体位于CD14阳性细胞的膜表面上。缩写CHM(嵌合抗-肽-6抗体)； CD14(抗-CD14 抗体)。图 7
人源化抗-肽-6抗体不通过人单核细胞Fc受体来结合MM6细胞或者未受处理，或者与未经标记的人源化抗_肽_6抗体变体VK3 —起预温育，或者与针对⑶32和⑶64的抗体一起预温育，随后用FITC-VK3处理MM6细胞并通过 FACS检验已结合的FITC-VK3。FITC-VK3与30 %的细胞结合(左侧柱)。与非荧光的VK3抗体一起预温育完全消除了 VK3-FITC结合(中间柱)，但与针对两种Fc受体的抗体一起预温育没有效果(右侧柱)。缩写VK3 (与FITC缀合的人源化抗_肽_6抗体)；PRI (VK3) +VK3 (与未经标记的VK3 —起预温育，随后与FITC VK3 一起预温育)；PRI (⑶32+⑶64) +VK3 (与抗 ⑶32和抗⑶64 —起预温育，随后与FITCVK3 —起预温育)；bo. Ce.(已结合的细胞)。图 8A 8B大鼠抗-肽-6抗体结合THP-I细胞将人前单核细胞性(promonocytic) THP-I细胞与大鼠抗-肽_6单克隆抗体(B24) 一起温育，而后进行FITC染色，随后进行FACS分析。将仅与二抗(FITC-山羊抗大鼠)一起温育的细胞作为对照(图8A)。与大鼠抗-肽_6单克隆抗体一起温育的细胞中的75% 与B24抗体结合(图8B)。图 9单克隆抗_肽-6的靶标是单核细胞的亲水性膜蛋白亲水性膜蛋白、疏水性膜蛋白和细胞质蛋白分离自THP-I细胞，并使用鼠B24单克隆抗-肽-6抗体进行蛋白质印迹分析(数据未示出)。用全大鼠免疫球蛋白或仅用培养基对对照印迹进行印染。泳道1-亲水性膜蛋白；泳道2-疏水性膜蛋白；泳道3-细胞质蛋白。如所展示的，B24抗体结合亲水性膜蛋白的三个级分52kDa、IOOkDa和120kDa。在阴性对照印迹中未检测到结合。缩写kDa(千道尔顿)。图 10对抗-肽-6蛋白靶标的分析将THP-I细胞的亲水性膜蛋白级分加载到含有与琼脂糖凝胶珠结合的鼠单克隆抗-肽-6抗体的亲和柱上。将结合的蛋白洗脱并加载到SDS-PAGE上，随后进行考马斯蓝染色。泳道2代表大鼠抗_肽_6柱上的亲和色谱，泳道4代表小鼠抗_肽_6柱上的亲和色谱。泳道1和6含有标志物。在泳道2和4中可以看到约40kDa和50kDa的两条双重条带。将这些条带切下并通过质谱进行分析。对52kDa条带进行了测序，发现其包含腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)。图 11抗-肽-6与52kDa膜蛋白结合，也与MT-HSP65结合将从抗-肽-6亲和色谱柱洗脱出的THP-I亲水性膜蛋白和MT-HSP65加载到 SDS-PAGE中，并使用大鼠抗-肽-6抗体(B24)进行蛋白质印迹分析。检测到了两条不同的条带在加载有获自亲和柱的洗脱蛋白的泳道中观察到的52kDa蛋白，和与MT-HSP65的已知重量相符合的65kDa条带。缩写MT-HSP65(结核分枝杆菌热休克蛋白65) ；kDa(千道尔顿)。图 12A 12C抗-CAPl抗体结合完整THP-I细胞将THP-I细胞(0. 5X IO6/管)与10 μ g/ml抗-人CAPl抗体一起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并通过FACS进行分析。未染色的细胞(图12A)和经FITC染色的细胞(图12B)作为阴性对照。87%的THP-I细胞与抗-CAPl抗体(图12C)
社a
？口口。图 13A 13C抗-CAPl抗体不结合完整HeLa细胞将HeLa细胞(106/管)与10 μ g/ml抗-人CAPl抗体一起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并通过FACS进行分析。未染色的细胞(图13A)和经FITC 染色的细胞(图13B)作为阴性对照。少于1.5%的HeLa细胞与抗-CAPl抗体结合(图 13C)。缩写Us.(未染色)；ce.(细胞)，α -CAPl (抗-CAPl 抗体)。图 14Α 14C抗-CAPl抗体结合渗透化的THP-I细胞将经甲醇渗透化的THP-I细胞(0. 5 X IO6/管)与10 μ g/ml抗-人CAPl抗体一起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并通过FACS进行分析。未染色的细胞(图14A)和经FITC染色的细胞(图14B)作为阴性对照。96%的渗透化THP-I细胞与抗-CAPl抗体结合(图14C)。缩写Us.(未染色)；ce.(细胞)，α -CAPl (抗-CAPl抗体)。图 15Α 15C抗-CAPl抗体结合渗透化的HeLa细胞将经甲醇渗透化的HeLa细胞(106/管)与10 μ g/ml抗-人CAPl抗体一起温育， 随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并通过FACS进行分析。未染色的细胞(图 15A)和经FITC染色的细胞(图15B)作为阴性对照。96%的渗透化HeLa细胞与抗-CAPl 抗体结合(图15C)。缩写Us.(未染色)；ce.(细胞)，α -CAPl (抗-CAPl抗体)。图 16Α 16C抗-GAPDH抗体不结合完整ΤΗΡ-1细胞将人THP-I细胞与1 μ g的小鼠抗-CAPl (图16B)或小鼠抗-GAPDH (图16C) 一起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并与仅用二抗染色的细胞进行比较 (图16A)，并通过FACS进行分析。抗GAPDH抗体不结合完整THP-I细胞(图16C)，与抗CAPl 形成对比(图 16B)。缩写Cont.(对照)；α -CAPl (抗-CAPl 抗体)；α -GAPDH (抗-GAPDH 抗体)。图 17Α 17C抗-CAPl抗体结合渗透化的THP-I细胞将经甲醇渗透化的人THP-I细胞与1 μ g的抗-CAPl (图17B)或抗-GAPDH (图17C) 一起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色，并与仅用二抗染色的细胞进行比较(图17A)，并通过FACS进行分析。抗-GAPDH和抗-CAP 1均结合渗透化的细胞，表明两种抗体都是有效的抗体。缩写Cont.(对照)；α -CAPl (抗-CAPl抗体)；α -GAPDH(抗-GAPDH 抗体)。图 18Α 18DProximab和抗-CAPl抗体与CD14+小鼠单核细胞的细胞系RAW 264. 7的结合将小鼠RAW 264. 7与经荧光标记的与APC缀合的抗-⑶14 (图18A)或与FITC缀
9合的Proximab (图18B)或与抗-GAPDH(图18C)或与抗-CAPl抗体(图18D) —起温育，随后用与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG进行染色。通过FACS对这些不同抗体的结合特性(荧光强度细胞数量)进行了分析并呈现在此(未染色的细胞_黑色，染色的细胞-灰色)。 缩写Co.(计数)。图 19A 19DProximab与抗-CAPl竞争同一配体将THP-I细胞与Proximab —起预温育，随后用抗-人CAPl染色(图19D)，并且通过FACS分析将其与仅与抗-CAPl —起温育的细胞进行比较(图19C)。未染色的细胞(图 19A)和经FITC染色的细胞(图19B)作为阴性对照。与仅用抗-CAPl染色的细胞相比(图 19C)，与Proximab —起预温育导致与抗-CAPl抗体结合的细胞群体显著减少(图19D)。图 20Proximab与THP-I细胞结合的滴定曲线将人THP-I细胞(0. 5X IO6/管)与不同浓度的Proximab —起温育。温育后，洗涤细胞，随后使之与FITC缀合的山羊抗人Fc IgG 一起温育，并通过流式细胞术对细胞进行 Proximab结合分析。缩写Ab (抗体)；bin.(结合)；PROX (抗-肽-6人源化Proximab抗体)。图 21抗-CAPl与THP-I细胞结合的滴定曲线将人THP-I细胞(0. 5X IO6/管)与不同浓度的抗-CAPl —起温育。温育后，洗涤细胞，随后使之与FITC缀合的山羊抗小鼠Fc IgG—起温育，并通过流式细胞术对细胞进行抗-CAPl结合分析。缩写Ab (抗体)；bin.(结合)；α -CAPl (抗-CAPl抗体)。图 22在THP-I细胞中特异性敲弱CAPl用All Star 阴性 siRNA 或人 CAPl siRNA(各为 50pmole/ml)转染人 THP-I 细胞。 温育48小时后，收获细胞，并使用10% SDS蛋白样品缓冲液对细胞进行提取。将细胞提取物在SDS-PAGE上进行分辨，并通过电力转移至硝酸纤维素膜上。使用小鼠抗-CAPl抗体(50ng/ml)对硝酸纤维素进行蛋白质印记，并使用抗_ α _肌动蛋白抗体再次对其进行印记。观察到了 CAPl蛋白水平的特异性降低。缩写Cont. (All Star阴性siRNA对照)； α -CAPl (抗-CAPl抗体)；α -Actin (抗α -肌动蛋白抗体)。图 23Α 23D与THP-I细胞表面结合的抗-CAPl和Proximab在用CAPl siRNA处理时减少用All Star 阴性 siRNA(图 23A、23B)或用人 CAPl siRNA(图 23C、23D，各为 50pmole/ml)转染人THP-I细胞，并使该细胞与抗-CAPl抗体(图23A.23C, 500ng/ml)或 Proximab (图23B、23D，100ng/ml) —起温育。使用与FITC缀合的山羊抗小鼠和山羊抗人抗体进行流式细胞术分析。与对照细胞(图23A、23B)相比，在通过siRNA使CAPl的表达降低后，观察到抗-CAPl (图23C)和ProximaM图23D)与细胞的结合均显著降低。缩写 Cont. (All Star 阴性 siRNA 对照)；PROX(Proximab 抗体)；α -CAPl (抗-CAPl 抗体)。图 24Α 24Β抗-肽-6诱导CREB和SPl转录因子与IL-IO启动子的结合
将含有Spl和CRE基序的经放射性标记的寡核苷酸探针与细胞核蛋白一起温育， 所述细胞核蛋白提取自与B24抗-肽-6抗体或与全Lewis大鼠IgM抗体一起温育的PBMC 细胞；随后通过电迁移率移动测定(Electro Mobility Shift Assay, EMSA)进行分析。与仅显示出可忽略的蛋白结合的用全Lewis IgM进行的处理(最左侧泳道)相比，使细胞暴露于B24导致了 CREB (图24A)和Spl (图24B)转录因子与其所相应的源自IL-10基因启动子的基序的显著结合。突变的CRE和Spl几乎完全破坏了 B24所诱导的与两个部位的蛋白结合(最右侧泳道)。缩写CRE (cAMP应答元件)；mut (突变的)；AP6 (B24抗-肽_6抗体)。图 25蛋白激酶A(PKA)抑制剂KT5720的作用部位如箭头所示，该图示出了 PKA抑制剂KT5720的作用部位。缩写AC(腺苷酸环化酶)；Nuc (细胞核)；Prot.(蛋白)；Ιη·(抑制剂)。图 26ΚΤ5720以剂量依赖性方式抑制抗-肽_6抗体对IL-10的诱导在与抗-肽-6抗体一起温育15分钟前，将ΚΤ5720以不同浓度添加到PBMC中。这导致了对IL-10的分泌的剂量依赖性抑制。缩写DMSO (二甲亚砜)；UT (未处理的)。图 27Α 27FProximab 的 F(ab)2 片段结合 CD14+PBMC 细胞使用Dylight 抗体标记试剂盒(Pierce)用FITC对Proximab的F(ab)2片段进行标记。在Ficoll梯度液上对人PBMC进行离析。单独使用与PE缀合的抗⑶14 (图27A) 或将其与FITC缀合的Proximab F(ab)2 —起使用(图27B)来对所分离的细胞进行染色。 图27C绘出了被FITC染色的细胞占⑶14+群体的百分比(无Proximab F(ab)2-黑色，有 Proximab F (ab) 2_ 灰色)。用抗-人⑶14的磁珠(BD)进一步分离⑶14+PBMC细胞。将分离出的⑶14+细胞或者置于未染色状态(图27D)，或者用与APC缀合的抗CD14染色(图27F)，或者用FITC 缀合的Proximab F(ab)2染色(图27E)。Proximab F(ab)2结合了很大比例的CD14+细胞群体。缩写Us.(未染色的)；ce.(细胞)；Co.(计数)；α (抗)；PROX (Proximab抗体)； F (ab) 2 (Proximab F (ab) 2)。图 28Proximab、Proximab 的 F(ab)2 片段和抗-CAPl 抗体诱导 IL-10 从人 PBMC 分泌在Ficoll梯度液上对人PBMC进行离析。在RPMI中将所分离的细胞与 Proximab (200 μ g), Proximab F (ab) 2 (150 μ g)或抗-CAPl 抗体(8 μ g) — 起温育(48h， 37°C，5% CO2)，并通过ELISA测量IL-IO向培养基中的分泌。未处理的细胞作为对照。缩写=PROX(Proximab,抗-肽 _6 人源化抗体)；F(ab)2(Proximab 的 F(ab)2 片段)； α -CAPl (抗-CAPl抗体)；UT (未处理的)。图 29作用机制抗-肽-6抗体与位于单核细胞细胞膜上的CAPl结合，从而诱导包括Spl和CRE结合蛋白在内的转录因子的cAMP/PKA依赖性激活、IL-10的转录和分泌增加并促进抗炎免
疫应答。缩写AP6(抗-肽-6抗体)；Act.(激活)；Sil.(沉默)；Rep.(阻遏子)；Path. (途径)；Sec.(分泌)。图 30智人CAPl氨基酸序列人CAPl蛋白氨基酸序列(GeneBank登记号NP_001099000. 1，由GeneBank登记号 CAG33690. 1所示的人CAPl基因编码)，亦表示为SEQ ID NO :6。
具体实施例方式本发明首次证明了特异性地识别位于HSP65分子内的表位的抗体，即抗-肽_6抗体，与CAPl分子之间的直接相互作用。这种相互作用导致了对抗炎细胞因子IL-10的诱导。 本发明还揭示，cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)参与此抗-肽_6抗体途径。这些结果清楚地证明了 CAPl在此免疫调节途径中作为关键介体，并因此作为免疫调节的潜在靶标的作用。本发明还揭示出抗-CAPl抗体激活IL-10，从而证明了使用CAPl和与其相互作用的化合物作为免疫调节剂的可行性。因此，在第一方面，本发明涉及用于调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡的组合物。根据某些实施方式，本发明的组合物包含免疫调节有效量的下述(a)和(b)中的至少一种或其任意组合作为活性成分(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。本发明的组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。如上指出，本发明揭示了抗-肽-6抗体结合CAP1，并启动引起抗炎细胞因子 IL-10的表达增加并由此调节Thl/Th2细胞平衡的信号传导途径。因此，根据一些实施方式，本发明的组合物包含作为活性成分的化合物，所述化合物与CAPl特异性地相互作用并结合CAP1，由此调节受试对象中的Thl/Th2平衡。根据某些实施方式，此类CAPl-结合化合物可以是蛋白类化合物、核酸类化合物、 碳水化合物类化合物、脂类化合物、天然有机类化合物、合成源有机类化合物、无机类化合物和肽模拟物(ρ印tidomimetic)类化合物。在一个特定实施方式中，与CAPl特异性地结合并相互作用的化合物可以是蛋白类分子，尤其是免疫球蛋白样分子。更具体而言，本发明所用的CAPl-结合化合物可以是抗体。还应认识到的是，根据某些实施方式，本发明所用的CAPl结合化合物包括任何抗 CAPl抗体或任何识别并结合CAPl的抗体，条件是所述抗体不是本发明所述的多克隆、单克隆、嵌合或人源化的抗-肽-6抗体中的任何一种或者任何其他针对或识别肽_6(SEQ ID NO. 1)的抗体。另外，根据某些实施方式，本发明的CAPl结合化合物，其可以是抗-CAPl抗体，可以通过与位于CAPl分子内的和抗-肽_6抗体结合部位相同的部位或者备选地，通过任何不同的部位而与CAPl分子相互作用。如实施例11所示，特异性地识别并结合CAPl的抗-CAPl抗体引起IL-10的表达明显增加。
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因此，本发明的某些实施方式涉及本发明的组合物，其中作为活性成分的化合物可以是经分离的且纯化的抗-CAPl抗体，该抗体特异性地识别并结合CAP1，从而将Thl/Th2 平衡向Th2抗炎应答方向调节。根据某些实施方式，Th2抗炎应答涉及到抗炎细胞因子表达的增加。此类抗炎细胞因子可以是IL-10、IL-4、IL-6、IL-11、IL-13和IL-I受体拮抗剂中的任何一种。根据某些实施方式，Th2抗炎应答涉及到IL-10表达的增加。更具体而言，这种增加可以是此类细胞因子的表达增加了约10% 100%、10% 90%、10% 80%、10% 70%、10% 60% 或10% 50%的增加。特别而言，与适合的对照相比，尤其是与未经处理的受试对象或细胞相比，表达增加 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^； 100%。根据以上及其他实施方式，本发明提供用于本发明的组合物中的特异性地识别并结合CAPl的抗体。因此应注意的是，当述及CAPl分子内的表位时，术语“结合特异性”、“与 CAPl特异性地结合”、“具有与CAP 1的特异性免疫反应性”、“特异性地针对CAP1”或“特异性地识别”是指确定在蛋白或其他生物物质的异源群体中存在表位的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定表位的结合为背景的至少两倍，且更通常为背景的10 100倍。术语“表位”意在指能够被抗体识别并结合的任何分子(尤其是CAP1)的一部分。 表位或“抗原决定簇”通常由诸如氨基酸或糖侧链等具有化学活性的表面分子组构成，并且具有特定的三维结构特性和特定的电荷特性。如上指出，在某些实施方式中，本发明提供分离的且纯化的抗-CAPl抗体。如本文所用，“分离的”或“基本纯化的”在抗体或编码抗体的核酸分子的背景下意为已将该抗体或核酸从其天然环境中移出或已从其天然状态发生了改变。因此“分离的”不必然反映该抗体或核酸分子已经到被纯化的程度。然而应理解的是，已纯化的抗体或核酸分子在某种程度上讲是“分离的”。如果该抗体或核酸分子在天然环境中并不存在，即其并不存在于自然界中，则该分子就是“分离的”而无论其存在于何处。应注意的是，本发明的组合物所用的抗-CAPl抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体中的任何一种。针对蛋白的多克隆抗体的产生描述于例如Wiley and Sons Inc的 ((Current Protocols in Immunology〉〉的第二章中。通过在有利于杂交细胞生长的条件下与永生化B细胞的融合，可以从取自经免疫动物特别是大鼠和小鼠的脾和淋巴结的B细胞中制备单克隆抗体。产生单克隆抗体的技术描述于很多文章和教材中，例如在上述《Current Protocols in Immunology》的第二章中。如本文所用，术语“抗体”是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一个或多个多肽组成的蛋白。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和 μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为 Y、μ、α、δ或ε，这些类别进而分别定义了免疫球蛋白的类别，即IgG, IgM, IgA, IgD和 IgE0抗体可以作为完整免疫球蛋白存在，或者可以作为多种形式的变形存在，包括例如仅含有轻链和重链可变区的Fv片段、含有可变区和一部分恒定区的F(ab)或F(ab) ‘ 2 片段和单链抗体等。抗体可以源自动物或人，或者可以是嵌合的或人源化的。如本文所用， 术语“抗体”包括这些多种形式。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”(约50kDa 70kDa)链。每条链的N端界定了具有约100 110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别指这些轻链和重链。如本文以上指出，根据某些实施方式，本发明提供抗-CAPl抗体及其任意抗原结合片段作为活性成分在免疫调节组合物中的应用。术语“抗原结合片段”指抗体的保留了与CAPl的结合的任何部分。抗体的功能性片段的实例包括但不限于完整抗体分子，诸如 Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、Vl(轻链可变区)、Vh (重链可变区)、Fab、F(ab)2' 及其任意组合等抗体片段，或能够与靶抗原结合的免疫球蛋白肽的任何其他功能性部分。 本领域技术人员会认识到的是，各种抗体片段可以通过各种方法来获得，例如，用诸如胃蛋白酶等酶来消化完整抗体或从新合成。通常通过化学手段或通过使用重组DNA方法来从新合成抗体片段。因此，如本文所用，术语“抗体”包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段或使用重组DNA方法从新合成的那些(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定出的那些。术语“抗体”还包括二价分子、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)和四链抗体 (tetrabody)。述及“VH ”或“VH”时指的是免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、SCFv、二硫键稳定化的Fv (dsFv)或Fab。述及“ Vl，，或“ VL，，时指的是免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFV、 dsFv 或 Fab0更具体而言，术语“单链Fv”或“scFv”是指其中传统双链抗体的重链和轻链的可变域已结合到一起形成了一条链的抗体。通常，将连接肽插到两条链之间以使可变域稳定， 而不干扰活性结合部位的正确折叠和形成。本发明所用的单链抗CAPl抗体可以作为单体来进行结合。其他示例性单链抗体可以形成双链抗体、三链抗体和四链抗体。应认识到的是，本发明的组合物和方法所用的抗-CAPl抗体可以是人源化抗体。如本文所用，术语“人源化”指的是非人(例如，鼠)抗体形式，其为特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其他抗原结合亚序列)，并且含有最小限度的源自非人免疫球蛋白的序列。对大部分而言，人源化抗体是其中来自受体的超变区的残基被具有所需特异性、亲和力和结合力(capacity)的来自诸如小鼠、大鼠或兔等非人物种(供体抗体)超变区的残基替换了的人免疫球蛋白。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体和供体抗体中都未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步精炼和优化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上会包含至少一个、通常两个可变区域中的全部，其中， 全部或基本上全部的超变区对应于非人免疫球蛋白的超变区，并且全部或基本上全部的FR 区对应于人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还最好包含免疫球蛋白恒定区或恒定域(Fe)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区或恒定域(Fe)的至少一部分。如上文指出的且如下文实施例所示，抗-CAPl抗体引起抗炎细胞因子IL-10的表达明显增加。根据某些实施方式，Th2抗炎应答涉及抗炎细胞因子的表达增加。此类抗炎细胞因子可以是IL-10、IL-4、IL-6、IL-11、IL-13和IL-I受体拮抗剂中的任何一种。根据某些实施方式，Th2抗炎应答涉及IL-10表达的增加。更具体而言，这种增加可以是此类细胞因子的表达增加约10% 100%、10% 90%、10% 80%、10% 70%、10% 60%或10% 50%。特别而言，与适合的对照相比，尤其是与未经处理的受试对象或细胞相比，表达增加 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^； 100%。本发明对CAPl作为免疫调节的关键靶标的证明，提供了分离的且纯化的CAPl蛋白或其任何片段作为免疫调节剂的应用。因此，根据其他实施方式，本发明提供包含CAPl 或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物作为活性成分并由此调节受试对象中的Thl/ Th2平衡的组合物。术语“分离的”或“基本纯化的”在应用于核酸或蛋白(例如CAPl分子)时表示该核酸或蛋白基本不含在自然状态下与其关联的其他细胞组分。其优选为同质态，但也可以在速干剂(dry solution)或水性溶液中。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来确定纯度和同质性。作为制品中存在的最占优势的物种(species) 的蛋白是基本纯化的。应注意的是，可以将本发明的组合物所用的分离的且纯化的CAPl分子或其任何片段以下述物质中的任何一种的形式提供纯化的重组蛋白，和表达CAPl分子的转化宿主细胞的细胞裂解物或膜制品。本文所用的术语片段和功能性片段意为CAPl分子或其任何片段、变体、同源物或衍生物，其具有任何插入、缺失、替换和修饰，并且能够诱导对Thl/ Th2细胞平衡的特定调节(下文称其为“片段”)，所述调节由Th2抗炎细胞因子(例如 IL-10)或备选地由Thl促炎细胞因子的激活反映。应认识到的是，根据本文在以下说明书和权利要求部分中所用的某些实施方式，CAPl蛋白是指具有的氨基酸序列为人CAPl或其任何片段、变体、同源物或衍生物的蛋白。人CAPl蛋白的实例是包含由GeneBank登记号 ΝΡ_001099000. 1表示的、由图30显示的且表示为SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白，且该蛋白由GeneBank登记号CAG33690. 1所示的人CAPl基因编码。关于氨基酸序列，例如对CAPl蛋白特别是人CAPl的氨基酸序列，技术人员将意识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的单独的取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其会在编码序列中改变、添加或删除单个氨基酸或一小部分氨基酸，其中改变引起氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供在功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是公知的。此类经保守性修饰的变体在本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因之外且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。例如，可以进行其中将脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)取代为该组另一成员的取代，或进行例如用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。以下8组中的每一组都含有彼此为保守性取代物的其他示例性氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)。
术语“衍生物”用来定义在本发明中使用的多肽(例如，指定的序列)的氨基酸序列变体和共价修饰物。本发明所用的CAPl多肽(例如，指定的CAPl序列)的功能性衍生物，与上文在结构上定义的CAPl多肽(例如，指定的序列)的氨基酸序列、更具体而言与 SEQ ID NO :6所表示的CAPl氨基酸序列具有优选为至少约65%、更优选为至少约75%、进一步优选为至少约85%、最优选为至少约95%的总体序列同源性。本文将相对于天然CAPl多肽及其功能性衍生物的“同源性”定义为，在对序列进行比对并视需要引入空位以获得最大百分比同源性后，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分，候选序列中的与对应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。不应将N端延伸或C端延伸或者插入或缺失解读为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是公知的。应认识到的是，本文所用的术语“插入”或“缺失”分别指对本发明所用的CAPl分子进行氨基酸残基的任何添加或缺失，所述氨基酸残基为1 50个氨基酸残基、1 20个氨基酸残基且特别地为1 10个氨基酸残基。更特别而言，插入或缺失可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸中的任一种。就两个或更多个核酸序列或多肽序列而言，术语“同一”、“实质上同一”、“实质上同源”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或亚序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上具有约60%的同一性，优选为65^^70^^75%, 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。“氨基酸”是指所有天然存在的L-氨基酸，例如并包括D-氨基酸。通过公知的单字母或三字母命名来确定氨基酸。本发明还提供用于调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡的治疗组合物，所述组合物用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作，所述组合物包含免疫调节有效量的下述物质中的至少一种或其任意组合作为活性成分与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl) 相互作用的化合物，以及CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和片段；所述组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。因此，根据一个实施方式，本发明提供用于治疗免疫相关病症的治疗组合物。本发明的组合物包含与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl的化合物作为活性成分。此类化合物的非限制性实例是抗-CAPl抗体。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物包含CAPl或其任何片段、衍生物和变体作为活性成分。因此，还提供本发明的组合物在治疗有需要的受试对象中的免疫相关病症中的应用。如本文所用，术语“病症”或“病况”是指其中正常机能出现紊乱的病况。“疾病” 是对患病的人或与此人接触的人引起不适、机能障碍或痛苦的身体或精神上的任何异常病况。某些时候该术语被宽泛地用来包括损伤、失能、综合征、症状、异常行为和结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下可能将这些词语考虑为明显不同的类别。应注意的是，术语 “疾病”、“病症”、“病况”和“病”在本文中可等价使用。术语“免疫相关病症”是指Thl_Th2应答的失衡。因此，与CAPl相互作用并调节抗炎细胞因子的表达的化合物可以使此类细胞因子(例如IL-10)的表达增加。此类化合物可用于需要将Thl/Th2平衡向抗炎应答方向调节的病况。例如，用于治疗诸如自身免疫疾病(例如关节炎、多发性硬化(MS)、I型糖尿病、 狼疮、格雷夫斯病和甲状腺炎、IBD)、移植排斥病理学和移植物抗宿主病等免疫相关病症、 以及超抗原诱导的病症(例如中毒性休克、脓毒性休克和严重脓毒症。根据某些实施方式，本发明所用的CAP-I结合化合物，尤其是抗-CAPl抗体，可以通过增强Th2抗炎应答，而用于治疗或改善可获益于免疫抑制和/或炎症抑制的任何疾病、 病况或病症中的炎性症状，例如但不限于治疗或改善关节、肌与骨骼(musculoskeletal) 和结缔组织病症的自身免疫及炎性症状，或与超敏性、过敏反应、哮喘、动脉粥样硬化、神经炎性疾病和神经退行性疾病、炎性肠病、耳炎及其他耳鼻喉科病症、皮炎及其他皮肤病、后葡萄膜炎及前葡萄膜炎、结膜炎、视神经炎、巩膜炎以及其他免疫和/或炎性眼科疾病有关的自身免疫和炎性病症。更具体而言，通常，使用结合CAPl的免疫调节化合物的本发明的组合物和方法可以用于治疗任何自身免疫疾病，例如但不限于肌无力综合征(Eaton-Lambert syndrome), 古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏(Guillain-Bar)r综合征、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、肝炎、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮 (SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力、丛病症(例如，急性臂神经炎)、多腺性缺乏综合征、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、硬皮病、血小板减少、甲状腺炎(例如桥本氏 (Hashimoto)病)、舍格伦氏(Sjogren)综合征、过敏性紫癜、银屑病、混合性结缔组织病、多肌炎、皮肌炎、血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、韦格内氏(Wegener)肉芽肿病、莱特尔(Reiter)氏综合征、白塞氏(Behget)氏综合征、强直性脊椎炎、天疱疮、大疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。作为选择，结合CAPl的免疫调节化合物可以引起抗炎细胞因子表达的减少。这会使Thl/Th2平衡向Thl促炎反应方向偏移。将免疫反应向促炎反应方向调节的化合物可以用于治疗免疫相关病症，例如增生性病理病况。因此，本发明还提供用于治疗任何免疫相关疾病的组合物和方法。更具体而言，此类增生性病况可以是恶性病症。根据特定实施方式，恶性增生性病症可以是选自由癌、肉瘤、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤组成的组的实体瘤和非实体瘤中的任何一种。更特别而言，恶性病症可以是黑色素瘤、肝细胞癌、结肠癌、骨髓瘤、急性或慢性白血病。当本文中用来描述本发明时，术语“恶性增生性病症”、“癌症”、“肿瘤”和“恶性瘤” 都等价地叙述组织或器官的增生。如果该组织是淋巴系统或免疫系统的一部分，恶性细胞可以包括循环细胞的非实体瘤。其他组织或器官的恶性瘤可以产生实体瘤。通常，本发明的组合物和方法可以用于治疗非实体瘤和实体瘤，例如癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。除非另有说明，本文所用的术语“治疗”是指逆转、减轻、抑制该术语所应用的病症或病况的进程或所述病症或病况的一种或多种症状，或者预防所述病症或病况或所述病症或病况的一种或多种症状。除非另有说明，本文所用的术语“治疗”是指上文刚刚定义的“治疗”的行为。应注意的是，本发明的药物组合物可以包含游离形式的活性化合物，并且可以直接施用至待治疗的受试对象。作为选择，根据活性分子的大小，可能需要在施用前将其与载剂联合。可以以任何常规的剂型的形式来施用治疗制剂。制剂通常包含至少一种以上定义的活性成分，以及该活性成分的一种或多种可接受的载剂。从与其他成分相容且对患者无害的意义上讲，每种载剂应当既是药学上可接受的又是生理学上可接受的。制剂包括适合于口服施用、直肠施用、鼻部施用或肠胃外施用(包括皮下施用、肌肉内施用、腹膜内(IP)施用、静脉内(IV)施用和皮内施用)的那些制剂。适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液，和用于即席制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在任何情况下，所述形式必须为无菌的，且必须是达到存在容易的可注射性的程度的流体。其在制造和储藏条件下必须稳定，且必须对其进行免受诸如细菌和真菌等微生物的污染作用的保藏。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸和硫汞撒(thimerosal)等)可以实现对微生物作用的预防。在很多情况下，优选包含等渗试剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用推迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长对可注射组合物的吸收。本发明的药物组合物通常包含缓冲剂，即调整其摩尔渗透压浓度的试剂，并且可选地包含一种或多种本领域中已知的药学上可接受的载剂、赋形剂和/或添加剂。还可以将辅助性(supplementary)活性成分引入该组合物中。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用包被物(例如卵磷脂)、通过在分散情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。如本文所用，“药学上可接受的载剂，，包括任何及所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂及抗真菌剂等。将此类介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是公知的。作为任何常规介质或试剂，除了其与活性成分不相容的情况之外，都将其在治疗组合物中的应用考虑在内。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、油膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载剂，水性基质、粉末基质或油性基质和增稠剂等，可以是必要的或需要的。用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小袋或者片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。可以按照制药工业中公知的常规技术来制备本发明的药物组合物，所述药物组合物可以方便地以单位剂型存在。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载剂或赋形剂联合的步骤。通常，制剂通过以下步骤制备使活性成分与液体载剂和/或细微分割的固体载剂均勻紧密地结合，并且如果需要，使产品成形。可以将本发明的组合物配制成多种可能的剂型中的任一种，例如但不限于，片剂、 胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。还可以将本发明的组合物配制为在水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加该悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。该悬浮液还可以含有稳定剂。本发明的药物组合物还包括但不限于含乳剂和脂质体的制剂。所有此类化合物的性质、可利用性和来源，以及其施用，包括对在受试对象体内产生所需效果而言必须的有效量，是本领域中公知的，不需要在此进一步描述。药物组
18合物的制备对本领域技术人员而言是公知的，且已描述于许多文章和教材中，参见例如 〈〈Remington' s Pharmaceutical Sciences)), Gennaro A. R.编，Mack Publishing Co., Easton，PA，1990，特别是其中的第1521 1712页。包含本发明所用的结合CAPl的化合物(例如，抗-CAPl抗体)或CAPl蛋白或其任何片段的药物组合物可用于肠胃外施用，即，腹膜内(i.P.)、皮下(S. C.)、肌肉内(i.m.) 和静脉内(i.v.)。用于肠胃外施用的组合物通常包含溶解于可接受的载剂(优选水性载剂)中的抗体或其混合物(cocktail)的溶液。可以使用各种水性载剂，例如水、缓冲水 (buffered water)、0. 4%的盐水、0. 3%的甘氨酸等。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。该组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的助剂，例如PH调节剂及缓冲齐U、毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠。CAPl结合化合物(例如抗-CAPl抗体)在这些制剂中的浓度可以大幅度变化，即，从小于约0. 01重量％、通常至少约0. 1重量％至多达5重量％，并且在所选的特定施用模式中将主要基于流体体积和根据粘度来选择。更具体而言，包含CAPl结合化合物(例如，本发明所用的抗-CAPl抗体)或者 CAPl分子或其任何片段的可注射组合物可以在水、盐水、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水等中制备，并可以可选地与无毒的表面活性剂混合。在普通的储藏和使用条件下，这些制品可以含有防腐剂来预防微生物的生长。适合于注射或输注的药物剂型包括含有活性成分的无菌水性溶液或分散液或者无菌粉末，所述粉末适合于即席制备无菌的可注射或可输注的溶液或分散液。优选的是，最终剂型是无菌流体，并且在制造和储藏条件下稳定。该溶液、悬浮液或分散液的液体载剂或载体可以是溶剂或液体分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。通过下述方式可以保持溶液、悬浮液或分散液的适当流动性例如，通过形成脂质体，在分散液的情况下通过保持所需的粒径，或通过使用无毒的表面活性剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基本甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸和硫汞撒等)可以实现对微生物作用的预防。可以包含等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。通过在组合物中包括推迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶，可以延长对可注射组合物的吸收。可以添加溶解度增强剂。可以通过下述方式来制备无菌的可注射组合物将CAPl结合化合物(例如， 抗-CAPl抗体)或作为选择，将CAPl分子及其任何片段按所需的量与各种其他成分(例如， 上文所列举的)一起引入到合适的溶剂中，随后通过例如过滤灭菌来进行所需的灭菌。对于用来制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥和冷冻-干燥技术， 该方法产生存在于之前经无菌过滤的溶液中的活性成分加上任何其他所需成分的粉末。可以采用任何适合的灭菌方法，例如过滤灭菌(如，0. 22微米过滤器或纳米过滤)、Y射线或电子束灭菌。在各种实施方式中，将最终溶液调节至具有的pH为约4 约9、约5 约7、约 5. 5 约6. 5或约6。可以用药理学上可接受的酸、碱或缓冲剂来调节组合物的pH。此外，本发明的组合物可以以每剂量含有预定量的各活性成分的单位剂型存在。 此类单位可适于提供0. OOlmg/kg 100mg/kg体重的CAPl结合化合物，例如本发明所用的抗-CAPl 抗体。具体而言，可以是 0. 01mg/Kg 50mg/Kg、0. lmg/Kg 10mg/Kg、0. 5mg/Kg 10mg/Kg、lmg/Kg 10mg/Kg、5mg/Kg 15mg/Kg、10mg/Kg 30mg/Kg、25mg/Kg 50mg/Kg、 40mg/Kg 80mg/Kg或60mg/Kg 100mg/Kg。这些剂量可以以单剂量形式或若干个不连续剂量形式提供。当然，最终剂量将取决于治疗中的病况、施用途径以及患者的年龄、重量和状况，并且将由医生决定。如上指出，除了肠胃外途径外，本发明的组合物可以适于通过任何其他适当途径而施用，例如通过口服(包括颊部和舌下)、直肠、经鼻、局部(包括颊部、舌下或透皮)或阴道途径。可以通过制药领域中的任何已知方法来制备此类制剂，例如通过使活性成分与一种或多种载剂或赋形剂联合。适于口服施用的药物制剂可以呈现为离散的单位，例如胶囊或片剂，粉末或颗粒，在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液，可食用泡沫(edible foam)或生奶油 (whips)，或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。适于透皮施用的药物制剂可以呈现为离散的贴剂形式，该贴片意在使与接受者的表皮保持长期的紧密接触。可以将适于局部施用的药物制剂配制成油膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油剂。对于向眼或其他外部组织(例如口和皮肤)的使用而言，制剂优选以局部油膏或乳膏的形式使用。当配制成油膏形式时，可以将活性成分与石蜡或水可混溶的油膏基质一起使用。作为选择，可以将活性成分与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制到乳膏中。适于局部施用至眼部的药物制剂包括滴眼剂，其中将活性成分溶解或悬浮在适合的载剂尤其是水性溶剂中。适于口中局部施用的药物制剂包括锭剂、软锭剂和漱口剂。适于直肠施用的药物制剂可以呈现为栓剂或灌肠剂。适于经鼻施用的、其中载剂为固体的药物制剂包括粒径为例如20微米 500微米的粗粉末，该粗粉末是以服用鼻吸剂的方式施用，即通过鼻道从拿到鼻下近距离处的含有该粉末的容器中快速吸入的方式。作为鼻喷雾剂或滴鼻剂施用的、其中载剂为液体的适合制剂包括活性成分的水性或油性溶液。适于通过吸入施用的药物制剂包括细颗粒粉尘或薄雾，所述细颗粒粉尘或薄雾可以通过使用各种类型的计量给药加压气溶胶、雾化器或吹入器来产生。适于阴道施用的药物制剂可以呈现为阴道栓、止血塞(tampon)、乳膏、凝胶、糊剂、 泡沫剂或喷雾制剂。优选的单位剂量制剂是含有上文所述的每日剂量或亚剂量(sub-dose)或者其适合比例的活性成分的那些。应理解的是，除了以上特别提到的成分以外，所述制剂还可以包含与所讨论的制剂类型有关的本领域中常规的其他试剂，例如，适合于口服施用的那些制剂可以包含调味剂。还应注意的是，可以施用本发明的组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，对已经患有免疫相关病症(例如，关节炎、IBD和糖尿病)的患者施用足以治愈或至少部分遏制病况及其并发症的量的组合物。将足以实现此的量定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的量将取决于病况的严重程度和患者自身免疫系统的整体状态，但通常为约0. OOlmg/kg 约100mg/kg的CAPl结合蛋白，特别是抗-CAPl抗体，而0. 01mg/kg 50mg/kg体重和0. lmg/kg 10mg/kg体重的剂量则更为常用。用治疗医师所选择的剂量水平和模式，可以依计划在每日、每周或每月进行单次或多次施用。在预防性应用中，对有发展疾病状况的危险的患者施用含有抗-CAPl抗体的组合物以增强该患者的抵抗力。将这种量定义为“预防有效剂量”。在此应用中，精确的量同样取决于患者的健康状况和免疫力的整体水平，但通常为0. OOlmg/剂量 IOOmg/剂量，特别是0. Olmg/剂量 IOmg/剂量、0. Img/剂量 IOmg/剂量或Img/剂量 IOmg/剂量，或者作为选择，每kg体重。根据患者所需要且能忍受的剂量来进行组合物的单次或多次施用。在任何情况下，组合物应提供充足量的CAPl结合化合物，特别是本发明所用的抗-CAPl抗体，从而有效地治疗患者。优选的是，施用该剂量一次，但可以对其进行周期性的使用直至实现治疗结果或副作用使治疗有必要中断。通常，该剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征且不对患者产生不可接受的毒性。可以将本发明组合物的受控释放肠胃外制剂制成植入物、油性注射物或微粒系统。微粒系统包括微球体、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球体和纳米颗粒。微胶囊包含治疗组合物作为中心核。在微球体中，治疗物质分散在整个颗粒中。通常将小于约Iym 的颗粒、微球体和微胶囊分别称作纳米颗粒、纳米球体和纳米胶囊。毛细血管的直径为约 5 μ m,因此仅对纳米颗粒进行静脉内施用。微颗粒的直径通常为约100 μ m,并且对其进行皮下施用或肌肉内施用。根据第二方面，本发明提供用于治疗、预防、改善或推迟有需要的受试对象中的免疫相关病症的发作的方法。本发明的方法包括对受试对象施用治疗有效量的下述(a)和/ 或(b)中的至少一种或者其任意组合或包含其的任意组合物的步骤(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。在一个特定实施方式中，本发明的方法包括下述步骤对受试对象施用治疗有效量的与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl的化合物或包含该化合物的任何组合物，从而调节所治疗的受试对象中的Thl/Th2平衡。根据某些实施方式，此类CAPl结合化合物可以是蛋白类、核酸类、碳水化合物类、 脂类、天然有机类、合成源有机类、无机类和肽模拟物类化合物。在一个特定实施方式中，与 CAPl特异性地结合并相互作用的该化合物可以是蛋白类分子，尤其是免疫球蛋白样分子。 更具体而言，本发明的方法和组合物所用的CAPl结合化合物可以是抗体。此类抗体的具体实例是直接或间接地与CAPl特异性地相互作用的抗-CAPl抗体和抗-肽-6抗体，这些抗体使IL-10表达增强。下文实施例11公开了抗-CAPl抗体在诱导IL-10表达中的应用。还应认识到的是，根据某些实施方式，本发明所用的CAPl结合化合物包括任何抗 CAPl抗体或任何识别并结合CAPl的抗体，条件是所述抗体不是本发明或本发明人之前的出版物和申请中所述的多克隆、单克隆、嵌合或人源化的抗-肽-6抗体中的任何一种或任何其他针对或识别肽-6 (SEQ ID NO. 1)的抗体。更具体而言，在一些实施方式中，本发明的方法包括下述步骤对受试对象施用特异性地识别并结合CAPl的化合物，从而将受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节。应注意的是，本发明的方法所用的抗-CAPl抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、 嵌合抗体或人源化抗体中的任何一种。针对蛋白的多克隆抗体的产生在例如Wiley and Sons Inc 的((Current Protocols in Immunology))的第二章中有所描述。通过在有利于杂交细胞生长的条件下与永生化B细胞融合，可以从取自经免疫动物特别是大鼠和小鼠的脾和淋巴结的B细胞制备单克隆抗体。产生单克隆抗体的技术描述于很多文章和教材中，例如在上述《Current Protocols in Immunology》的第二章中。术语“抗体”意在包括能够结合抗原的完整分子及其片段，例如Fab和 F(ab' )2(ffahl 等，J. Nucl. Med. 24 :316-325 (1983))。应认识到的是，根据本文所公开的用于完整抗体分子的方法，可以使用用于本发明的Fab和F(ab' )2及其他抗体片段。此类片段通常是通过使用诸如木瓜蛋白酶(用来产生Fab片段)或胃蛋白酶(用来产生F(ab' )2片段)等酶进行蛋白水解切割来产生。在另一个替代性实施方式中，本发明的方法包括下述步骤对受试对象施用治疗有效量的CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物或者包含上述物质的任何组合物，从而调节受试对象中的Thl/Th2平衡。应认识到的是，本文所用的CAPl是指人CAPl蛋白，该蛋白包含由图30显示的 GenBank登记号NP_001099000. 1所表示的、且另外表示为SEQ ID NO 6的氨基酸序列，所述氨基酸序列由GenBank登记号CAG33690. 1所表示的人CAPl基因编码。本发明的组合物和方法来治疗的“患者”或“有需要的受试对象”是指可能患有上述病况并需要本文所述的治疗方法的任何哺乳动物，包括人、牛、马、犬、鼠和猫受试对象。 所述患者优选是人。对患者施用本发明的组合物包括自己施用或由他人对患者施用。根据另一个特定实施方式，可以通过任何施用模式来施用本发明所用的活性成分或包含该活性成分的组合物。例如，口服施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、腹膜内施用、肠胃外施用、透皮施用、阴道内施用、鼻内施用、粘膜施用、舌下施用、局部施用、直肠施用或皮下施用或其任意组合。术语“治疗有效量”意在表示药物或药剂的量，所述量会引起研究者、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的组织、系统、动物或人的生物学应答或医学应答。根据某些实施方式，治疗有效量可以是0. OOlmg/kg 100mg/kg。特定实施方式包含0. 001mg/kg 100mg/kg体重的CAPl结合化合物，例如本发明所用的抗-CAPl抗体。 具体而言，可以是 0. 01mg/Kg 10mg/Kg、0. lmg/Kg 10mg/Kg、0. 5mg/Kg 10mg/Kg、lmg/ Kg 10mg/Kg、5mg/Kg 15mg/Kg、lOmg/Kg 30mg/Kg、25mg/Kg 50mg/Kg、40mg/Kg 80mg/Kg 或 60mg/Kg 100mg/Kgo此外，在某些实施方式中，通过本发明的方法每天施用的任何CAPl结合化合物或CAPl分子的治疗有效量可以是约0. 001mg/kg体重 约10mg/kg体重，具体而言，约 0. OlOmg/kg 8mg/kg,或 0. 020mg/kg 6mg/kg、0. 030mg/kg 5mg/kg。根据特定实施方式，有效量可以是 0. 01mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、 70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg 禾口 500mg 中的任一个，并且可选地为每日剂量。具体而言，有效量可以是约每日O.Olmg lOOOmg、每日 IOmg 500mg，更具体而言，每日 0. 01mg、0. lmg、lmg、10mg、50mg、lOOmg、150mg、200mg、 250mg、300mg、350mg、400mg、450mg和500mg中的任一个。应认识到的是，该有效量是特别针对小鼠的。此外应意识到的是，根据Guidance for Industry,Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers，通常可以通过将小鼠剂量(mg/kg)除以约12来得到各自的人等效剂量(HED) (mg/kg)，并再除以10(从小鼠向人的推断中的安全系数)，从而计算出“人剂量”。优选的是将CAPl结合化合物或者作为选择的CAPl分子的有效量包含在单位剂型中。此外，本发明的组合物的施用可以是周期性的，例如，每日两次、每日三次或至少每日一次并持续至少约3天 3个月的周期性施用可以是有效的。对本领域技术人员而言，更低剂量的优势是明显的。这些优势尤其包括更低的副作用风险，特别是在长期使用后，并包括更低的患者对治疗产生减敏的风险。根据另一实施方式，本发明的方法所用的单位剂型可以用于单次施用或用于重复施用。根据另一实施方式，在治疗上足够长的时间内，每1 5小时、每10小时或每M小时重复施用所述单位剂型。根据替代性实施方式，单位剂型可以是持续释放型单位剂型，其在施用后的相当长的时间内提供持续的PH依赖性药物释放。应注意的是，使用每日约0. OOlmg 约lOOOrng、每日约0. Olmg 约500mg、每日约 0. Img 约500mg、每日约Img 约500mg或每日约IOmg 约500mg的本发明所用的CAPl 结合化合物的剂量，和/或进行至少1天至终身治疗，可以实现对其他不良适应症的治疗， 在另一个实施方式中，进行至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、 30天、60天、90天的治疗并继续直至终身治疗，可以实现使用本发明的CAP-I结合化合物的治疗。应注意的是，对不同病况的治疗可以表示不同剂量或不同时期的使用；这对医学从业技术人员而言是显而易见的。如上指出的，本发明提供特别适合用于治疗免疫相关病症(例如，自身免疫性病症或炎性病症)的方法和药物组合物。以下实施例清楚地证明了本发明的组合物和方法在治疗已确立的炎性关节炎中的适用性。更具体而言，经AA诱导处理并伴随使用本发明的抗-肽-6人源化抗体(已显示其与CAPl相互作用)处理的Lewis大鼠显示出关节炎的显著下降。如IL-10表达的增强所证明的，与CAPl相互作用的其他化合物(例如抗-CAPl抗体)显示出对抗炎应答的明显诱导。因此，可以将这些化合物用作治疗免疫相关病症的免疫调节剂。应注意的是，如 Berent，J.等(Berent, J.等，Springer Semin. Immunopatho 1. 25 7-63(2003))所指出的，佐剂性关节炎(AA)是类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎 (JIA)和脓毒性关节炎的已良好确立的动物模型。存在不同形式的关节炎，通常可以将其分组为两个主要的类别炎性关节炎和退行性关节炎，每一类都具有不同的起因。因此，根据一个特定实施方式，可以具体地将本发明的方法和药物组合物设计用于治疗和/或改善炎性病症，例如，炎性关节炎。炎性关节炎的特征为滑膜炎、骨质侵蚀、骨质减少、软组织肿胀和均一的关节间隙变窄。更具体而言，关节炎症的特点是滑膜炎和骨质侵蚀。后者将在初期表现为白色薄软骨下骨板的局灶性中断(focal discontinuity)。通常，甚至在严重骨质减少的情况下也能够看到该软骨下骨板，而该骨板的中断则表明存在侵蚀。虽然在真正的骨质侵蚀前确实可以出现关节周骨质减少和局灶性软骨下骨质减少，但表明确定的关节炎症的是骨质侵蚀的存在。随着骨质侵蚀的扩大，骨破坏延伸到骨髓腔内的骨小梁中。炎性关节炎的一个重要特征涉及到边界性骨质侵蚀的概念。该术语是指位于发炎的滑液关节边界的骨质侵蚀。该特定部位是位于关节内但未被透明软骨覆盖的关节部分。因此，早期关节炎症将在位于关节表面下的软骨下骨板受到侵蚀前产生边界性侵蚀。在寻找骨质侵蚀时，关节的多个视图对表征各个骨表面而言是必不可少的。炎性关节进程的第二重要特征是均一的关节间隙变窄。其出现原因是对关节软骨的破坏在整个关节内空间中是均一的。对炎性关节疾病的第三个发现是软组织肿胀。应认识到的是，可以将炎性关节炎进一步划分为几个亚组，因此，可以将本文所述的本发明的组合物和方法应用于治疗不同子组的每种炎性关节炎病况。更具体而言，涉及单个关节表示存在脓毒性关节炎。脓毒性关节炎的起因通常与葡萄球菌或链球菌微生物所引起的血源性播散(hematogenous seeding)有关。脓毒性关节的放射照相特征涵盖了任何炎性关节炎的那些特征，即关节周骨质减少、均一的关节间隙变窄、软组织肿胀和骨质侵蚀。并不是所有的发现都会同时存在，而且精确地讲，骨质侵蚀可能不明显。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善炎脓毒性关节炎。相比之下，系统性关节炎的特征是涉及多个关节，并且包括两个主要类别类风湿性关节炎和血清阴性脊柱关节病。根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善类风湿性关节炎。类风湿性关节炎(RA)是慢性的系统性自身免疫病症，最常见的是，其引起关节(关节炎)和腱鞘内的炎症和组织损伤以及贫血。其还可以在肺、心包、胸膜和眼巩膜中产生弥漫性炎症，而且还会引起最常见于皮肤下的皮下组织中结节损伤(nodular lesion)。其可以是能够导致机能和行动能力大幅度丧失的令人失去能力和疼痛的病况。诸如类风湿因子和针对环瓜氨酸肽抗体等血清标记物是类风湿性关节炎的重要指示剂。类风湿性关节炎的放射照相特征是关节炎症的那些特征，且包括特别的骨质减少、均一的关节间隙减小、骨质侵蚀和软组织肿胀。由于炎症的慢性特点，诸如关节半脱位和软骨下囊肿等其他发现也可能是明显的。血清阴性脊柱关节病类包括银屑病关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎，其特征是炎性征兆、涉及多关节和涉及带有骨增殖的附加特征的手足远端。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善血清阴性脊柱关节病类的任何病况。更具体而言，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善炎银屑病关节炎。银屑病关节炎是以皮肤炎症(银屑病)和关节炎症(关节炎)为特征的慢性疾病。在美国接近306，000人患有银屑病关节炎，而且在欧洲的前5大市场另有 308，000人据信患有此疾病。银屑病和关节炎经常独立显现。事实上，在几乎80%的患者中该皮肤疾病要早于关节炎。在最多15%的患者中，关节炎可以早于银屑病。银屑病是银屑病关节炎的特点之一，是一种普通的皮肤病况，其特征为斑驳的、凸
24起的带有剥落的皮肤炎症红色区域。银屑病经常影响生殖器或肛门周围的区域、肘和膝的末端、头皮和脐。约10%的银屑病患者还发展有其关节的相关炎症。通常，皮肤症状越严重，人就越可能发展银屑病关节炎。银屑病关节炎的起因是未知的，其可能具有遗传、环境和免疫起因的组合。男性和女性患银屑病的可能性相等。对于银屑病关节炎，男性更可能具有脊椎炎形式(其中脊柱受到了影响)，而女性更可能具有风湿病形式(其中可能累及许多关节)。 银屑病关节炎通常在35 55岁的人中发展。然而，其可以在几乎任何年龄的人中发展。银屑病关节炎与若干其他关节炎病况有许多共同特征，例如强直性脊柱炎、反应性关节炎、克罗恩氏病相关的关节炎和溃疡性结肠炎。所有这些病况能够在脊柱和关节中、眼、皮肤、口和各种器官中引起炎症。根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善强直性脊柱炎。强直性脊柱炎(AS，旧称别赫捷列夫氏(Bechterew)病、别赫捷列夫氏综合征、 Marie StrUmpell病，是脊椎关节炎的一种形式)通常是关节炎的慢性和进行性形式，是由以脊柱基部的脊柱小平面关节和骶髂关节为代表的多个关节的炎症引起的。当强直性脊柱炎趋于影响这些关节和脊柱周围的软组织时，其他关节以及关节周围的组织也可能受到影响(肌腱末端病，其中腱和韧带附着到骨上)。强直性脊柱炎还可能涉及关节以外的身体区域，例如眼、心脏和肺。该病症经常导致骨性关节强硬(或融合)，因此术语强直性是指关节的僵硬，该术语源自希腊文单词ankylos。Spondylos意为椎骨(或脊柱)，述及一个或多个椎骨的炎症。该疾病据估计影响约0. 0. 2%的一般群体。强直性脊柱炎主要影响年轻男性。男性患强直性脊柱炎的可能性是女性的4 10倍。多数具有该疾病的人在15 35 岁时发展该疾病，平均在26岁时发作。虽然确切起因未知，但据信强直性脊柱炎是由遗传影响和触发性环境因子的组合引起的。与一般群体中的相比，患有强直性脊柱炎的患者中有约90% 95%具有组织抗原人白细胞抗原B27(HLA-B27)。患有强直性脊柱炎的人经常具有该疾病的家族史。在又一个实施方式中，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善反应性关节炎(ReA)。反应性关节炎是血清阴性脊柱关节病的另一类型，是在对身体中另一部分的感染作出应答时发展的自身免疫性病况。与细菌接触并形成感染可以触发反应性关节炎。 其具有与总称为“关节炎”的各种其他病况(例如风湿病)类似的症状。其由另一感染引起，因此是“反应性”的，即，依赖于另一病况。在慢性病例中，该“触发”感染经常得到了治愈或缓解，因此难以确定最初起因。反应性关节炎的症状常常包括三种表面上无关联的症状的组合，即大关节的炎性关节炎、眼部炎症(结膜炎和葡萄膜炎)和尿道炎。应指出的是，ReA还称作赖特氏综合征(以德国医师Hans Reiter命名)，还称作尿道性关节炎、性病性关节炎和肠多动脉炎 (polyarteritis enterica)0应认识到的是，存在很多其他形式的炎性关节炎，包括幼年特发性关节炎、痛风和假性痛风，以及与结肠炎或银屑病相关的关节炎。因此应认识到的是，还可以将本发明的组合物和方法用于这些病况。因此，根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善幼年特发性关节炎(JIA)。JIA是儿童中持续性关节炎(persistent arthritis)的最常见形式(在此背景下，幼年是指16岁前的发作，特发性是指无确定起因的病况，关节炎是指关节的滑膜的炎症)。JIA是见于儿童时期的关节炎的亚类，其可以是短暂且自限的或者是慢性的。其显著区别于成人中常见的关节炎(类风湿性关节炎)和可以存在于儿童时期的作为慢性病况的其他类型的关节炎(例如，银屑病关节炎和强直性脊柱炎)。根据另一个实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善痛风。 痛风(代谢性关节炎)是由尿酸的积累产生的疾病。在此病况中，尿酸单钠或尿酸的晶体沉积在关节的关节软骨、腱和周围组织上。这些晶体引起严重炎症和严重疼痛。如果不进行治疗，这些晶体会形成能够引起明显的组织损伤的痛风石(tophi)。假性通风是由钙晶体引起的病况。当钙晶体在腱中引起炎症发作时，称其为“钙化性肌腱炎”。本发明还提供用于治疗此病症的组合物和方法。通常，如以上同样公开的，存在很多类型的关节炎，应注意的是，还可以将本发明的组合物、方法、联用的组合物和试剂盒用于治疗除所示关节炎的所有原发性形式之外的关节炎的所有继发性形式。这些病况可以包括红斑狼疮、亨-舍(Henoch-MhGnlein)紫癜、 银屑病关节炎、反应性关节炎、血色病、肝炎、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病(及很多其他血管炎综合征)、莱姆病、家族性地中海热、带有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关的周期性综合征和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)。根据特定实施方式，关节炎的治疗、预防或改进可以反映在临床评分和组织病理学评分的改进上。更具体而言，应认识到的是，用本发明的组合物和方法进行的治疗可以使关节炎的临床评分和组织病理学评分的至少之一降低至少5% 95%、5% 90%、5% 85%、5% 80%、5% 75%、5% 70%、5% 65%、5% 60%、5% 55%、5% 50%、 5% 45%、5% 40%、5% 35%、5% 30%、5% 25%、5% 20%、5% 15% 或约 5% 10%。更具体而言，与治疗前的临床评分相比，上述降低可以是至少5%、至少10%、 至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至是至少55%或 60%。应认识到的是，可以将本发明的方法和组合物用于治疗任何免疫相关病症。因此，在另一个特定实施方式中，可以将本发明的药物组合物和方法用于治疗和改善炎性肠病(IBD)，例如结肠炎和克罗恩氏病。根据特定实施方式，结肠炎或克罗恩氏病的治疗、预防或改进可以反映在临床评分和组织病理学评分的改进上。例如，用本发明的 CAP-I结合化合物(其可以是抗-CAPl抗体)进行的治疗可以使IBD的临床评分和组织病理学评分的至少之一降低至少5% 95%、5% 90%、5% 85%、5% 80%、5% 75%、 5% 70%、5% 65%、5% 60%、5% 55%、5% 50%、5% 45%、5% 40%、5% ；35%、5% 30%、5% 25%、5% 20%、5% 15%或约5% 10%。更具体而言，与治疗前的临床评分相比，上述降低可以是至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、 至少30%、至少40%、至少50%或者甚至是至少55%或60%。炎性肠病(IBD)是常见的胃肠病症，可以将其理解为免疫应答的Thl-促炎亚型、 Thl-促炎亚型和Th2-抗炎亚型之间失衡的结果。克罗恩氏病是引起消化道(亦称作胃肠(GI)道)炎症的持续性病症。克罗恩氏病能够影响GI道从口到肛门的任何区域，但最常见的是影响小肠的下部(称之为回肠)。肿胀延伸到受影响器官的内壁深处。肿胀可以引起疼痛，并且可以使肠频繁地清空，从而导致腹泻。如以上指出的，克罗恩氏病是炎性肠病，炎性肠病是引起肠肿胀的疾病的通用称。 由于克罗恩氏病的症状与诸如肠易激综合征和溃疡性结肠炎等其他肠病症相似，因此难以对其进行诊断。溃疡性结肠炎在大肠内壁的上层引起炎症和溃疡。在克罗恩氏病中，可能涉及肠的所有层，而在病变的肠切片之间可以发现正常的健康肠。还可以将克罗恩氏病称为回肠炎或肠炎。应注意的是，还可以将本发明的组合物用于治疗或预防结肠炎。溃疡性结肠炎 (U. C.)是结肠(大肠)和直肠的内壁的慢性(长期持续的)炎症。该内壁发炎且出现溃疡。该炎症可以限于直肠(直肠炎)或影响整个结肠和直肠。因此，与治疗前的临床评分相比，本发明的组合物可以使临床评分降低至少5%、 至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至降低至少55%或60%。根据另一个特定实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和/或改善自身免疫病症，例如糖尿病。糖尿病是以紊乱的代谢和不适当高的血糖(高血糖症)为特征的综合征，由在于低水平的激素胰岛素引起或在需要对胰岛素分泌水平不足进行补偿的情况下对胰岛素效果的异常抗性引起。特征性症状是过量的尿的产生(多尿)、过度口渴和流体摄取增加(烦渴)以及视觉模糊；如果血糖仅略微上升，这些症状就可能不存在。存在三种主要形式的糖尿病1型、II型和妊娠糖尿病(出现在怀孕过程中)。I 型糖尿病的特征是胰腺中胰岛的产生胰岛素的β细胞丧失，导致胰岛素缺乏。β细胞丧失的主要原因是T细胞介导的自身免疫攻击。没有可采用的已知预防措施来抵抗I型糖尿病。另一方面，在发作出现时，大多数患病的人是健康的且具有健康的体重。尤其在早期， 对胰岛素的敏感性和应答性通常是正常的。I型糖尿病可以影响儿童或成人，而由于其是影响儿童的主要糖尿病情况，传统上将其命名为“幼年型糖尿病”。对I型糖尿病的主要治疗，甚至从极早期开始，是更换胰岛素，并且用血液测试监视仪小心监视血糖水平。不使用无胰岛素，则可能发展糖尿病酮酸中毒，其可以导致昏迷或死亡。还强调了对生活方式的调整(饮食和锻炼)，虽然这些并不会使损失逆转。除了常见的皮下注射外，还可以通过泵来递送胰岛素，通过该方法，可以一天M小时以预设的水平持续输注胰岛素，并且能够在用餐时间按需定制胰岛素的剂量(大丸剂，bolus)。I型治疗必须无限期地继续下去。如果在测试和药物治疗中采取足够的注意、适当的照料和训练，治疗剂量并不损伤正常活性。在美国，患病率是人口的0. 12%，或接近340，000人。发病率是每年30，000例，占人口的 0. 01%。根据某些实施方式，可以将本发明的组合物和方法用于治疗和预防多发性硬化 (MS)。多发性硬化(缩写为MS，旧称播散性硬化或播散性脑脊髓炎)是影响中枢神经系统(CNQ的慢性、炎性、脱髓鞘性病。疾病发作通常出现在年轻成年人中，且更常见于女性， 根据国家或具体人群，患病率为每100，000人2 150例。
MS影响脑和脊髓的称为白质的区域中的神经元。这些细胞在完成处理的灰质区之间并且在这些区和身体其他部分之间携带信号。更具体而言，MS破坏少突细胞，少突细胞是负责产生并维持被称作髓鞘的脂肪层的细胞，髓鞘辅助神经元携带电信号。MS导致髓磷脂的变薄或完全丧失，并且在不太常见的情况下，导致神经元的突出部分或轴突部分的切断(横切)。当髓磷脂丧失时，神经元不再能够有效地传导其电信号。名称“多发性硬化” 是指白质中的疤痕(硬化，更多地称为斑或损伤)。这些损伤中的髓磷脂的丧失会引起一些症状，这些症状根据何种信号受到阻断而大不相同。然而，如今更先进的成像形式显示许多伤害发生在这些区域外。该疾病可伴随有几乎任何神经学症状。随着新症状以不连续的阵发(印isode)形式(复发形式)出现或随时间缓慢积累 (进行性形式)，MS有若干种形式。多数人首先被诊断出具有复发性-缓解性MS,但多年后发展了继发性-进行性MS(SPMS)。在阵发或发作之间，症状可能完全消失，但永久性的神经问题经常会持续，尤其是随着疾病的进展。虽然对该疾病过程中所涉及的机制知之甚多，但起因仍然难以捉摸。具有最多支持者的理论是，该疾病是由自身免疫反应引起的。该疾病不能治愈，但已证明若干疗法是有益的。治疗尝试在阵发后恢复功能、防止新的发作和防止能力丧失。如用任何治疗一样，药物治疗具有若干副作用，而且很多疗法仍在研究中。根据特定实施方式，MS疾病和症状的治疗、预防或改进可以反映在临床评分的改进上。例如，用本发明的CAP-I结合化合物(其可以是抗-CAPl抗体)进行的治疗可以使 MS的临床评分和组织病理学评分的至少之一降低至少5% 95%、5% 90%、5% 85%、 5% 80%、5% 75%、5% 70%、5% 65%、5% 60%、5% 55%、5% 50%、5% 45%、5% 40%、5% 35%、5% 30%、5% 25%、5% 20%、5% 15%或约 5% 10%。更具体而言，与治疗前的临床评分相比，上述降低可以是至少5%、至少10%、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或者甚至是至少55%或60%。应认识到的是，可以将本发明的方法和组合物应用于治疗本文之前公开的任何免疫相关病症。如以下实施例所公开的，本发明所用的、与CAPl分子显示出相互作用的两种不同的抗体，抗-CAPl抗体和抗-肽-6抗体，清楚地显示出抗炎效果。更具体而言，图观显示了使人PBMC暴露于抗-CAPl抗体、抗-肽-6人源化抗体及其F (ab) 2片段，引发了最终导致 IL-10基因表达上调的一系列事件。炎性部位中IL-10分泌的增加可以将局部细胞因子特征从炎性反应转变为抗炎应答，并因此可以解释抵抗这些抗体带来的炎症的保护机制。因此，可以将CAPl结合化合物，特别是本发明所用的抗体，用作免疫调节剂，从而将Thl/Th2细胞平衡向抗炎Th2应答方向调节。因此，本发明还提供用于增加IL-10 (白细胞介素-10)的表达和水平的组合物和方法。根据此方面，本发明的组合物和方法涉及有效量的与CAPl相互作用并结合其的至少一种化合物特别是分离且纯化的抗-CAPl抗体的应用。本发明的组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。根据一个实施方式，在表示“增加”或“增强”抗炎细胞因子尤其是IL-10的表达或水平时，其意思是，此类增加或增强可以是此类细胞因子的表达增加或提高了约10% 100 %、20 % 80 %、30 % 70 %或40 % 60 %。特别是指，与适当的对照相比，表达增加了 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。还应当注意的是，上述增加或提高还可以是增加了约2 100 倍。更具体而言，增加了约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 97倍或更多倍。此外，应认识到的是，所述IL-10细胞因子的水平或表达的增加可以是所述细胞因子的转录、翻译或稳定性上的增加。如以上所指出的，增强的IL-10表达可以将Thl/Th2平衡向着Th2抗炎应答方向调节。因此，本发明所用的CAPl结合化合物，尤其是抗-CAPl抗体，可用于需要将Thl/Th2 平衡向抗炎应答方向调节的病况。因此，根据一个实施方式，可以将本发明的组合物用于增加有需要的受试对象中的IL-10的表达和水平，从而将接受治疗的受试对象中的Thl/ Th2细胞平衡向抗炎Th2反应方向调节。根据一个特定实施方式，该受试对象是患有免疫相关病症的受试对象。例如，诸如自身免疫疾病(例如关节炎、IBD、I型糖尿病、多发性硬化 (MS)、狼疮、格雷夫斯病和甲状腺炎)、移植排斥病理学和移植物抗宿主病等免疫相关病症、 以及超抗原诱导的病症(例如中毒性休克、脓毒性休克和严重脓毒症)。还应当认识到的是，通常，本发明的组合物和方法可以用于治疗任何自身免疫疾病，例如但不限于肌无力综合征、古德帕斯丘氏综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、肝炎、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、 多发性硬化(MS)、重症肌无力、丛病症(例如，急性臂神经炎)、多腺性缺乏综合征、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、硬皮病、血小板增多、甲状腺炎(例如桥本氏病)、舍格伦氏综合征、过敏性紫癜、银屑病、混合性结缔组织病、多肌炎、皮肌炎、血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、韦格内氏肉芽肿病、莱特尔氏综合征、白塞氏综合征、强直性脊柱炎、天疱疮、大疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。另一方面，本发明涉及治疗有效量的下述(a)和/或(b)中的至少一种或其任意组合在制备用于治疗、改善、预防和抑制免疫相关病症的组合物中的应用(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；(b)CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。在一些特定实施方式中，本发明包括与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl从而调节受试对象中的Thl/Th2平衡的化合物在制备免疫调节性组合物中的应用。在特定实施方式中，本发明可以使用特异性地识别并结合CAPl从而将受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体。应注意的是，本发明的方法所用的抗CAPl抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体中的任何一种。术语“抗体”意在包括能够结合抗原的完整分子及其片段，例如Fab和 F(ab' )2。还应认识到的是，根据某些实施方式，任何CAPl结合化合物，尤其是作为抗体的任何CAPl结合化合物，可以是任何抗-CAPl抗体，或识别并结合CAPl的任何抗体，除了，或条件是所述抗体不是多克隆、单克隆的大鼠或小鼠抗-肽-6抗体(例如，命名为BM或F9 单克隆的抗体)或源自其的任何嵌合或人源化抗体嵌合抗体中的任何一种。在其他实施方式中，本发明包括CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物在制备用于通过调节受试对象中的Thl/Th2平衡来治疗免疫相关病症的组合物中的应用。
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在第五方面，本发明提供调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡的腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物，其用于治疗受试对象中的免疫相关病症。还应注意的是，可以将本文所用的所述CAPl分子或其任何片段以下述物质中的任何一种的形式提供纯化的重组蛋白，和表达CAPl分子的转化宿主细胞的细胞裂解物或膜制品。本文所用的术语“片段”和“功能性片段”意为CAPl分子或其任何片段，其可具有任何插入、缺失、取代和修饰，并且能够诱导对Thl/Th2细胞平衡的特定调节(下文称其为 “片段”)，所述调节反映在对Th2抗炎细胞因子(例如IL-10)或Thl促炎细胞因子的激活上。应认识到的是，根据说明书和下文权利要求中所用的某些实施方式，CAPl蛋白是指人 CAPl蛋白，该蛋白包含GenBank登记号ΝΡ_001099000. 1所表示的、由图30显示的且另外表示为SEQ ID NO 6的氨基酸序列，且该氨基酸序列由GenBank登记号CAG33690. 1所示的人 CAPl基因编码。本发明还提供特异性地识别并结合CAPl从而将有需要的受试对象中的Thl/Th2 平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体，其用于治疗所述受试对象中的免疫相关病症。如以上所指出的，本发明所公开的结果清楚地证明了 CAPl作为该免疫调节途径中的关键要素并因此作为用于免疫调节的潜在靶标的作用。因此本发明提供CAPl作为靶标在搜寻免疫调节化合物中的应用。因此，在另一方面，本发明涉及调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡的免疫调节化合物的筛选方法。本发明的筛选方法包括以下步骤 (a)获得与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物结合的候选化合物；和(b)确定步骤(b)中获得的化合物对调节Thl/Th2平衡的影响，特别是通过检查抗炎或促炎细胞因子的表达。由此，所述候选化合物对抗炎或促炎细胞因子表达的调节可指示所述化合物调节Thl/Th2平衡的能力。术语“候选化合物”意思是指需要对该化合物结合CAPl并由此调节Thl/Th2平衡的能力进行表征的任何化合物。“调节”意在指任何或全部细胞因子、淋巴因子和与免疫应答相关的任何细胞过程的增加、减少或其他变化。在这点上，变化可以优选包括使IL-10表达增加和将Thl/Th2平衡向Th2免疫应答方向调节。就免疫调节化合物与CAPl分子的高亲和力结合应用高通量筛选的关键是开发灵敏且便捷的筛选测定。在所述筛选方法中，通过免疫调节化合物对CAPl的亲和力来开发用于免疫调节化合物的鲁棒性(robust)筛选测定会是第一步。因此，候选免疫调节化合物可以通过以下步骤来获得(a)提供包含CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物的混合物；(b)在用于所述结合的适合条件下使所述混合物与候选化合物接触；和(c)确定所述候选化合物对终点指示的影响。应注意的是，对终点的调节表明了 CAPl分子与被测候选化合物的结合。根据一个特定实施方式，终点指示可以是产生目视可检测信号的抗-CAPl抗体与 CAPl分子的结合。在此情况下，该终点的增加可表明所述测试化合物与CAPl分子的结合。本文所用的术语“可检测”是指由可检测化学反应产生的通过观察、仪表装置或胶片可以立即检测到的可检测信号的存在。
更具体而言，本文所用的术语“可检测信号”是指引起通过目视观察或仪器装置可直接或间接检测(观察)到的信号的出现或发生变化的信号。通常，可检测信号是在光学性质上可检测(“光学可检测”)，其反映在波长分布图变化或者吸光度或荧光的强度的变化上，或者反映在光散射、荧光寿命、荧光极化或这些参数的组合的变化上。更特别而言，可以将每个候选化合物(其可以是例如肽或任何小分子)置于孔中， 并优选通过对CAPl具有特异性的抗体来检测CAPl分子或其任何片段的结合。可以对使 CAPl分子或其任何片段与候选免疫调节化合物在平板上有效结合的条件进行优化，包括研究PH、盐和缓冲组合物以及载体蛋白(例如BSA)。该鲁棒性筛选产生了与CAPl分子结合的化合物。将这些与CAPl结合的化合物汇集起来，随后如以下所述对其进行测定。应注意的是，本发明的方法所用的抗-CAPl抗体可以是多克隆抗体和单克隆抗体中的任何一种。还应注意的是，术语“抗体”意在包括能够结合抗原的完整分子及其片段， 例如 Fab 和 F(ab' )2。根据某些实施方式，在本发明的筛选方法的另一可选步骤中，可以对如上所述获得的结合CAPl的候选免疫调节化合物，就其在CAPl分子内的抗-肽-6抗体结合部位处特异性地结合CAPl的能力进行进一步选择。此类经选择的化合物将能够理想地防止或调节所述CAPl和抗-肽-6抗体间的相互作用。根据此特定实施方式，该可选的选择过程可以通过以下步骤来进行(a)提供包含CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物的混合物；(b)在用于使抗-肽-6抗体通过抗-肽-6结合部位与CAPl分子进行特定相互作用的适合条件下使所述混合物与被测候选化合物接触；和(c)确定所述被测候选化合物对终点指示的影响。对该终点的调节可表明被测候选化合物通过所述抗-肽-6结合部位与CAPl分子结合。根据另一实施方式，用于可选的选择阶段的混合物包含(a)CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物；(b)通过CAPl中的抗-肽-6结合部位而与CAPl分子特异性地结合的抗-肽-6抗体；和(c)可选的溶液、缓冲剂和化合物，其为抗-肽-6抗体与CAPl分子的相互作用和用于该相互作用的终点指示的检测提供适合条件。根据一个实施方式，终点指示可以是造成目视可检测信号的抗-肽-6抗体与CAPl分子的结合。在本发明的另一个实施方式中，在所述终点观察到的抑制表明了被测候选化合物与CAPl中的抗-肽-6抗体结合部位的直接结合。因此，候选化合物的结合与抗-肽-6抗体的结合竞争结合部位，从而调节和/或抑制所述结合。为了执行此竞争测定，例如通过生物素化或通过添加荧光素可以对抗-肽-6抗体进行直接标记，或者作为另一选择，可以通过二抗对抗-肽-6抗体进行间接标记。用于通过本发明的筛选方法来获得并选择候选化合物的混合物可以是细胞混合物或无细胞混合物。根据一个替代性实施方式，本发明的方法所采用的混合物可以是无细胞混合物。 此类混合物包含CAPl分子或其任何功能性片段(优选包含抗-肽-6抗体结合部位)，其可以作为下述物质中的任何一种提供肽，纯化的重组蛋白，融合蛋白和表达所述CAPl分子的转化宿主细胞的细胞裂解物或膜制品。在特定的非限制性的实例中，当CAPl结合到微孔板的孔上时，可以进行上述可选的选择过程。随后，在候选免疫调节化合物存在时，将每个孔与有限量的抗-肽-6抗体一起温育。从每个孔中收集上清液。通过二抗ELISA检测上清液中的未结合的抗体。如果测试化合物在抗-肽-6抗体所识别的结构域处与CAPl紧密结合，其将在抗-肽-6抗体与 CAPl的结合中进行竞争，并且释放出可在零背景下检测出的游离的抗-肽-6抗体，从而使该测定灵敏。通过此方法，将会消除与抗-肽-6抗体/CAPl相互作用所涉及的结构域的外部结合的候选化合物。替代性方法是使用经标记的抗-肽-6抗体，并测定候选化合物将经标记的抗体从与平板上的CAPl的结合中置换掉的能力。作为另一选择，用于该可选的选择步骤的混合物可以是细胞混合物。在此特定实施方式中，将每个候选化合物(优选为肽)置于孔中，随后用BSA和胎牛血清封闭该孔。通过目视或抗-CAPl ELISA，对例如细胞表面上表达CAPl的THP-I细胞的结合进行评分。作为另一选择，可以使用从表达CAPl的细胞制备的细胞膜，并使用抗-CAPl抗体来检测结合。 随后，在作为竞争物的抗-肽-6抗体存在时，重新检查阳性候选化合物。应认识到的是，所述抗-肽-6抗体是指特异性地针对包含肽6的氨基酸序列(由氨基酸序列SEQ ID NO. 1表示)的抗体。应注意的是，抗-肽-6抗体包括多克隆、单克隆、 嵌合和人源化抗-肽-6抗体以及其F(ab)片段。应注意的是，本文所用的术语ftOximab 是由本发明人制备的抗-肽-6抗体。应注意的是，可以将混合物中所包含的CAPl分子或其任何片段以下述物质中的任何一种的形式提供纯化的重组蛋白，和表达CAPl分子的转化宿主细胞的细胞裂解物或膜制品。本文所用的术语“片段”和“功能性片段”意为具有任何插入、缺失、替换和修饰的CAPl分子或其任何片段，其包含抗-肽-6结合部位且能够结合此抗体，从而诱导对 Thl/Th2细胞平衡的特定调节(下文称其为“片段”)，所述调节反映在抗炎细胞因子(例如 IL-10)的激活，或备选的促炎细胞因子的激活上。根据另一实施方式，通过本发明的筛选方法检查的候选化合物可以选自由蛋白类化合物、核酸类化合物、碳水化合物类化合物、脂类化合物、天然有机类化合物、合成源有机类化合物、无机类化合物和肽模拟物类化合物组成的组。根据另一实施方式，该化合物可以是对肽组合文库、环式肽模拟物文库和随机或专用的噬菌体展示文库的位点扫描中的任何一个的产物。根据另一特定实施方式，本发明的筛选方法的第二阶段包括对所选的候选化合物确实可调节抗炎细胞因子的表达的可行性和其由此调节先天性免疫的能力的进一步评估。 因此，下面对如上所述获得的并可选地经过选择的候选化合物就其调节Thl/Th2细胞平衡尤其是激活Th2淋巴细胞能力进行评估。该评估阶段包括以下步骤(a)提供包含CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物的测试系统；(b)使所述测试系统与通过本发明筛选方法的前述阶段获得并可选地经过选择的被测候选化合物接触；和(c)确定所述候选化合物与对照相比的对终点指示的影响，其中所述影响可指示被测候选物对促炎性 Thl或抗炎性Th2淋巴细胞的活化进行调节的能力。用于对通过使用本发明的筛选方法分离的候选免疫调节化合物进行评估的测试系统可以是体外/离体细胞培养物或体内动物模型。此类测试系统还可选地包含内源和/ 或外源化合物，这些化合物为Th2细胞的激活和为检测用于确定候选化合物的调节效果的终点指示提供适合的条件。更具体而言，通过诱导Th2细胞因子(例如IL-10和/或IL-4)的基因表达来确定所述激活或调节。本发明的筛选方法所使用的评估用测试系统可以是包含外源性表达的CAPl分子的体外/离体细胞培养物。在特定实施例中，作为测试系统使用的细胞培养物可以是分离自哺乳动物供体的PBMC培养物。因此，此特定测试系统中的终点指示可以是抗-CAPl抗体或抗-肽-6抗体所诱导的IL-10和/或IL-4的表达，其产生目视可检测信号。所以，对所述终点的任何调节、抑制或甚至降低指示候选化合物特异性地调节Thl/Th2平衡的能力，这尤其通过对抗炎细胞因子IL-10的激活或者备选地，对促炎细胞因子的激活上。例如通过定量斑点印迹杂交和RNA 酶保护测定，可以检测抗-肽-6抗体所诱导的IL-10表达。应注意的是，本发明所用的测试系统还可选地包含内源和/或外源化合物，这些化合物为抗炎细胞因子的表达和为检测用于确定候选化合物的免疫调节效果的终点指示提供适合的条件。在另一优选实施方式中，对抗炎细胞因子表达的调节可以是所述细胞因子的表达与对照相比增加或减少中的任何一种。应注意的是，根据某些实施方式，本发明的筛选方法特别涉及对调节任何抗炎细胞因子(例如，IL-10、IL-4和IL-6)的表达的化合物进行鉴定。更具体而言，根据一些实施方式，本发明的筛选方法涉及鉴定激活Th2抗炎应答的化合物。本发明还提供与CAPl相互作用从而调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡的免疫调节化合物，其中通过本发明的筛选方法来鉴定该化合物。最后，在另一方面，本发明涉及用于制备在治疗免疫相关病症中有效的药物的药物单位剂型，所述药物单位剂型包含治疗有效量的下述(a)和(b)中的至少一种或其任意组合作为活性成分(a)与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物，(b) CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和片段；所述剂型还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。根据某些实施方式，本发明的药物单位剂型可以包含与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl从而调节受试对象中的Thl/Th2平衡的化合物作为活性成分。在又一实施方式中，所述化合物可以是特异性地识别并结合CAPl从而将受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体。根据替代性实施方式，本发明的药物单位剂型包含CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物作为活性成分，从而调节受试对象中的Thl/Th2平衡。现将基于以下实施例对本发明作更详细的描述，所述实施例仅是说明性的而不以任何方式限制本发明。基于本文的教导，可以对本发明做出很多改进和变形。因此应理解的是，在所附权利要求的范围内，可以以具体描述的方式以外的方式实施本发明。对于所公开和描述的，应理解的是，本发明并不限于本文所公开的特定的实施例、 方法步骤和组合物，因为这些方法步骤和组合物可以发生一些变化。还应理解的是，由于本发明的范围仅受所附权利要求及其等效概念的限制，所以本文所用的术语仅是用来实现描述特定实施方式的目的，并非试图进行限制。必须注意的是，除非内容另有明确规定，本说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数的所指代物。
在整个本说明书和实施例及随后的权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包含”及诸如“含有”和“包括”等变形应理解为表示对所叙述的整体或步骤或者整体或步骤的组的包涵，但并不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。以下实施例代表了本发明人在实施本发明的方面时所采用的技术。应认识到的是，虽然这些技术是用于实行本发明的优选实施方式的示例，但本领域的技术人员基于本公开内容将认识到可以做出许多改进而无需脱离本发明的主旨和计划的范围。实施例实验方法抗体*小鼠抗-肽-6抗体是通过杂交瘤技术从经肽-6-免疫的Balb/C小鼠开发出的小鼠单克隆抗体，并且具有IgM同型。*大鼠抗-肽-6抗体是通过杂交瘤技术从经肽-6免疫的Lewis大鼠开发出的大鼠单克隆抗体，并且具有IgM同型。*嵌合抗-肽_6IgGl小鼠和大鼠抗体是由Antitope Ltd.使用标准嵌合技术开发的。所得的嵌合抗体由来自小鼠抗体的小鼠可变区或来自大鼠单克隆抗体的大鼠可变区， 和人IgGl同型的恒定区构成。*基于小鼠参照抗体的人源化抗-肽-6抗体是由Antitope Ltd.使用Composite Human Antibody 技术(在 WO 2006/082406 中描述)制造。将经FITC标记的人源化抗体用于FACS分析。在一些实施方式中，术语ftOximab可以用来描述针对MT HSP65的肽_6表位的单克隆人源化抗体。*CD14_PE (Sigma)；* 与 PE 缀合的抗 CD32 (CALTAGTM Laboratories)；* 与 APC 缀合的抗 CDM (CALTAGTM Laboratories)；* 与 FITC 缀合的山羊抗大鼠 IgG+IgM (Jackson ImmunoResearch Lab. Inc. West Grove, PA 19390，USA)；* 抗人 IgG-FITC(Sigma);* ^^^^ δ Λ CAPl (Abnova Corporation, Taiwan)；细胞培养条件*MM6-Mono Mac 6 (人骨髓单核细胞性细胞系(Human myelomonocytic cell line)，DSMZ No. ACC 124)。将MM6细胞保持在补充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸盐、非必需氨基酸、0. 青霉素-链霉素(pen-str印)、10% FCS和10 μ g/ml人胰岛素的RPMI培养基中。*THP-1 (人急性单核细胞性白血病细胞系，ATCC No. TIB-202)。将THP-I细胞保持在补充有10% FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和IOmM HEPES (pH = 7. 3)的 RPMI 培养基中。*HeLa(人宫颈癌细胞系，ATCC No. CCL-2)。将HeLa细胞保持在补充有10% FCS、2mM L-谷氨酰胺和0. 青霉素-链霉素的 DMEM培养基中。
在5% (X)2下和37°C的温育器中使细胞生长。试剂盒*Readyft·印""蛋白提取试剂盒(膜 I) (Bio-Rad Laboratories, Inc. ,Hercules,CA 94547，USA)。*ReadyPrep 蛋白提取试剂盒(细胞质)(Bio-fcid Laboratories, Inc.， Hercules, CA 94547，USA)。*Dylight 抗体标签试齐[J 盒(Thermo Scientific Pierce Protein Research Products, Rockford, IL,USA)。*F(ab)2$[J备试剂盒(Thermo Scientific Pierce Protein Research Products, Rockford, IL,USA)。*siRNA 试剂盒 HiPerfect 转染试剂 ^jiagen)+All star 和 CAP1_5 siRNA(Qiagen)。制造单克隆小鼠和大鼠抗-肽-6的杂交瘤(B24)的产生用100 μ g悬浮在完全弗氏佐剂中的肽-6 (GPKGRNVVLEKKWGAP,如SEQ ID NO. 1所示)对六周龄的雌性Balb/c小鼠或Lewis大鼠进行皮下注射。以三周为间隔，用不完全弗氏佐剂中的肽再注射动物两次。收集血清以用于通过ELISA来测量抗-肽-6抗体的水平， 对具有最高水平的动物用连续2次腹膜内注射50 μ g在PBS (磷酸盐缓冲盐水，137mM NaCl, 2. 7mM此1，101111磷酸二氢钠，21111磷酸氢二钾，？!17.4)中的肽而进行处理。次日，使脾细胞与BALB/c Ig-非分泌型骨髓瘤NSO融合。通过特异性ELISA在上清液中检测到了特异性地识别肽-6的抗体的存在，并扩增阳性克隆。对于本研究，使用了命名为B24的克隆，其产生 IgM型抗体。将这些单克隆抗体称为抗-肽_6。从杂交瘤细胞的上清液中纯化出抗-肽-6 抗体。通过硫醇吸附(thioadsorption)和随后的蛋白G色谱(Adar Biotech, Israel)来进行纯化。通过SDS-PAGE来确定抗体的纯度。嵌合抗-肽-6抗体的产生从BM细胞(Promega目录号Z5400)中提取mRNA。使用小鼠信号序列的简并引物池和单一恒定区引物来执行RT/PCR。使用6个简并引物池的组来扩增重链可变区mRNA，使用8个简并引物的组来扩增轻链可变区mRNA。克隆每种产物，并对每种产物的若干克隆进行测序。对于两种抗体，鉴定出了单功能性重链和轻链可变区序列。将BM可变区转移至用于IgGl和IgG4重链的表达载体系统中(Antitope Ltd.)。人源化抗-肽-6抗体的制备人源化抗-肽-6抗体(本文中称之为ftOximab)是由Antitope Ltd.基于嵌合小鼠参照抗体使用Composite Human Antibody 技术(在WO 2006/08M06中描述)而制造的。简言之，人可变区(V区)序列的区段(segment)源自不相关的人抗体序列数据库中。使用iTope 分析，对每个选择出的序列区段(以及区段间的连接)就与MHC II类结合的潜力进行测试，并且将所有最终的Composite Human Antibody 序列设计为避开T细胞表位。Composite Human Antibody V(可变)区基因是使用编码人序列区段的组合的合成寡核甘酸来产生的。随后将其克隆至含有人恒定区的载体中，制造出抗体，并通过竞争 ELISA就与靶抗原的结合进行测试。因此，将所得的组合了 VHl 4(可变重链1 4)与VKl 3(可变轻链1 3)的抗体变体命名为例如VH1/VK1、VH2/VK1等。还应当注意的是， 这些变体也表示为Proximab。人源化抗-肽-6抗体的F(ab)2片段的制备使用F(ab)2制备试剂盒通过胃蛋白酶消化(按照制造商的说明)来产生人源化 VH2/VK3变体抗-肽-6抗体(Proximab)的F(ab)2片段。使用Dylight 抗体标记试剂盒 (Pierce;按照制造商的说明)来使F(ab)2片段标记有FITC(异硫氰酸荧光素，Sigma)标签。人外周血单个核细胞的制备从健康志愿者或从取自血库的血沉棕黄层(包含密度梯度离心后的抗凝血样品级分，该级分含有大多数的白细胞、红细胞和血小板)收集人静脉血。在Ficol梯度液 (Ficoll Hypaque TM-GE Healthcare)上使血液分层，从而分离并富集白细胞级分。于室温在ISOOrpm下离心细胞30分钟。将单个核细胞带提取出并再悬浮于PBS中至最终体积为40ml，并在IlOOrpm 1200rpm下离心10分钟。将球团悬浮在补充有2%人血清、2mM 谷氨酰胺、lOOyg/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI中(所有试剂均来自Biological Industries,Beit-Haemek, Israel)。将细胞以1 2X IO6的浓度接种到24孔平板中。如果仅需要贴壁细胞，则将细胞温育1. 5小时 3小时(37°C，7% CO2)，随后用PBS洗涤四次洗去未贴壁的细胞。根据制造商的说明，用抗-人CD14磁珠(BD Biosciences Pharmingen)从混合物中进一步分离出⑶14+细胞。荧光激活细胞分选(FACS)分析将IO6个CD14+细胞、IO6个MM6细胞或0.5X IO6个THP-I细胞与稀释在含 BSA、1%山羊血清的PBS(FACS培养基)中的一抗于4°C温育1小时。用FACS培养基洗涤细胞2次，并将细胞与250ng/管的稀释在FACS培养基中的与FITC缀合的山羊抗大鼠 IgG+IgM(Jackson ImmunoResearch Lab. Inc. West Grove, PA 19390，USA)于室温温育 30 分钟。随后洗涤细胞，并使用FCS express 3程序(De novo software)通过LSRII流式细胞仪来分析细胞。用嵌合抗-肽-6抗体对MM6细胞染色用10 μ g嵌合(CHM)抗-肽_6抗体对Mono Mac 6 (MM6)细胞染色，随后用1 200 的抗人IgG-FITC 二抗单独进行染色或用其与1 20的小鼠抗人⑶14-APC(Miltenyi Biotec) 一起进行染色。用3. 7%的甲醛固定细胞，置于载玻片上，用封片缓冲液(mounting buffer)覆盖，并在kiss共聚焦显微镜下观察。亲和色谱使琼脂糖凝胶珠与小鼠和大鼠抗-肽-6单克隆抗体结合(5mg抗体々ml琼脂糖凝胶)，并装柱。将THP-I人前单核细胞性亲水性膜蛋白与Tween 20—起添加至0.1。除去固体物质后，将样品加载到柱上。在酸性条件下(0. IN甘氨酸，pH 2.4)进行洗脱，随后用高盐(3. 2M异硫氰酸钠)洗脱。收集1. 5ml的级分(fraction)，使用Bradford蛋白检测法来检测蛋白含量。将球团悬浮于PBS中，并以PBS为背景透析3次。蛋白质印迹分析将THP-I蛋白级分(实施例4)、从抗-肽-6亲和色谱柱上洗脱出的THP-1前单核细胞性亲水性膜蛋白(20yg)和结核分枝杆菌(MT)热休克蛋白65(5yg)煮沸，用电力使其在9%的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶上进行分辨并随后转移到硝酸纤维膜上。使用大鼠抗-肽-6单克隆抗体BM来进行蛋白质印迹。通过山羊抗大鼠Fc-过氧化物酶(HRP)及随后与HRP底物的温育和化学发光信号检测，来检测结合强度。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)使用SV总RNA分离系统(!Iomega，USA)来提取总RNA，并使用逆转录系统 (Promega, USA)来制备cDNA。用以下引物通过PCR来扩增所得的cDNA IL-10 上游-5' ACCAAGACCCAGACATCAAG 3'，(亦由 SEQ ID NO. 2 表示)；下游-5'GAGGTACAATAAGGTTTCTCAAG 3‘，(亦由 SEQ ID NO. 3 表示)；GAPDH 上游-5' CCCATCACCATCTTCCAGGAGCG 3'，(亦由 SEQ ID NO. 4 表示)；下游-5'CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA 3'，(亦由 SEQ ID N0. 5 表示)。上述引物分别产生了 IL-10和GAPDH mRNA的461bp和476bp的产物。电迁移率移动测定(EMSA)如以前所述制备细胞核提取物(Lee，K.等，Gene. Anal. Technol. 5 22-31(1988))。在含有20ng双链寡核苷酸、1 μ 1 Klenow DNA聚合酶和5 μ 1的10 μ C/ μ L[ α -32P]dCTP(Amersham,UK)的20 μ 1的反应混合物中，对寡核苷酸进行标记。在20 μ 1 的最终体积中，将200pg经标记的寡核苷酸与细胞核提取物(IOyg蛋白)在含有12mM HEPES pH 7.2、60mM KCl、0.6mM Na2EDTA、0. 6mM DTT、5mM MgCl2 禾口 1 μ g 聚 d (I-C)的缓冲液中于30°C温育40分钟。在0. 5TBE缓冲液中和200V下，在4%聚丙烯酰胺凝胶上使反应混合物电泳90分钟。CAP表达的siRNA干扰将人THP-I前单核细胞性细胞以60，000个细胞/100微升RPMI培养基的浓度接种到M孔平板中。将5皮摩尔All star阴性siRNA或5皮摩尔CAPl siRNA稀释到含有3 微升HiPerfect转染试剂Oliagen)的100微升无血清RPMI培养基中。温育10分钟后，将 siRNA溶液添加至细胞。在7%的(X)2下于37°C温育细胞6小时，随后添加400微升RPMI 培养基。在相同条件下温育48小时后，收获细胞并进行上述的荧光激活细胞分选(FACS) 分析。细胞因子水平的ELISA评估使用来自R&D SYSTEMS, Minneapolis丽USA的特异性试剂盒(按照制造商的说明)来进行评估细胞培养物中或动物血清中的细胞因子水平。对佐剂诱导的关节炎的诱导和临床评价用CFA(Difco)中的 Img 结核分枝杆菌(MT) H37Ra (Difco, Detroit, MI)对 6 8 周龄雌性近交Lewis大鼠(Harlan Laboratories, Israel)在尾基部进行皮内注射。每隔一天由单盲观察者对关节炎的严重程度(关节炎指数)作下述评价0，无关节炎；1，关节发红；2，关节发红并肿胀。对每只爪的踝关节和跗骨-跖骨关节进行评分。可以获得16的最高评分。实施例1抗-肽-6抗体诱导IL-10特异性mRNA的短暂上调、IL-10的分泌并减轻佐剂性关节炎
研究了 HSP-65肽_6结合抗体的分子作用机制。体外评估了鼠抗_肽_6mAb对单核细胞的影响，且显示出其诱导人单核细胞显著分泌抗炎细胞因子IL-10。在RPMI中使原态人单核细胞与鼠抗-肽_6mAb —起温育(Mh，37°C,5% CO2)，并通过ELISA测量IL-10向培养基中的分泌。未处理的细胞作为对照。图1显示了鼠单克隆抗-肽-6对IL-10的诱导。用人源化的ftOximab已获得了相似的结果(未示出)。发明人随后检查了抗-肽-6抗体对IL-10转录活性的影响，并由此在体外测试了 B24大鼠抗-肽-6抗体对IL-IOmRNA水平的影响。将人单核细胞(PBMC)与BM抗-肽-6 单克隆抗体、作为阴性对照的全原态Lewis IgM抗体或作为阳性对照的脂多糖(LPS) —起温育。在暴露于LPS、全原态Lewis IgM对照或B244小时和M小时后收获细胞。通过逆转录PCR(RT-PCR)对提取出的mRNA进行IL-IOmRNA测试(图2A)。使用GAPDH cDNA作为对照以获得相等的载量(图2B)。如图2A所示，与未处理的细胞和经原态Lewis IgM处理的细胞相比，暴露4小时后，LPS和抗-肽-6抗体均诱导IL-10的mRNA增加。然而，在用抗-肽-6处理的细胞中的表达水平在与抗体一起温育M小时后减少，这与经LPS处理的细胞相反，在后者中mRNA水平在暴露后M小时保持恒定。这些结果表示抗-肽-6诱导 IL-IOmRNA表达的短暂上调。接下来评估了已确立的关节炎实验模型中ftOximab (人源化抗-肽_6mAb)对诱导IL-10水平的影响。在第0天用CFA中的MT对Lewis大鼠进行免疫来诱导关节炎，通过临床评分来测量关节炎的严重程度。用PBS (阴性对照)、类固醇或ftOximab对动物进行处理。如图3所示，与经载质(PBS)处理的阴性对照相比，Proximab显示出有效降低了小鼠中佐剂性关节炎的严重程度，而且这些动物显示出具有高水平的IL-10。类固醇在降低了关节炎的严重程度上也是有效的，但是其并未显示诱导IL-10分泌的机制。实施例2抗-肽-6抗体与人⑶14+细胞结合本发明的目的是鉴定抗-肽-6抗体的靶蛋白，并且对该相互作用所触发的细胞内过程进行表征。在不受理论束缚的情况下，发明人的工作假设是抗-肽-6抗体与单核细胞的膜配体发生交叉反应，激活引起IL-10的转录活性和分泌增加的信号转导途径。为了进一步探究这一假设，发明人试图鉴定抗-肽-6抗体的特异性靶细胞。用磁珠从人PBMC 中分离出⑶14阳性细胞，并用经FITC标记的嵌合抗-肽-6抗体(CHM，图4B)或用抗人 CD14-PE(图4C)或同时使用两者(图4D)来对所述CD14阳性细胞染色。未染色的细胞用作阴性对照(图4A)。随后通过FACS对细胞进行抗体结合分析。如图4D所示，在双染色级分中的大多数细胞都呈CHM和⑶14+阳性，表明CHM抗体高效地结合⑶14+细胞。这些结果表明CHM抗体与⑶14+细胞的细胞外组分特异性地相互作用。为了确定人源化抗-肽-6抗体ftOximab是否会以相似的特性进行结合，使用 Proximab代替CHM进行了相似的实验。人PBMC细胞分离自健康供体并在Ficoll梯度液上使其进行离析。用与APC缀合的抗⑶14 (图5A)或同时用经FITC标记的ftOximab和与 APC缀合的抗⑶14(图5B)对所分离的细胞进行染色。结果显示，Proximab与⑶14+细胞结合(单核细胞占所分离细胞群体的约10%，图5B，右上象限)。图5C绘出了被FITC染色的细胞占⑶14+群体的百分比(无ftOximab-黑色，有ftOximab-灰色)，显示出ftOximab 结合了较大百分比(75%)的⑶14+群体。用鼠抗-肽_6mAb也已获得了相似的结果。
在已示出抗体与CD14阳性细胞结合的情况下，发明人进一步评估了 CHM与单核细胞性细胞系的膜的结合。对于实验使用源自骨髓单核细胞性细胞系CDH+Mono Mac 6 (MM6) 细胞，并用CHM抗体染色，随后使之仅暴露于与FITC缀合的抗人IgG抗体或暴露于该抗体与小鼠抗人CD14-APC。染色后，将细胞固定并置于载玻片上，在共聚焦显微镜下进行观察。 如图6A清楚显示，CHM抗体与MM6细胞的膜特异性地结合。同时被CHM-FITC (绿色)和 ⑶14 (红色)染色的细胞(图6B)揭示出CHM抗体的结合分散在整个膜上，这与⑶14抗体的染色相似，表明CHM抗体的配体位于CD14阳性细胞的膜表面上。实施例3抗-肽-6抗体与人单核细胞的结合并非由Fc受体介导发明人接下来检查了免疫系统的已知成分(例如Fc受体)作为抗-肽-6抗体的靶标的可能参与。据之前的报导，MM6细胞中有约71 %表达受体Fc y RI (⑶64)，并有约 96%表达 Fc YRII (CD32)，但不表达受体 Fc γ RIII (CD16) (Tron 等，Eur. J. Immunol, 38 1414-1422 (2008))。为了测试与MM6细胞结合的人源化抗-肽_6抗体是否通过在这些细胞上存在的Fc受体而受到介导，发明人使用了针对Fc受体CD32和CD64的两种抗体，以及作为与经FITC标记的人源化抗-肽-6抗体(VK3-FITC)竞争的竞争物的非荧光人源化抗-肽-6抗体(VD)。通过FACS进行分析。图7呈现了在使细胞与未经标记的VK3或与针对⑶32和⑶64的抗体一起预温育后VK3-FITC与MM6细胞的结合。如所显示的，FITC-VK3结合了 30%的细胞(左侧柱)。令人感兴趣的是，与针对两种Fc受体(⑶32和⑶64)的抗体一起预温育不抑制VK3-FITC与这些细胞的结合(右侧柱)。相比之下，与非荧光的VK3抗体一起预温育完全破坏了 VK3-FITC 的结合(中间柱)。这些结果清楚表明人源化抗-肽-6抗体并不利用MM6细胞上存在的 Fc受体，而是靶定不同的膜蛋白。实施例4抗-肽-6抗体与单核细胞亲水性膜蛋白结合为了进一步表征本发明的抗体所结合的特异性配体，发明人首先测定了该抗体与另一细胞系THP-I (人前单核细胞性白血病细胞系)的结合。为了确定THP-I细胞是否结合该抗体，将细胞与大鼠抗-肽-6单克隆抗体(B24) —起温育，然后进行FITC染色，随后进行FACS分析。将仅与二抗(FITC-山羊抗大鼠)一起温育的细胞作为对照。如在图8B 中所观察到的，此分析揭示了 75%的细胞与BM抗体结合，而在对照细胞中未检测到结合 (图8A)。在已确定BM结合THP-I膜的情况下，发明人继续富集并鉴定靶配体。为实现此目的，将亲水性膜蛋白、疏水性膜蛋白和细胞质蛋白从THP-I细胞中分离出，并使用BM单克隆抗-肽-6抗体进行蛋白质印迹分析(图9 ；泳道1-亲水性膜蛋白；泳道2-疏水性膜蛋白，泳道3-细胞质蛋白)。仅用全大鼠免疫球蛋白或培养基对对照印迹进行印染。如所展示的，BM抗体结合亲水性膜蛋白的三个级分52kDa、IOOkDa和120kDa。在阴性对照印迹中未检测到结合(数据未示出)。这些结果清楚表明抗-肽-6抗体的靶蛋白是位于细胞膜上的亲水性蛋白。实施例5抗-肽-6抗体与腺甘酸环化酶相关蛋白(CAPl)结合为了特异性鉴定抗-肽-6抗体的靶蛋白，将THP-I细胞的亲水性膜蛋白级分加载到含有与琼脂糖凝胶珠结合的抗-肽-6抗体的亲和柱上。将结合蛋白洗脱并加载到 SDS-PAGE中，随后进行考马斯蓝染色。图10呈现了抗-肽-6亲和色谱洗脱出的蛋白的考马斯蓝染色，可见于泳道2和4中；其中，泳道2表示在大鼠抗-肽-6柱上的亲和色谱，泳道4表示在小鼠抗-肽-6柱上的亲和色谱。在两种情况中可以看到约40kDa和50kDa的两条双重条带。泳道1和6含有标志物。随后，将获得的条带从凝胶上切下并送达两个独立的研究所进行质谱分析(MS)。 表1是从大鼠抗-肽-6亲和色谱柱洗脱出的亲水性膜蛋白的测序结果。如该表所示，MS分析揭示了洗脱出的蛋白包括腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)，其为52KDa的蛋白，其氨基酸序列示于图30中并由SEQ ID NO 6表示。这一发现清楚表明针对肽_6的抗体特异性地结合 CAPl。表1 从大鼠抗-肽-6亲和色谱柱洗脱出的人THP-I亲水性膜蛋白的测序结果。
权利要求
1.一种用于调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡的组合物，所述组合物包含免疫调节有效量的下述a和b中的至少一种或其任意组合作为活性成分a.与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；b.CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物，所述组合物还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡的化合物作为活性成分。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述化合物是特异性地识别并结合CAPl从而将所述受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物作为活性成分，从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡。
5.如权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作。
6.一种用于治疗、预防、改善或推迟有需要的受试对象中的免疫相关病症的发作的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的下述a和b中的至少一种或者其任意组合或包含上述物质的任何组合物的步骤a.与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；b.CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤对所述受试对象施用治疗有效量的与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl的化合物或包含所述化合物的任何组合物，从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述化合物是特异性地识别并结合CAPl从而将所述受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤对所述受试对象施用治疗有效量的CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物或者包含上述物质的任何组合物，从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡。
10.治疗有效量的下述a和b中的至少一种或其任意组合在制备用于治疗、预防、改善或推迟有需要的受试对象中的免疫相关病症的发作的组合物中的应用a.与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；b.CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物。
11.如权利要求10所述的应用，其中，所述组合物包含与CAPl特异性地相互作用并结合CAPl从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡的化合物作为活性成分。
12.如权利要求11所述的应用，其中，所述化合物是特异性地识别并结合CAPl从而将所述受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节的抗-CAPl抗体。
13.如权利要求10所述的应用，其中，所述组合物包含CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物作为活性成分，从而调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡。
14.腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物，其调节有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡，并用于治疗、预防、改善或推迟所述受试者的免疫相关病症的发作。
15.一种抗-CAPl抗体，所述抗-CAPl抗体特异性地识别并结合CAP1，从而将有需要的受试对象中的Thl/Th2平衡向Th2抗炎应答方向调节，并用于治疗、预防、改善或推迟所述受试者的免疫相关病症的发作。
16.一种免疫调节化合物的筛选方法，所述免疫调节化合物调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡，所述方法包括以下步骤a.获得与CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物结合的候选化合物；b.确定步骤a中选择出的化合物对调节抗炎细胞因子或促炎细胞因子的表达的影响， 由此，所述候选化合物对抗炎细胞因子或促炎细胞因子表达的调节指示所述化合物调节所述受试对象中的Thl/Th2平衡的能力。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述免疫调节化合物通过以下步骤获得a.提供包含所述CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物的混合物；b.在用于所述结合的适合条件下使所述混合物与所述测试化合物接触；和c.确定所述测试化合物对终点指示的影响，由此，对所述终点的调节指示所述CAPl分子与所述测试化合物的结合。
18.如权利要求16所述的筛选方法，其中，通过确定所述候选化合物调节Th2淋巴细胞的激活的能力来评估所述候选化合物，所述评估包括以下步骤a.提供包含CAPl分子或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物的测试系统；b.使所述系统与通过权利要求16所述的方法获得的候选化合物接触；和c.确定与对照相比所述候选化合物对终点指示的影响，其中所述影响指示所述候选物调节T淋巴细胞的激活从而调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡的能力。
19.一种与CAPl相互作用从而调节有需要的受试对象中的Thl/Th2细胞平衡的免疫调节化合物，其中，所述化合物是通过权利要求16所述的筛选方法而鉴定的。
20.一种药物单位剂型，所述药物单位剂型用于制备对于治疗、预防、改善或推迟免疫相关病症的发作而言有效的药物，并包含治疗有效量的下述a和b中的至少一种或其任意组合作为活性成分a.与腺苷酸环化酶相关蛋白(CAPl)相互作用的化合物；b.CAPl或其任何片段、变体、衍生物、同源物和突变物，所述剂型还可选地包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
全文摘要
本发明涉及腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP1)作为免疫调节靶标的应用。更具体而言，本发明涉及与CAP1相互作用并结合其的化合物(特别是抗-CAP1抗体)，和/或CAP1分子或其任何片段在通过调节Th1/Th2平衡而治疗免疫相关病症中的应用。本发明还提供与CAP1相互作用的免疫调节化合物的筛选方法。
文档编号C07K16/12GK102448990SQ201080023024
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月21日 优先权日2009年3月30日
发明者E·莫里姆, 雅各布·纳帕斯塔克 申请人:普罗塔布有限公司