专利名称：：抑制vegf的稳定和可溶的抗体的制作方法抑制VEGF的稳定和可溶的抗体相关信息本申请要求2008年6月25日提交的US61/133，212、2008年6月25日提交的US61/075,697,2009年2月24日提交的US61/155，041和2008年6月25日提交的US61/075,692的优先权。在整个本说明书中引用的任何专利、专利申请和参考资料的内容以其全文通过引用合并入本文。
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：血管生成牵涉许多种病症的发病机制，所述病症包括实体瘤、眼内新生血管综合征例如增殖性视网膜病或年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman等人J.Biol.Chem.267:10931-10934(1992)；Klagsbrun等人Annu.Rev.Physiol.53217-239(1991)；禾口GarnerA,Vasculardiseases.In:Pathobiologyofoculardisease.Adynamicapproach.GarnerA,KlintworthGK,Eds.第2版MarcelDekker,NY,pp1625-1710(1994))。在实体瘤中，新脉管系统(vasculture)的生长和血管生成允许肿瘤存活，并且已证明肿瘤切片中微血管的密度与乳腺癌和其他癌症的患者存活之间的关系(Weidner等人NEnglJMed324:1-6(1991)；Horak等人Lancet340:1120-1124(1992)；和Macchiarini等人Lancet340145-146(1992))。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成和新生血管形成(neovascularization)的已知的调节剂，并且已显示为与肿瘤和眼内病症相关的新生血管形成的至关重要的介体(Ferrara等人Endocr.Rev.18:4-25(1997))。VEGFmRNA在许多人肿瘤中过表达，并且眼液(eyefluid)中VEGF的浓度与糖尿病性和其他缺血相关视网膜病变患者的血管的活跃增殖的存在高度相关(Berkman等人，JClinInvest91:153-159(1993)；Brown等人HumanPathol.26:86-91(1995)；Brown等人CancerRes.53:4727-4735(1993)；Mattern等人Brit.J.Cancer.73:931-934(1996)；和Dvorak等人AmJ.Pathol.1461029-1039(1995)；Aiello等人N.Engl.J.Med.3311480-1487(1994))。此外，最近的研究已显示在受AMD影响的患者的脉络膜新生血管膜中存在局域性VEGF(Lopez等人Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。抗VEGF中和抗体可用于在裸鼠中抑制多种人肿瘤细胞系的生长并且还可在缺血性视网膜病的模型中抑制眼内血管生成(Kim等人Nature362:841-844(1993)；Warren等人J.Clin.Invest95:1789-1797(1995)；Borgstrom等人CancerRes.56:4032-4039(1996)；和Melnyk等人CancerRes.56:921-924(1996))(Adamis等人Arch.Opthalmol.114:66-71(1996))。因此，需要能够用于治疗实体瘤和各种新生血管眼内疾病的抗VEGF单克隆抗体。发明概述本发明提供了包含来自兔单克隆抗体的CDR的可溶和稳定的抗VEGF免疫结合剂。所述抗体经设计用于诊断和/或治疗VEGF介导的病症。还公开了用于表达本发明的重组抗体的杂交瘤、核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法和所述抗体在医药中的用途。附图概述7图1举例说明了使用Biacore产生的所选择的scFv对hVEGF165的结合动力学(hVEGF165)。图Ia显示获得的关于511max的数据Ka(l/Ms)6.59E+05；SE(ka)1.10E+03；kd(l/s):4.40E-05；SE(kd):6.30E-07；KD(M)6.67E-11。图Ib显示获得的关于578max的数据:Ka(l/Ms):7.00E+05；SE(ka):1.40E+03；kd(l/s):3.07E-04；SE(kd)8.50E-07；KD(M):4.39E-10。图2通过显示578max对人、小鼠和大鼠VEGF的结合动力学举例说明了种特异性。图2a显示获得的关于人VEGF165的数据=Ka(1/Ms)7.00E+05；SE(ka)1.40E+03；kd(l/s)3.07E-04；SE(kd):8.50E-07；KD(M):4.39E-10。图2b显示获得的关于小鼠VEGF164的数据:Ka(l/Ms):1.03E+06；SE(ka):2.30E+03；kd(l/s):4.40E-04；SE(kd):9.40E-07；KD(M)4.^B-IO。图2c显示获得的关于大鼠VEGF164的数据Ka(l/Ms):8.83E+05；SE(ka)2.50E+03；kd(l/s):5.28E-04；SE(kd):1.20E-06；KD(M)5.98E-10。图3举例说明578max对VEGF同种型(hVEGF121和hVEGFllO)的结合动力学。图3a显示获得的关于人VEGF165的数据:Ka(l/Ms)7.00E+05；SE(ka)1.4E+03；kd(l/s)3.07E-04；SE(kd):8.50E-07；KD(M):4.39E-10。图3b显示获得的关于人VEGF121的数据Ka(l/Ms)5.87E+05；SE(ka):1.20E+03；kd(l/s):5.58E-04；SE(kd):9，60E_07；KD(M):9.50E-11。图3c显示获得的关于人VEGFl10的数据:Ka(l/Ms)5.23E+05；SE(ka)1.30E+03；kd(l/s):7.22E-04；SE(kd):8.10E-07；KD(M)1.38E-09。图4描述了578max、578minmax和578wt对hVEGF165的结合动力学。图4a显示获得的关于578max的数据:Ka(l/Ms):7.00E+05；SE(ka):1.40E+03；kd(l/s):3.07E-04；SE(kd)8.50E-07；KD(M):4.39E-10。图4b显示获得的关于578minmax的数据:Ka(l/Ms)8.06E+05；SE(ka)2.10E+03；kd(l/s):5.04E-04；SE(kd):1.10E-06；KD(M)6.25E-10。图4c显示获得的关于578wt-His的数据Ka(l/Ms)8.45E+05；SE(ka)1.60E+03;kd(1/s)1.69E-04；SE(kd):7.60E—07；KD(M)2.OOE-IO0图5举例说明578max、578minmax和578minmax_DHP的热稳定性(通过FT-IR测量去折叠)。图5a:578minmax(ESBA903):Tm=71.1°C；图5b:578minmax_DHP(#961):Tm=70.2°C；图5c:578max(#821):Tm=70.4°C。图6举例说明在热胁迫(图6a:50°C，图6b:60°C，图6c:70°C)30分钟后578衍生物的变性和沉淀。图7举例说明578max、57aninmax和578minmax_DHP的溶解性(通过硫酸铵沉淀法进行测定)。图7a:578max(#821)。V50为27.M%。图7b:578minmax(ESBA903)。V50为28.13。图7c:578minmax_DHP(#961)。V50为32.36%。图8举例说明VEGFR2竞争性ELISA和HUVEC测定(作为测量潜能的方法)。图8aVEGFR2竞争性ELISA中Lucentis与51Imax(#802)的比较。Lucentis的R2:0.9417；ESBA802的R20.9700。Lucentis的EC50:7.137nM；#802的EC50:0.8221nM。图8b:VEGFR2竞争性ELISA中Lucentis与578max(#821)的比较。图8c:HUVEC测定中Lucentis、511maxC_his和534max的比较。Lucentis的R2:0.9399；EP511maxC_his的R2:0.9313，EP534max的R20.7391。Lucentis的EC500.08825nM，511maxC_his的EC50:0.7646nM,534max的EC5063.49nM。图8d:HUVEC测定中Lucentis、578min和578max的比较。Lucentis的R2:0.9419，EP578min的R2:0.8886，EP578max的R2:0.9274。Lucentis的EC50:0.1529nM,578min的EC501.528nM，578max的EC50:0.1031nM。图9举例说明578minmax对由hVEGF165诱导的HUVEC增殖的影响。测定的参数如下hVEGF165浓度0.08nM(3ng/ml)；与VEGF和测试项目的温育96小时。EC50为0.08959nM(对于Lucentis)和0.05516nM(对于578minmax)，而R2为0.9066(对于Lucentis)和0.9622(对于578minmax)。图10举例说明578minmax对由小鼠VEGF164和大鼠VEGF164诱导的HUVEC增殖的影响。测定的参数如下小鼠VEGF164浓度0.08nM(3ng/ml)；大鼠VEGF164浓度0.3nM(ll.3ng/ml)。在VEGF诱导HUVEC增殖的EC90处选择两个浓度；与VEGF和测试项目的温育96小时。图IOa举例说明获得的小鼠VEGF的数据。EC50为0.1196nM(对于V1253)和0.06309nM(对于578minmax)，而R2为0.02744(对于Lucentis)、0.9348(对于V1253)和0.9767(对于EP578minmax)。Lucentis不抑制由小鼠VEGF诱导的HUVEC增殖。图IOb举例说明获得的大鼠VEGF的数据。EC50为1.597nM(对于V1253)和0.06974nM(对于578minmax)，而R2为00，7664(对于V1253)和0.6635(对于578minmax)。图11举例说明在裸豚鼠中使用Miles测定的功效研究(第I部分)。给裸豚鼠静脉内施用染料阿尔玛蓝(almarblue)I0在染料注射后1小时，分别将hVEGF(2.61nM)和Lucentis、ESBA903或#802的预混合物2注射入动物3的皮肤。在注射溶液后1小时，对动物3实施安乐死，收集、清洁毛皮并且使用入射光和透射光对其进行数码拍照。使用ImageJ评估渗入注射位置的伊文斯蓝(EvansBlue)染料的面积，并且对剂量-面积保留(dose-arearetention)作图。图12举例说明在裸豚鼠中使用Miles测定的功效研究(第II部分)。图12a显示获得的关于#803(511max)的结果。EC50为5.990nM并且具有2.060至17.4InM的统计展布(statisticalspread)，而R2为0.5800。图12b显示获得的关于ESBA903(578minmax)的结果。EC50为3.989并且具有1.456至10.93nM的统计展布，而R2为0.3920。图12c显示Lucentis的染料渗漏面积。由于曲线的较差的拟合性，无法计算Lucentis的EC50。图13举例说明在大鼠中使用改进的miles测定的功效研究(预先混合hVEGF165和578minmax(ESBA903))。图13a举例说明阿瓦斯丁(Avastin)对大鼠中VEGF诱导的视网膜血管渗漏的抗渗透性功效-剂量响应。阿瓦斯丁抑制hVEGF-诱导的视网膜血管渗透性。注射之前进行预混合。大约等摩尔量、3倍或10倍过量。*p<0.05(VEGF对BSA)，**p<0.05(阿瓦斯丁处理的对VEGF)。图13b显示ESBA903对大鼠中VEGF诱导的视网膜血管渗漏的抗渗透性功效。剂量响应(预先混合的，ivt)。ESBA903完全抑制hVEGF诱导的视网膜血管渗透性。注射之前进行预混合。大约等摩尔量、3倍或10倍过量。*p<0.05(VEGF对BSA)，<0.05(ESBA903处理的对VEGF)。图14举例说明在大鼠中使用改进的miles测定的功效研究(局部施用578minmax(ESBA903))。在局部施用后测试AL-5U87(ESBA903)对大鼠中VEGF诱导的视网膜血管渗漏的抗渗透性功效。5天的预处理，4滴/天(使用lOng/mlESBA903制剂)。*p<0.05(VEGF对BSA)，**p<0.05(VEGF对AL-51287)，***p=0.060(AL_51287对AL-52667)，##(VEGF对AL-39324)；ρ<0.05(AL-39324对媒介物参照对照)。AL-5I287ESBA903；AL-52657局部媒介物参照对照；AL-39324小分子RTK抑制剂。图15举例说明本文中使用的VH的⑶Rl的界定。发明详述本发明提供了包含来自兔单克隆抗体的CDR的可溶和稳定的抗VEGF免疫结合剂。所述免疫结合剂经设计用于诊断和/或治疗VEGF介导的病症。还公开了用于表达本发明的重组抗体的杂交瘤、核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法和所述抗体在医药中的用途。定义为了可更容易地理解本发明，如下定义某些术语。另外的定义示于本说明书的上下文中。术语“VEGF”是指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子和相关的121、189和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子(如由Leung等人，Science2461306(1989)，和Houck等人，Mol.Endocrin.5=1806(1991)描述的)和这些生长因子的天然存在的等位基因形式和加工的形式。术语“VEGF受体”或“VEGFr”是指VEGF的细胞受体(通常在血管内皮细胞上发现的细胞表面受体)以及保持结合hVEGF的能力的其变体。VEGF受体的一个实例是fms样酪氨酸激酶(fit)，酪氨酸激酶家族的跨膜受体。DeVries等人，Science255:989(1992)；Siibuya等人，Oncogene5:519(1990)。fit受体包含胞外结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域参与VEGF的结合，而胞内结构域参与信号转导。VEGF受体的另一个实例是fIk-I受体(也称为KDR)。Matthews等人，Proc.Nat.Acad.Sci.88:9026(1991)；Terman^A,Oncogene6:1677(1991)；Terman^A,Biochem.Biophys.Res.Commun.187:1579(1992)。VEGF对fit受体的结合导致形成至少2个高分子量复合物(具有205，000和300，000道尔顿的表观分子量)。300，000道尔顿的复合物据信为包含结合至单个VEGF分子的两个受体分子的二聚体。如本文中使用的，术语“兔”是指属于兔科(1印oridae)的动物。本文中使用的术语“抗体”是“免疫球蛋白，，的同义词。根据本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域，Fv(SkerraA.和Pluckthun，Α.(1988)Science240:1038-41)，scFv(Bird,R.Ε.等人(1988)Science242:423-26；Huston,J.S.等人(1988)Proc.Natl.Acad.ki.USA85:5879-83),Fab,(Fab')2或本领域技术人员熟知的其他片段。术语“⑶R”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由KabatΕ.A.等人，(1991)kquencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的⑶R1、⑶R2和⑶R3(⑶RLi、⑶RL2、⑶RL3或Li、L2、L3)，以及重链可变结构域的⑶R2和⑶R3(⑶RH2、⑶RH3或H2、H3)。然而，如本文中使用的，根据下列残基(Kabat编号)定义重链可变结构域的CDRl(CDRHl或Hl)其始于位置沈并且终止于位置36之前。这基本上是由Kabat和Chotia分别定义的⑶RHl的融合物(关于示例说明，也参见图15)。本文中使用的术语“抗体构架”或有时仅称为“构架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；^的分子。此类scFv分子可具有一般结构=NH2-V^接头-Vh-COOH或NH2-Vh-接头C00H。如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置的数目除以进行比较的位置的数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等(I97O)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来提供。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.ApplBiosci.，411-17(1988))，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在mgcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置的数目除以进行比较的位置的数目XlOO的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80%的正相似性。如本文中使用的，术语“保守的序列修饰”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守的序列修饰包括核苷酸和氨基酸置换、添加和缺失。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸置换包括其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代人抗VEGF抗体中的预测的非必需氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合作用的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.ki.USA94:412-417(1997))。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少两个，优选更多的进行比对的氨基酸序列的矩阵产生的氨基酸序列(允许在比对中出现缺口)，其使得可能确定各位置上出现频率最高的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置上出现频率最高的氨基酸的序列。如果两个或更多个氨基酸等同地出现在单个位置上，那么共有序列包括两个或所有此类氨基酸。可在不同水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基水平等上展示保守性或变异性。残基可展示相同残基的保守性或可在种类水平上保守。氨基酸种类的实例包括具有下列的氨基酸种类极性的但不带电荷的R基团(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基团(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基团(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基团(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸种类(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他种类对于本领域技术人员来说是已知的并且可使用结构测定法或其他数据来定义以估量可置换性。在该意义上，可置换的氨基酸可以指可在该位置上进行置换并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，将认识到，相同种类的氨基酸在它们的生物物理性质上可具有一定程度的不同。例如，将认识到，某些疏水性R基团(例如，丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸)比其他疏水性R基团(例如，缬氨酸或亮氨酸)更加亲水(即，具有更高的亲水性或更低的疏水性)。相对亲水性或疏水性可使用本领域公知的方法(参见，例如，Rose等人，Science,229834-838(1985)和Cornette等人，J.Mol.Biol.，195:659-685(1987))来测定。如本文中所使用的，当一个氨基酸序列(例如，第一￥11或八序列)与一个或多个另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个VH或VL序列)比对时，可将一个序列(例如，第一Vh或\序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”相比较。如本文中所使用的，“相应位置”表示当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性或百分数相似性时进行比较的序列中的等同位置。如本文中所使用的，术语“抗体数据库”是指两个或更多个抗体氨基酸序列(“多个”序列)的集合，通常是指数十个、数百个或甚至数千个抗体氨基酸序列的集合。抗体数据库可存储例如抗体Vh区、抗体\区或两者的集合的氨基酸序列，或可存储由Vh和\区域组成的scFv序列的集合。优选，可将数据库存储在可检索的、固定的介质中，例如计算机上可检索的计算机程序中。在一个实施方案中，抗体数据库是包含或由种系抗体序列组成的数据库。在另一个实施方案中，抗体数据库是包含或由成熟(即，表达的)抗体序列组成的数据库(例如，成熟抗体序列的Kabat数据库，例如KBD数据库)。在另一个实施方案中，抗体数据库包含或由功能性选择的序列(例如，根据QC测定选择的序列)组成。术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限于(i)Fab片段，由\、VH、CjnCHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab(参见，FundamentalImmunology(Paul编辑，3.sup.rded.1993)；(iv)由Vh和ChI结构域组成的Fd片段；(ν)由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其由Vh或八结构域组成，Camelid(参见Hamers-Casterman等人，Nature363:446-448(1993)和Dumoulin等人，ProteinScience11:500-515(2002))或Shark抗体(例如，sharkIg-NARsNanobodieS)；和(Vii)纳米抗体(Nanobody)，包含可变结构域和两个恒定结构域的重链区。如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是稳定性(例如，热稳定性)。在另一个实施方案中，功能性质是溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功能性质是非聚集性。在另一个实施方案中，功能性质是蛋白质表达(例如，在原核细胞中)。在另一个实施方案中，功能性质是在相应的纯化方法中内含体溶解后的重折叠效率。在某些实施方案中，抗原结合亲和力不是期望提高的功能性质。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如，VEGF)上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10_7m，例如大约小于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更小的亲和力(Kd)结合。术语“KD”或“K/’是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约1(ΓΜ，例如小于大约10_%、101或ΙΟ,Μ或更小的解离平衡常数(Kd)结合VEGF，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIAC0RE仪中测定的。术语“中和VEGF”、“抑制VEGF”和“阻断VEGF”可互换使用，表示本发明的抗体阻止VEGF与一个或多个VEGF受体例如VEGFR-I和/或VEGFR-2相互作用(从而例如引发信号转导)的能力。本文中使用的“重组免疫结合剂”是指通过从重组DNA表达而产生的免疫结合剂。如本文中使用的，”嵌合的”免疫结合剂具有与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源的重链和/或轻链的部分，同时链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列同一或同源。本文中使用的人源化抗体是一种嵌合抗体。如本文中使用的，”人源化抗体”是使用重组DNA技术合成以规避对外来抗原的免疫应答的免疫结合剂。人源化是用于减少异种来源的单克隆抗体的免疫原性的良好建立的技术。这包括受体构架的选择(优选人受体构架)、待插入受体构架的来自供体免疫结合剂的CDR的范围和来自供体构架的残基至受体构架内的置换。用于将CDR移植入人受体构架的一般方法已由Winter在美国专利5，225，539(其以其全文通过引用合并入本文)中公开。US6，407，213(其教导以其全文通过引用合并入本文)公开了构架的许多氨基酸位置，其中来自供体免疫结合剂的置换是优选的。术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在已将它们引入其中的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而它们可随宿主基因组一起复制。术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)；月市炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Mi^ptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NSO细胞。术语“治疗”、“疗法”和“医治”是指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法利用给有此治疗需要的受试者(例如，患有VEGF介导的病症的受试者或最终可能获得这样的病症的受试者)施用本发明的抗体以预防、治愈、延迟、减轻病症或复发性病症的严重度或改善其一个或多个症状，或以延长在这样的治疗不存在的情况下所预期的受试者的存活。术语"VEGF-介导的病症"是指其症状或疾病状态的发作、进展或持续需要VEGF的参与的任何病症。示例性VEGF介导的病症包括但不限于，年龄相关黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性细胞瘤(arrhenoblastoma)、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经鞘瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、肾母细胞瘤(Wilm'stumor)、肾细胞癌、前列腺癌、与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)相关的异常血管增生、水肿(edema)(例如与脑肿瘤相关的水肿)、麦格综合征(Meigs'syndrome)、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。术语"有效剂量"或"有效给药量"是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。对于该用途有效的量将取决于待治疗的病症的严重度和患者自己的免疫系统的总体状态。术语“受试者”是指任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有VEGF介导的病症的受试者。如本文中使用的，术语〃Min-graft"或〃min"是指通过将来自兔可变结构域的兔⑶R移植入天然存在的人受体构架(FW1.4，SEQIDNo.172)而产生的人源化的可变结构域。在构架区中不进行改变。就期望的功能性质(溶解性和稳定性)预先选择构架本身。如本文中使用的，术语〃Max-graft"或〃max"是指通过将来自兔可变结构域的兔CDR移植入“兔源化的(rabbitized)，，人受体构架〃RabTor”(rFWl.4，SEQIDNo.173)或移植入称为rFWl.4(v2)的其衍生物(SEQIDNo.174)而产生的人源化的可变结构域。通过整合通常参与兔可变结构域结构和稳定性的构架位置处的保守兔残基(另外其在其他物种中是高度可变的)来制备"RabTor"构架，目的在于产生可通用的构架，所述构架几乎接受任何兔⑶R组而无需移植供体构架残基(除了在这样的位置上，所述位置在它们的假定祖先序列中不同，例如在体细胞高度突变过程中被改变从而可能促进抗原结合)。假定的祖先序列定义为最接近的兔种系对应物，并且在不能确定最接近的种系对应物的情况下，定义为兔亚型共有序列或具有高相似性百分数的兔序列的共有序列。如本文中使用的，术语〃Min-Max"或〃minmax"是指包含"Min-graft”可变轻链与"Max-graft"可变重链的人源化可变结构域。如本文中使用的，术语〃Max-Min"或〃maxmin"是指包含"Max-graft"可变轻链与"Min-graft"可变重链的人源化可变结构域。不同的命名法被用于产生的免疫结合剂。此类免疫结合剂通常利用编号(例如#578)来标识。在使用前缀例如EP或Epi的情况下(例如，EP578，其与Epi578相同)，表示相同的免疫结合剂。有时，免疫结合剂接受由前缀"ESBA"标识的第二名称。例如ESBA903表示与578minmax或EP578minmax或Epi578minmax相同的免疫结合剂。除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。在下列部分更详细地描述本发明的多个方面。应理解，可随意组合不同实施方案、参数和范围。此外，取决于具体的实施方案，可不使用选择的定义、实施方案或范围。抗VEGF免疫结合剂在一个方面，本发明提供了结合VEGF，从而适合于在体内阻断VEGF的功能的免疫结合剂。此类免疫结合剂的CDR来源于从用人VEGF和/或其片段(SEQIDNO.1)免疫的兔获得的兔抗VEGF单克隆抗体。就我们所知，这是首次从兔获得单克隆抗VEGF抗体并且对其进行了详尽地表征。令人惊讶地，发现亲和力(Kd)极高。在某些实施方案中，本发明提供了特异性结合VEGF的免疫结合剂，其包含CDRH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3氨基酸序列中的至少一个。用于本发明的免疫结合剂的示例性⑶R氨基酸序列示于SEQIDNo:2-72(表1-6)中。表1.本发明的抗VEGF免疫结合剂的⑶RHl氨基酸序列。权利要求1.中和人VEGF并且包含兔⑶R的重组免疫结合剂，其包含可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)。2.权利要求1的免疫结合剂，其为嵌合免疫结合剂。3.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其为人源化的。4.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO14,SEQIDNO26,SEQIDNO37,SEQIDNO49,SEQIDN0:60禾口SEQIDNO:71的共有序列具有至少80%的相似性的⑶R。5.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO2,SEQIDNO3,SEQIDNO:15，SEQIDNO:27，SEQIDNO:38，SEQIDNO50和SEQIDNO61的序列具有至少80%的相似性的⑶R。6.权利要求5的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:2,SEQIDN0:15和SEQIDNO:27组成的组中的CDR和/或其中所述VL包含由SEQIDNO:38，SEQIDNO:50和SEQIDNO61组成的组中的CDR。7.权利要求5的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:3,SEQIDNO:15和SEQIDNO:27组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO38,SEQIDN0:50和SEQIDNO61组成的组中的⑶R。8.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:4，SEQIDNO16,SEQIDNO28,SEQIDNO39,SEQIDNO:51禾口SEQIDNO:62的序列具有至少80%的相似性的⑶R。9.权利要求8的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO4,SEQIDNO16,SEQIDNOJ8组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO39,SEQIDN0:51禾口SEQIDNO:62组成的组中的CDR。10.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:5,SEQIDNO:17,SEQIDNO29,SEQIDNO40,SEQIDN0:52禾口SEQIDNO:63的序列具有至少80%的相似性的⑶R。11.权利要求10的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:5,SEQIDNO17,SEQIDNO:组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO40,SEQIDN0:52和SEQIDN0:63组成的组中的CDR。12.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDN0:6，SEQIDNO:18,SEQIDNO30,SEQIDN0:41，SEQIDNO:53禾口SEQIDNO:64的序列具有至少80%的相似性的⑶R。13.权利要求12的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:6，SEQIDN0:18和SEQIDNO:30组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:41，SEQIDNO:53和SEQIDNO:64组成的组中的CDR。14.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:7,SEQIDNO:19,SEQIDN0:31，SEQIDNO42,SEQIDNO:54禾口SEQIDNO:65的序列具有至少80%的相似性的⑶R。15.权利要求14的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO-J,SEQIDN0:19和SEQIDNO:31组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:42，SEQIDN0:54和SEQIDNO:65组成的组中的CDR。16.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:8，SEQIDNO:20,SEQIDNO32,SEQIDNO43,SEQIDN0:55禾口SEQIDNO:66的序列具有至少80%的相似性的⑶R。17.权利要求16的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:8，SEQIDNO:20和SEQIDNO:32组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:43，SEQIDNO:55和SEQIDNO:66组成的组中的CDR。18.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:9,SEQIDNO:21,SEQIDNO33,SEQIDNO44,SEQIDN0:56禾口SEQIDNO:67的序列具有至少80%的相似性的⑶R。19.权利要求18的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO:9，SEQIDNO:21和SEQIDNO:33组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:44，SEQIDNO56禾口SEQIDNO:67组成的组中的CDR。20.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:10，SEQIDNO22,SEQIDNO34,SEQIDNO45,SEQIDNO57禾口SEQIDNO:68的序列具有至少80%的相似性的⑶R。21.权利要求20的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO10,SEQIDNO:22和SEQIDNO:；34组成的组中的CDR和/或所述VL包含由SEQIDNO:45，SEQIDNO:57和SEQIDNO68组成的组中的CDR。22.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO:11，SEQIDNO13,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:35，SEQIDNO:46，SEQIDNO58和SEQIDNO69的序列具有至少80%的相似性的CDR023.权利要求22的免疫结合剂，其中所述VH包含⑴由SEQIDNO:11，SEQIDNO:23和SEQIDNO35组成的组中的CDR；(ii)由SEQIDNO:11，SEQIDNO:25和SEQIDNO；35组成的组中的CDR;(iii)由SEQIDNO13,SEQIDNO23和SEQIDNO:；35组成的组中的CDR；或(iv)由SEQIDNO:13，SEQIDNO25和SEQIDNO35组成的组中的CDR024.权利要求23的免疫结合剂，其中所述VL包含由SEQIDNO:46，SEQIDNO:58和SEQIDNO:69组成的组中的CDR。25.权利要求1至4的任一项的免疫结合剂，其包含至少一个与选自SEQIDNO12,SEQIDNO24,SEQIDNO:36，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48，SEQIDNO59和SEQIDNO70的序列具有至少80%的相似性的⑶R。26.权利要求25的免疫结合剂，其中所述VH包含由SEQIDNO12,SEQIDNO:和SEQIDNO:36组成的组中的CDR和/或所述VL包含(i)由SEQIDN0:47，SEQIDNO:59和SEQIDNO:70组成的组中的CDR；或(ii)由SEQIDNO:48，SEQIDNO59禾口SEQIDN0:70组成的组中的CDR。27.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其包含与SEQIDNO:169的序列具有至少80%的序列同一性的重链可变区构架序列。28.权利要求27的免疫结合剂，其中所述重链可变区构架是SEQIDNO:170或SEQIDNO:171。29.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其在根据AHo编号系统的重链可变区的位置1、83或87处具有缺失。30.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其在根据AHo编号系统的重链可变区的位置2，12，24，25，46，54，55，83，84，87，89，103，105，108或144的至少一个位置处具有置换。31.权利要求30的免疫结合剂，其中所述置换选自(a)位置2处的谷氨酰胺；(b)位置12处的丝氨酸；(c)位置M处的苏氨酸；(d)位置25处的缬氨酸；(e)位置46处的亮氨酸；(f)位置讨处的酪氨酸；(g)位置阳处的异亮氨酸；(h)位置83处的丙氨酸；(i)位置84处的天冬酰胺；(j)位置87处的丙氨酸或亮氨酸；(k)位置89处的丙氨酸或亮氨酸；(1)位置103处的丝氨酸或苏氨酸；(m)位置105处的苯丙氨酸；(η)位置108处的精氨酸；和(ο)位置144处的丝氨酸或苏氨酸。32.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其包含与SEQIDNO:167的序列具有至少85%的序列同一性的轻链可变区构架序列。33.权利要求30的免疫结合剂，其中所述轻链可变区构架是SEQIDNO:167或SEQIDNO:168。34.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其在根据AHo编号系统的轻链可变区的位置1、2或15的至少一个位置处具有置换。35.权利要求34的免疫结合剂，其中所述置换选自(a)位置1处的天冬氨酸；(b)位置2处的缬氨酸；(c)位置15处的苏氨酸。36.权利要求5-7或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:107至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:72至少80%相似的轻链可变区。37.权利要求8-9或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:109至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:73至少80%相似的轻链可变区。38.权利要求10-11或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:110至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:74至少80%相似的轻链可变区。39.权利要求12-13或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:111至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:75至少80%相似的轻链可变区。40.权利要求14-15或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:112至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:76至少80%相似的轻链可变区。41.权利要求16-17或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:113至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:77至少80%相似的轻链可变区。42.权利要求41的免疫结合剂，其与SEQIDNO178，SEQIDNO:179或SEQIDNO:180具有至少80%的同一性。43.权利要求18-19或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:114至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:78至少80%相似的轻链可变区。44.权利要求20-21或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:115至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:79至少80%相似的轻链可变区。45.权利要求44的免疫结合剂，其与SEQIDNO:177具有至少80%的同一性。46.权利要求22-M或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:116至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:80至少80%相似的轻链可变区。47.权利要求2546或27-35的任一项的免疫结合剂，其包含含有与SEQIDNO:117至少80%相似的氨基酸序列的重链可变区和/或与SEQIDNO:81至少80%相似的轻链可变区。48.权利要求47的免疫结合剂，其与SEQIDNO:176具有至少80%的同一性。49.与前述权利要求的任一项的免疫结合剂竞争对人VEGF的结合的免疫结合剂。50.一种免疫结合剂，其以至少IO7M-1的亲和力结合被前述权利要求的任一项的免疫结合剂识别的人VEGF上的表位。51.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其特异性结合人和大鼠/小鼠VEGF。52.前述权利要求的任一项的免疫结合剂，其是抗体、scFv、Fab或Dab。53.包含前述权利要求的任一项的免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。54.编码前述权利要求的任一项的免疫结合剂的分离的核酸分子。55.包含权利要求M的核酸分子的表达载体。56.包含权利要求55的表达载体的宿主细胞。57.治疗或预防受试者中的人VEGF介导的疾病的方法，其包括给受试者施用前述权利要求的任一项的免疫结合剂以便治疗所述受试者的VEGF介导的疾病。58.权利要求57的方法，其中局部施用所述免疫结合剂。59.权利要求57或58的方法，其中所述VEGF介导的疾病选自年龄相关黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、男性细胞瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经鞘瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、前列腺癌、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)、麦格综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。60.产生包含SEQIDNo60-166和SEQIDNo.175-180中所示的任一个氨基酸序列的抗体的杂交瘤。61.适合用于产生或鉴定与大鼠/小鼠和人VEGF或其部分交叉反应的免疫结合剂的免疫原。62.权利要求61的免疫原，其具有SEQIDNo.1。63.制备与大鼠/小鼠和人VEGF交叉反应的免疫结合剂的方法，其中所述方法使用权利要求61的免疫原。全文摘要本发明涉及包含来自兔单克隆抗体的CDR的可溶和稳定的抗VEGF免疫结合剂。所述抗体经设计用于诊断和/或治疗VEGF介导的病症。还公开了用于表达本发明的重组抗体的杂交瘤、核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法和所述抗体在医药中的用途。文档编号A61K39/395GK102143976SQ200980124313公开日2011年8月3日申请日期2009年6月25日优先权日2008年6月25日发明者D·厄里什,L·波拉斯,T·冈德申请人:艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司