一种真核重组表达载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种真核重组表达载体及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 天然或普通重组的生物活性蛋白在体内半衰期非常短，以普通重组IL-2为例， 其在体内半衰期仅为6. 9分钟，在动物实验或临床研究中需要反复给药；又如小分子抗体 Fab (由完整的轻链和Fd构成）、Fv (由VH和VL构成）、ScFv (单链抗体，VH和VL之间由 一连接肽连接而成）或单域抗体（仅由VH组成）等，由于血楽半衰期短，稳定性不高，不能 产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应（ADCC效应）等问题，大大限制了蛋白类药物的临 床应用。
[0003]目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长蛋白类药物的半衰期。抗体的Fc 端负责抗体的效应功能，如激活补体、结合Fc受体、穿越胎盘等，IgG的Fc结构域可形成多 聚合分子，将生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区结合形成Fc融合蛋白，能使重组 蛋白具有更强的抗原结合力，可以增加蛋白类药物在血液中的半衰期，利于蛋白作为治疗 药物在临床中的实际应用。
[0004] 有报道称，IFNa2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因（IFNa2b_Fc Y )在毕赤 酵母中以二聚体形式分泌表达后，进行大鼠皮下注射，循环血液中半衰期达65h，血液中存 留时间120h以上，比商品重组干扰素（IFNa2b)的体内半衰期延长约8倍，血液存留时间延 长10倍，显示了其良好的临床应用前景。
[0005] 然而，不同Fc片段的融合蛋白对蛋白药物的生物活性可能有一定影响，t匕 如，IFNa2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因（IFNa2b-Fc Y )表达的融合蛋白 IFNa2b-FcY的抗病毒活性较单纯的IFNa2b抗病毒活性低，即不同Fcy片段的融合蛋白对 IFNa2b抗病毒活性有一定影响，其中，IFNa2b-Fc Y 2所受影响最小，相对于单纯的IFNa2b， IFNa2b-Fc Y 2的抗病毒活性降低了 2. 3倍。
[0006] 因此，有必要提供一种能延长蛋白类药物在体内的半衰期、又对蛋白质生物活性 影响小的方法。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种真核重组表达载体，该真核重组表达载体含 有鼠IgG2b-Fc基因，能表达含有鼠IgG2b-Fc标签的融合蛋白，由于IgG2b-Fc段的存在，所 述融合蛋白不仅具有较长的体内半衰期，稳定性更高，更具有生物活性蛋白质完整的功能； 本发明还提供了一种真核重组表达载体的制备方法和应用。
[0008] 第一方面，本发明提供了一种真核重组表达载体，所述真核重组表达载体为在真 核表达载体的多克隆位点插入鼠IgG2b-Fc基因，所述真核表达载体为pcDNA3. 1质粒、P3X 质粒或plexm质粒。
[0009] 优选地，所述鼠IgG2b-Fc基因的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 优选地，所述真核表达载体的多克隆位点为pcDNA3. 1质粒的Not I和Xba I酶 切位点。
[0011] 目前，一般将有生物活性蛋白的基因与Fc段基因通过重叠PCR连接好后，再构 建到表达载体中，比较费时，费力；本发明提供的真核重组表达载体含有鼠IgG2b-Fc基 因，可以直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，可快速、高效的表达含鼠鼠 IgG2b-Fc端的融合蛋白；表达Fc融合蛋白中，生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区 结合，对于小分子抗体、抗原、细胞因子等蛋白类药物来说，融合蛋白因鼠IgG2b-Fc的二硫 键作用形成二聚体，可提高蛋白类药物的稳定性和免疫原性，增加其在血液中的半衰期，利 于蛋白类药物在临床中的实际应用。
[0012] 其次，该表达载体表达的IgG2b_Fc片段来自小鼠，无免疫原性或免疫原性很低， 可直接免疫小鼠用于鼠单克隆抗体或多克隆抗体的制备；而且，由于Fc融合蛋白可用 Protein A或Protein G进行纯化，该真核载体表达的融合蛋白的纯化方法简单、且纯度高， 该鼠IgG2b-Fc融合蛋白还可用抗小鼠IgG抗体的二抗进行检测，检测方便。
[0013] 此外，根据插入本发明提供的真核重组表达载体中的基因的不同，该插入基因表 达的蛋白与其配体的特异性相互作用也不同，加上鼠IgG2b-Fc的生物学效应，融合蛋白可 以特异的靶向某些特定目标，并发挥ADCC、固定补体及免疫调节等作用，本发明提供的真核 重组表达载体中的IgG2b-Fc标签不影响插入基因的表达，以及表达后融合蛋白的生物活 性。
[0014] 小鼠IgG共有4个亚类分别为是IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3, IgG可通过经典途 径活化补体，然而，不同补体对不同IgG亚类的亲和力不同，比如FcrRI (CD64)对鼠的IgG2a 和IgG3亲和力高，一般来说，小鼠IgG固定补体的能力依次为IgG2b > IgG2a > IgG3,其 中，小鼠的IgGl无固定补体的能力；本发明采用IgG2b构建了可以表达IgG2b-Fc的真核重 组表达载体，有利于融合蛋白激活补体活化途径。
[0015] 第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的真核重组表达载体的制备方法， 包括如下步骤：
[0016] (1)、提取鼠脾脏的总RNA，随后进行反转录合成cDNA ;
[0017] (2)、设计鼠IgG2b Fc的上游引物和下游引物，并以步骤（1)所得cDNA为模板，扩 增鼠IgG2b Fc目的基因片段；
[0018] (3)、取p⑶NA3. 1质粒，将步骤（2)扩增得到的鼠IgG2b Fc目的基因片段和所述 PCDNA3. 1质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述真 核重组表达载体，所述真核重组表达载体为含有鼠IgG2b-Fc基因的pcDNA3. 1表达载体。
[0019] 优选地，所述鼠IgG2b Fc的上游引物的碱基序列如SEQ ID N0:2所示，所述鼠 IgG2b Fc的下游引物的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。
[0020] 优选地，所述步骤（3)中，双酶切反应所采用的内切酶为Not I和Xba I内切酶。
[0021] 优选地，所述步骤（3)中，所述鼠IgG2b-Fc基因的碱基序列如SEQ ID N0:1所示。
[0022] 第三方面，本发明提供了一种含有如第一方面所述的真核重组表达载体的宿主细 胞，所述宿主细胞为CH0或293细胞。
[0023] 第四方面，本发明提供了如第一方面所