专利名称：生物载体、生物检测器以及生物换能器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物载体，特别是一种蛋白质类的、可抓取并留存诸如有气味物质、药物或色素等低分子量化学物质的生物载体。本发明还涉及一种生物检测器，特别是一种包含蛋白质类生物载体的、可检测化学物质与该生物载体的结合的生物检测器。本发明还涉及一种生物换能器系统，特别是一种包含蛋白质类生物载体的、能够在检测到化学物质与该生物载体的结合时产生一电子信号的生物换能器系统。本发明还涉及上述装置的用途。
背景技术：
目前，人工嗅觉的市售仪器是相当复杂而昂贵的。传统上，以数组式化学感测方式是通过一检测器一分析物的方式进行感测的，这种方式有一些缺点。例如，与所要感测的配位体(ligands)具有高选择性的结合物质很罕见且难以找到。事实上，现今系统的检测专一性只针对少数几样配位体。另外，其输出须经PC之类的硬件加以处理，而且，当应用于多种分析物时，其输出常会非常复杂。目前有几种利用化学感测技术的”人工嗅觉”系统，然而，由于价格高昂且所得信息有限，因此，在现今平台的实际应用上受到阻碍。另一种感测方式为仿真各种生物传感器的生物系统，而所谓生物传感器就是指生物或生物衍生的感测装置。为了设计第二代的生物传感器以满足更多需求，不论在家用测试或工厂在线监测上，已经利用市售口袋型葡萄糖生物传感器来作为重要的标准。因此，目前或未来可期的可携式仪器可由使用者利用感测元件芯片(chip)的置换来设计自己所需的生物传感器。此种装置首见于如美国Microsensor微传感器系统公司所制造的“HAZMATCAD”产品中、加拿大Cyrano科学公司所提供的”Cyranose 320”产品中、以及美国Sandia国家实验室所发表的“ChemLab on a Chip(芯片上的化学实验室)”。尽管如此，这些人工嗅觉的延伸应用仍受限于感测元件的种类，难以大规模制造并以便宜价格销售。
在生物系统中，气味的辨认首先发生于气味分子与某些器官或组织内的特定蛋白质受体上结合时。在一方法中，利用生物材料作为各种感测技术的电子鼻的一部分，因此，生物材料的选择很多样化。较佳的生物材料可为纯化的嗅觉受体(如Wu，Biosens.Bioelectron.149(1999)所示)、抗体(如Wong et al.，Biosens.Bioelectron.179(2002)所示)、鱼鳞(如Lundstrom and Svensson，Biosens.Bioelectron.13689(1998)所示)、昆虫触须(如Schroth et al.，Electrochimica Acta 443821(1999)所示)、以及合成肽(synthetic peptides)(如Wu and Lo，J.Biotech.8063(2000)所示。然而，从成本与实用性等因素考虑，这些系统似乎都难以用于工业生产上。因此，有必要寻求理想的生物材料来进行广范围的感测应用。
发明内容
本发明首先欲提供一种生物载体，它是通过其它方式来捕捉诸如有气味物质、药物或色素等化学物质。
本发明还欲提供一种生物检测器，其适合于大规模制造并可以便宜价格销售。
本发明另外还欲提供一种生物换能器系统，其适用于多种感测应用。
本发明的上述目的是这样实现的本发明首先提供了一种生物载体，其用来与一特定配位体结合，其包括一固态支撑物；以及一蛋白质基体，所述蛋白质基体由所述固态支撑物收置，可与所述特定配位体结合。其中所述蛋白质基体包括疏水性分子结合蛋白家族(lipocalin protein family)与其重组功能同系物(recombinant functionalhomologues)。
所述固态支撑物，举例而言，可为一抛弃式生物芯片(bio-chip)或一可重复使用的容器。
本发明的生物载体尤其适合于与分子量小于1000道尔顿(Daltons)的特定配位体相结合。该特定配位体的实例包括有气味物质、药物与色素。例如，2-苯基乙基醇(2-phenylethyl alcohol)、乙酸2-苯基乙基酯(2-phenylethyl acetate)、苯乙酸酯(phenylacetate)、丙丁酸酯(propylbutyrate)、己丁酸酯(hexylbutyrate)、苄丁酸酯(benzylbutyrate)、丙巴豆酸酯(propyltiglate)、己巴豆酸酯(hexyltiglate)、以及苄巴豆酸酯(benzyltiglate)。
所述蛋白质基体的一个实例为主要尿蛋白(major urinary protein(MUP))。
本发明还提供了一种生物检测器，其用来检测一特定配位体之结合，包括一压电基材，由于受到一机械应力而产生电荷；以及一蛋白质基体，该蛋白质基体固定于所述压电基材上，当与所述特定配位体结合时提供上述机械应力至所述压电基材上。
本发明还提供了一种生物换能器系统，其包括一蛋白质基体，其用来与一特定配位体结合；以及一电子检测装置，该电子检测装置与所述蛋白质基体相连，用以检测上述特定配位体与所述蛋白质基体的结合，并产生一电子信号以代表该特定配位体的存在。
所述蛋白质基体的较佳实例包括一选自疏水性分子结合蛋白家族与其重组功能同系物的蛋白质。所述电子检测器的较佳实例包括一个以压电为基础的装置以及一个记录器。
所述的以压电为基础的装置，举例而言，可为一石英晶体微量天平(quartzcrystal microbalance(QCM))或一表面声波(SAW)元件。
本发明还提供了一种检测特定配位体与蛋白质基体的结合方法，包括下列步骤提供一压电基材；使一蛋白质基体固定在该压电基材上；在所述特定配位体存在的环境中露出所述蛋白质基体与所述压电基材；以及检测所述压电基材的振荡频率变化，用以测定所述特定配位体是否已结合至所述蛋白质基体上。
本发明还提供了所述生物载体的用途，其能用以吸附、保存、纯化或输送所述特定配位体。
本发明还提供了所述生物换能器系统的用途，其能用于感测评量、空气品质监测、化妆品品质控制、发酵产物品质控制、或者通过呼吸分析来进行医学诊断。
附图简要说明参考下述附图能够更好地理解本发明，其中
图1是一换能器系统主要部分的方块示意图；图2为本发明的一个较佳实施例中，生物换能器系统所输出的电子信号的频率与时间关系图，其中引入空气至系统中进行空白试验；
图3为本发明的一个较佳实施例中，如图1所示的生物换能器系统所输出的电信号的频率与时间关系图，其中引入高浓度配位体样品至系统中进行结合试验；图4为本发明的一个较佳实施例中，如图1所示的生物换能器系统所输出的电信号的频率与时间关系图，其中引入低浓度配位体样品至系统中进行结合试验；图5为本发明的一个较佳实施例中，如图1所示的生物换能器系统所输出的电信号的频率与时间关系图，其中引入高与低浓度配位体样品至系统中进行结合试验；图6为本发明的生物换能器系统的一个实例中频率与时间关系图，用以显示在发酵初期，酵母培养物所产生的挥发性气味物质的结合情形；以及图7为本发明的生物换能器系统的一个实例中频率与时间关系图，用以显示图6所用酵母培养物在发酵中期所产生的挥发性气味物质的结合情形。
图式元件的编号配位体化学物质10蛋白质基体20电子检测装置30 压电基材31记录器具体实施方式
本发明将通过下述实施例做更详细的说明。下面所述的较佳实施例仅用以举例说明，而不应将本发明精确限制于所述实施方式中。
请参考图1，一种生物换能器系统，包括一蛋白质基体20，其由一组或多组蛋白质元件所组成，可与广范围的配位体化学物质10结合。该生物换能器系统另包含一电子检测装置30，随着配位体的不同而产生不同的电信号。该电子检测装置30包括一压电基材(piezoelectric base)31，因应机械应力而产生电荷，以及一记录器32，电连接至该压电基材31。此系统的目的在于提供一种例行感测评量用的简单可携的装置，当然其目的并不限于此。
该蛋白质基体20固定于压电基材31上。当配位体与蛋白质基体20结合时，会有机械应力施加于该压电基材31上，因而产生电荷，而记录器32则记录下信号。
为了达成感测评量、空气品质监测、化妆品品质控制、发酵产物品质控制、或者通过呼吸分析所进行医学诊断等应用，生物换能器系统较佳可与有气味物质、药物或色素等配位体化学物质10相结合。
蛋白质基体20中所包含的一种或多种蛋白质较佳选自疏水性分子结合蛋白家族(lipocalin protein family)与其重组功能同系物(recombinant functionalhomologues)。关于疏水性分子结合蛋白的深入讨论可参见Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology(蛋白质结构与分子酵素学)1482(2000)。
疏水性分子结合蛋白是在真细菌(eubacteria)与各种真核细胞(eukaryoticcells)中所发现的丰富的蛋白质群(超过140种)。其主要生物功能为费洛蒙载子(pheromonal carriers)、维他命A传送者、嗅觉与味决蛋白质、着色色素、前列腺素D(prostaglandin D)的合成、免疫调节、应力蛋白质(stress proteins)、以及细胞分化的调节。虽然整体序列类似度低(通常低于20％)，但疏水性分子结合蛋白家族的成员有一个共同特征，即八股逆平行桶状，具有重复+1位相，包围住一内部配位体结合袋状物(eight-stranded antiparallel-barrel with a repeated+1 topology enclosing an internal ligand-binding pocket)，详细特征说明请见以下网址www.ienner.ac.uk/lipocalin.htm。
大部分的疏水性分子结合蛋白藏量丰富，可由天然资源中分离出，例如牛奶中所含的主要蛋白质即为疏水性分子结合蛋白β-乳球蛋白(beta-lactoglobulin(BLG))。其重组形式亦为此领域中已知并可取得，例如网膜结合蛋白质(retinal-binding protein)，请见Wang et al.，Gene(基因)133(2)291(1993)、眼泪疏水性分子结合蛋白(tear lipocalin)，请见Holzfeind et al.，FEBSLett.395(2-3)95(1996)、牛的β-乳球蛋白，请见Cho et al.，Protein Engineering(蛋白质工程)7(2)263(1994)、主要尿蛋白(major urinary protein)，请见Ferrari etal.，FEBS Lett.401(1)73(1997)、氧化氮输送蛋白，请见Andersen et al.，Structure(构造)6(10)1315(1998)、以及气味分子结合蛋白，请见Lobel et al.，European J.Biochem.254(2)318(1998)。
疏水性分子结合蛋白的实例之一为主要尿蛋白(MUP)。MUP系老鼠尿液中的主要蛋白质成分(雄性约每天5-10毫克)，可用做费洛蒙运送者，请见Cavaggioni and Mucignat-Caretta，BBA 1482(2-1)218(2000)。重组MUP可由本领域技术人员通过已知的标准步骤制得。MUP对于承载1000道尔顿以下的低分子量高挥发性化合物的表现尤其良好。
压电基材31的一个实施例为石英晶体微量天平(quartz crystal microbalance(QCM))。
本发明的较佳电子嗅觉技术是根据压电技术得到的。藉由检测分析物(配位体)与固定于压电材料(例如石英晶体)上的感测元件的结合情形来进行量测。配位体的吸附诱发了振荡频率的偏移，其偏移量与相关配位体的质量成正比。
本发明的操作方式如下所述i)QCM芯片的表面活化将石英晶体微量天平(QCM)表面浸泡于1.2N NaOH，然后1.2N HCl中加以清洁。浸润、干燥后，将QCM电极浸泡于1mM 2-胺基乙硫醇/DMSO(2-aminoethanethiol/DMSO)溶液中12小时，并以双重蒸馏水清洗10分钟。接着，于烘箱中使QCM电极干燥，并以4微升2.5％戊二醛(glutaldehyde)滴1小时。在室温密闭室下以12小时加入2微升1％聚乙烯亚胺/甲醇(polyethylenimine/methanol(PEI/MeOH))溶液至QCM活化表面上。最后，清洗QCM芯片两次并于烘箱中干燥。
ii)将MUP固定于活化的QCM芯片表面上以2.5％戊二醛(glutaldehyde)滴活化的QCM芯片1小时，接着以1小时连续加入MUP溶液(20微克/毫升于10mM磷酸盐缓冲液中，pH7.4)。以100mM甘胺酸隔开该QCM活化表面。
iii)测定配位体的结合在50℃下分别将样品放入一针筒与一烘箱中。使用基本振荡频率为10MHz的AT截法(AT-cut)QCM装置来测定气味气体的吸附。将蒸发的气味样品抽吸入QCM的检测室中，记录所致的频率偏移。
图2至图5绘示出相同生物换能器系统所输出的各种样品的频率与时间关系图。
图2的配位体结合测试样品为空气。因为空气的流率会导致某种程度的浮力，故QCM的振荡频率增加。
图3与图4的配位体结合测试样品分别为40μl与4μl的苯乙酸酯(phenylacetate)。如图所示，配位体吸附诱发了振荡频率的偏移，其偏移量与相关配位体的质量成正比。同时显示出本发明系统亦可检测到稀释的样品。
图5的配位体结合测试样品依序为4μl苯乙酸酯、空气、以及40μl苯乙酸酯。可看出样品的吸附与脱附作用良好。因此，本发明系统可重复使用，并具有定量分析与在线测定的潜力。
为了进行生化气体测试，本发明分析相对于10cm3露出之酵母培养物的气态样品。以具有1.6升工作体积，通气量0.6vvm(每分钟之空气体积/槽体积)，转速400rpm的4升发酵槽培养毕赤酵母菌属发酵物(Pichia fermentans)L-5。初始培养基包含苯丙胺酸(phenylalanine)2000ppm、葡萄糖100g/L、以及50mM KH2PO4。在此种培养露出物中预期的气味物质包括2-苯基乙基醇(2-phenylethyl alcohol)以及乙酸2-苯基乙基酯(2-phenylethyl acetate)等。
图6与图7分别显示初期与中期的气味物质与蛋白质类基体的结合情形。本发明在定量分析与在线测定的潜力明显可见。
根据以上步骤研究多种配位体。表I列出与不同配位体结合时的信号变化，包括苯乙酸酯(phenylacetate)、丙丁酸酯(propylbutyrate)、己丁酸酯(hexylbutyrate)、苄丁酸酯(benzylbutyrate)、丙巴豆酸酯(propyltiglate)、己巴豆酸酯(hexyltiglate)、以及苄巴豆酸酯(benzyltiglate)。
表I
除了QCM外，本发明系统所用的电子检测装置亦可为一场效晶体管(FET)装置或表面声波(SAW)元件。这些装置的原理与操作均为本领域技术人员所共知的，故在此不再赘述。
本发明的蛋白质基体除了在生物检测器或生物换能器系统上的应用外，亦可用作对特定配位体进行吸附、保存、纯化、输送用的生物载体。该蛋白质基体固定在一固态支撑物(未示出)上，或容置于其中，此固态支撑物可为一抛弃式生物芯片或可重复使用的容器。
本发明已通过目前最实用与较佳的形态加以说明，但应了解本发明并不受限于目前所揭示的形式。相反地，其应涵盖如所附权利要求书所包括的各种修饰与类似的配置，以做最广泛解释。
权利要求
1.一种生物载体，其用来与一特定配位体结合，其包括一固态支撑物；以及一蛋白质基体，其固定于固态支撑物上，可与所述特定配位体结合；其中所述蛋白质基体包括疏水性分子结合蛋白家族和其重组功能同系物。
2.如权利要求1所述的生物载体，其中所述固态支撑物为一抛弃式生物芯片或可重复使用的容器。
3.如权利要求1所述的生物载体，其中所述特定配位体选自小于1000道尔顿分子量的气味物质、药物或色素。
4.如权利要求求1所述的生物载体，其中该特定配位体系选自2-苯基乙基醇、乙酸2-苯基乙基酯、苯乙酸酯、丙丁酸酯、己丁酸酯、苄丁酸酯、丙巴豆酸酯、己巴豆酸酯、以及苄巴豆酸酯。
5.如权利要求求1所述的生物载体，其中所述的蛋白质基体包括主要尿蛋白。
6.一种生物检测器，其用来检测一特定配位体的结合，其包括一压电基材，因应一机械应力而产生电荷；以及一蛋白质基体，该蛋白质基体固定于所述压电基材上，当与所述特定配位体结合时提供上述机械应力至上述压电基材上。
7.如权利要求6所述的生物检测器，其中所述压电基材为一石英晶体微量天平或一表面声波基材。
8.如权利要求6所述的生物检测器，其中所述蛋白质基体包括选白疏水性分子结合蛋白家族与其重组功能同系物的蛋白质。
9.如权利要求8所述的生物检测器，其中所述蛋白质基体包括主要尿蛋白。
10.如权利要求6所述的生物检测器，其中所述特定配位体系选自有气味物质、药物或色素。
11.一种生物换能器系统，包括一蛋白质基体，其用来与一特定配位体结合；以及一电子检测装置，该电子检测装置与所述蛋白质基体相连，用以检测所述特定配位体与所述蛋白质基体的结合，并产生一电子信号以代表该特定配位体的存在。
12.如权利要求11所述的生物换能器系统，其中所述特定配位体选自有气味物质、药物或色素。
13.如权利要求11所述的生物换能器系统，其中所述蛋白质基体包括主要尿蛋白。
14.如权利要求11所述的生物换能器系统，其中所述蛋白质基体包括一选自疏水性分子结合蛋白家族与其重组功能同系物的蛋白质。
15.如权利要求11所述的生物换能器系统，其中所述电子检测装置包括一以压电为基础的装置以及一记录器。
16.如权利要求15所述的生物换能器系统，其中所述以压电为基础的装置为一石英晶体微量天平或一表面声波元件。
17.一种检测特定配位体与蛋白质基体的结合情形的方法，包括下列步骤提供一压电基材；使一蛋白质基体固定在所述压电基材上；在所述特定配位体存在的环境中露出所述蛋白质基体与压电基材；以及检测所述压电基材的振荡频率变化，以测定该特定配位体是否已结合至该蛋白质基体上。
18.权利要求1所述的生物载体在吸附、保存、纯化或输送所述特定配位体中的应用。
19.权利要求11所述的生物换能器系统用于感测评量、空气品质监测、化妆品品质控制、发酵产物品质控制、或者通过呼吸分析进行医学诊断。
全文摘要
一种生物电子系统，用以检测广范围的化学物质，可利用质量感应电子装置与疏水性分子结合蛋白与配位体结合的亲和性来完成。一种生物换能器系统，将独特的疏水性分子结合蛋白与配位体结合的亲和性与高灵敏度的以压电为基础的装置做结合。本系统在作为人工嗅觉上的应用更可靠，且省成本又有弹性，可应用于感测评量、空气品质监测、化妆品品质控制、发酵产物品质控制、或者通过呼吸分析进行医学诊断等多方面。这些蛋白质类元件应可延伸至数种具潜力的应用上，例如特定配位体的纯化与输送。
文档编号G01N27/00GK1584600SQ20041004741
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月28日 优先权日2004年5月28日
发明者谢世扬, 林铭泽, 苏文威, 陈奎宏, 刘柏樟 申请人:中华研升科技股份有限公司