小鼠crabp2基因真核表达载体的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种载体构建方法，具体地说是一种小鼠CRABP2基因真核表达载体 的构建及应用。
【背景技术】
[0002] 维生素A是人体生长发育及维持机体生命活动所不可或缺的一种微量营养素，它 除了在细胞分化方面具有明确的作用W外，同时还参与如免疫反应、食欲和生长等许多其 它生理生化过程。其中，其活性代谢物视黄酸通过调节许多目标基因的转录来调节细胞分 化和增殖等许多生理生化过程，但要充分发挥此功能必须和相应的蛋白相结合，即细胞视 黄酸结合蛋白（CRABPs)基因家族。
[0003] Tang等研究发现，CRABPs基因家族在猪胚胎发育不同时期的骨骼肌里呈现差异 表达，而CRAPB2是CRABPs基因家族的一名成员。早期研究发现，在小鼠胚胎发育时期，该 基因在多个组织器官都有表达，CRAPB2基因在胚胎发育过程中发挥重要作用，同时可能对 肌肉发育起调控作用，而小鼠来源的骨骼肌细胞系C2C12,是用作研究体外肌细胞分化和肌 肉发育常用的一种重要细胞模型。
[0004] 在细胞水平上研究证明CRABP2基因参与骨骼肌的肌纤维分化和肌肉发育，首先 需要研究CRABP2基因对C2C12细胞的作用，因此构建小鼠CRABP2基因的真核表达载体至 关重要。
【发明内容】
阳0化]为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种小鼠CRABP2基因真核表达载 体的构建W及该表达载体的应用。
[0006] 一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，包括W下步骤：
[0007](1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉组织中的总RNA，合成CDNA第一链后，W合成的 CDNA第一链为模板进行扩增，获得CRABP2基因；
[000引 似、将步骤（1)中扩增后获得的产物克隆到pGEM-Teasy载体，挑选阳性重组子 测序，获得基因序列SEQIDN0:1，将测序获得的阳性重组子命名为PGEM-T-CRABP2;
[0009] (3)、将步骤似中的阳性重组子PGEM-T-CRABP2与真核表达载体PCDNA3. 1 (+)连 接、转化，得到小鼠CRABP2真核表达载体PCDNA3. 1-CRABP2的重组质粒。
[0010] 优选地，所述步骤（1)扩增是采用RT-PCR扩增技术，且扩增CRABP2基因时，设计 1对引物如下： 阳011 ]上游引物：5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0012] 下游引物：5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。
[0013] 优选地，两条所述引物的5'端分别加上EcoRV和NotI内切酶的酶切位点。
[0014] 优选地，将获得的CRABP2基因置于1. 5%琼脂糖凝胶电泳、检测后于紫外仪下切 割目的片段并使用凝胶回收试剂盒回收，回收产物克隆到pGEM-Teasy载体。 阳O巧]优选地，所述步骤（3)，阳性重组子PGEM-T-CRABP2与真核表达载体PCDNA3. 1 (+) 分别经限制性内切酶EcoRV和NotI双酶切进行连接后，转化至大肠杆菌D册a感受态细 胞，通过抗性基因序列筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定后，获得小鼠CRABP2真核表达 载体PCDNA3. 1-CRABP2的重组质粒。
[0016] 优选地，所述抗性基因序列是PCDNA3. 1(+)载体所包含的Amp抗性基因序列。
[0017] 一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，用于研究CRABP2基因在肌肉发育中 的调控作用。 阳01引优选地，小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，包括如下步骤：
[0019] (1)、从所述小鼠CRABP2基因真核表达载体中挑选正确克隆的阳性菌株扩大培 养，提取无内毒素质粒；
[0020] (2)、将步骤（1)获得的无内毒素质粒转染至C2C12细胞，于37°C培养4-化后弃去 转染混合液，加入含血清的DMEM生长培养基继续在37 °C溫度条件，C〇2为5%的培养箱内进 行培养；
[0021] (3)、转染达3天后，收集细胞抽提RNA后验证分析小鼠CRABP2基因在C2C12细胞 中的表达情况。
[0022] 优选地，所述步骤（2)中，细胞融合度达到60% -70%时进行转染。
[0023] 本发明一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用，优点是：利用一对引物 进行PCR扩增，克隆得到小鼠CRABP2基因的完整编码区，并成功构建小鼠CRABP2基因真核 表达载体。该真核表达载体构建方法简单易行；验证CRABP2基因在转染后C2C12细胞中的 表达，为研究该基因在肌肉发育中的作用奠定基础，同时为将来运用于遗传标记辅助育种 提供重要依据。
【附图说明】
[0024] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明： 阳02引图1为本发明所述CRABP2基因的RT-PCR扩增图； 阳0%] 图中：M为10化PMarker, 1-5为PCR产物，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析得到 512bp的条带，与预期目的片段大小一致；
[0027] 图2为本发明所述的载体酶切鉴定图；
[0028] 图中：M为1000 bpMarker,
[0029] 1为限制性内切酶EcoRV和NotI双酶切PGEM-T-CRABP2重组质粒双酶切后，出现 两条片段，约SOObp和3000bp，酶切片段大小与预期值相符；
[0030] 2为限制性内切酶EcoRV和Not I双酶切PCDNA3. 1(+)质粒；
[0031] 图3为本发明所述重组质粒的阳性克隆测序图；
[0032] 图4为本发明重组质粒的阳性克隆测序与基因序列比对结果； 阳03引图5为本发明所述的PCDNA3. 1-CRABP2载体瞬时转染C2C12细胞后Real time PCR 检测分析图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及鉴定的原理是：将CRABP2 基因T-A克隆到pGEM-T easy载体上，再通过亚克隆的方法定向插入到真核表达载体PCDNA3. 1(+)中，然后将获得的表达载体瞬时转染至小鼠骨骼肌C2C12细胞系，验证CRABP2 基因转染后在C2C12细胞中的表达。
[0035](一）一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建与鉴定，包括W下步骤：
[0036] (1)、TRIzol法提取总RNA:用研鉢磨碎小鼠肌肉组织样品，每50-lOOmg组织加入 Iml裂解液，PBS漂洗细胞后，加入ImlTRIzol试剂（购自invitrogen公司），吹打混匀， 移入1. 5mlEP管中，然后加入氯仿抽提，用75%的乙醇充分洗涂沉淀，离屯、后去上清，干燥 后用DEPC水溶解，-70°C保存备用；
[0037] 似、CDNA第一链的合成：取步骤（1)中获得的总RNA采用反转录试剂盒反转录合 成第一链cDNA;例如：20y1反应体系中加入5y1RNA溶液、1y1OligoUy1dNTP，65°C 反应 5min，迅速放冰上冷却；再加入 4]i化UfferJy1DTT、1Ji1foiaseinhibitor, 37°C反 应2min后加入IyI逆转录酶，37°C反应60min;80°C15min终止反应，得到cDNA，于-20°C 冰箱保存；
[0038](3)、目的基因片段的体外扩增及纯化
[0039] 将步骤似中获得的第一链CDNA作为模板，采用RT-PCR扩增技术，获得CRABP2 基因，然后将CRABP2基因置于1. 5%琼脂糖凝胶电泳、检测，于紫外仪下切割目的片段并使 用凝胶回收试剂盒回收（如图1);
[0040] 扩增CRABP2基因时，应用PrimerPremier5.0软件设计引物对：上游引物： 5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0041]下游引物：5' CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT 3'
[0042] 同时在两条引物5'端分别加上EcoRV和NotI内切酶的酶切位点；PCR反应总体 积为 20yL，其中含 10Xbuffer(Mg2〇，75ymol/L的dNTP，0. 3ymol/L的引物，1.OULATaq DNA聚合酶，cDNA模板为50ng;PCR扩增程序是：95°C5min预变性，95°C30s变性，ere30s 进行退火，然后72°C延伸30s，共进行30个循环，最后72°C延伸5min。
[0043](4)、小鼠CRABP2基因真核表达质粒构建
[0044] ①、将步骤（3)纯化PCR产物与pGEM-Teasy载体（购自Promega公司）连接， 连接