Complexin 1/2过表达重组载体的构建及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及Complexin 1/2过表达重组载体的构建及应用，尤其设及Complexin 1/2基因及其过表达重组载体及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，目前尚 无特别有效的治疗手段。该病临床上W记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行 功能障碍W及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁W前发病者， 称早老性痴呆;65岁W后发病者称老年性痴呆。
[0003] 研究提示，Complexin 1/2在阿尔茨海默病（AD)患者脑中表达显著下调，然而， Complexinl/2对AD发病的影响尚不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供Complexin 1/2过表达重组载体及其在制备治疗阿尔茨海默 病的药物中的应用。
[0005] 本发明的一个方面是提供Complexin 1和/或Complexin 2基因在制备治疗阿尔茨 海默病的药物中的应用，其中Complexin 1基因具有如序列1所示的碱基序列或者与序列1 具有95% W上，优选99% W上同一'性的碱基序列；Complexin 2基因具有如序列2所示的碱 基序列或者与序列2具有95% W上，优选99% W上同一性的碱基序列。
[0006] 本发明第二个方面是提供一种Complexin 1/2过表达重组载体，所述重组载体是 腺相关病毒重组载体，其含有序列表中序列1所示的碱基序列或与序列1具有95% W上，优 选99% W上同一性的碱基序列和序列2所示的碱基序列或与序列2具有95% W上，优选99% W上同一性的碱基序列。
[0007] 本发明的另一个方面是构建上述重组载体的方法，该方法包括下列步骤：
[000引（A )设计引物，其中C O m P 1 e X i n 1的引物序列为5'-GGAATTCTGAGGAACCAAGCCATCACC-3 '，5 '-CGGGATCGCTGACCCAATATCATTACTTC-3，
[0009] Complexin 2的引物序列为5'-GGAATTCTGCAGGATGGACTTCGTCATG-3'，5'-CGGGATCCGGAGGAGGATGGGTTACTTC-3 '；
[0010] 在上游引物的5'端前面加上保护碱基和EcoRI酶切位点序列(CGGAATTC)，下游引 物的5'端加上保护碱基和BamH I酶切位点序列(CGGGATCC);
[0011] (B)培养Ni3T3细胞，提取总RNA，将RNA反转录为CDNA;
[001 ^ (C似CDNA为模板，进行PCR扩增；
[OOU] (D)酶切目的基因和表达载体；
[0014] 化)将上述酶切的目的基因 CPLX 1/2连接到酶切载体pAAV-ires-GFP上形成重组 质粒 pAAV-CPLXl/2。
[0015] 本发明的再一个方面提供了 Complexin 1/2过表达重组载体在制备治疗阿尔茨海 默病的药物中的应用。
[0016]本研究通过构建Complexin 1/2过表达载体并在整体动物水平表达，确定 Complexin 1/2过表达对AD转基因小鼠空间记忆损伤的影响。研究结果显示，该重组载体在 整体动物水平成功高效表达，并显著改善AD转基因小鼠空间记忆的损伤。本发明不但为深 入研究Complexin 1/2的功能提供新的技术手段，同时为AD空间记忆损伤祀向基因治疗提 供了新的候选策略。AD等疾病最为主要的分子改变为记忆相关分子的表达下调，通过基因 手段促进Complexin 1/2的过度表达可为该类疾病提供治疗策略。
[0017]本发明的优点
[0018]本申请构建了新的Complexin 1/2过表达重组载体并在整体动物水平成功高效表 达，确定了Complexin I/II可有效阻止AD转基因小鼠空间记忆的损伤，同时确定Complexin 1/2的高表达可显著改善AD转基因小鼠空间记忆的损伤。
[0019] 本申请的重组载体可用于祀向治疗AD等记忆损伤相关的认知障碍疾病，为祀向治 疗AD提供新的策略；此外，Complexin 1/2整体动物模型的成功建立可为深入研究 Complexin 1/2的生理功能提供新的技术手段。
【附图说明】
[0020] 图1是Ni3T3细胞提取总RNA电泳图。
[0021] 图2是PCR扩增CPLX 1/2基因；
[0022] 其中，M:DNA marker(2000bp)
[0023] I、2:Sample DM。
[0024] 图3是菌落PCR鉴定图；
[00巧]其中，M:DNA marker(2000bp)
[0026] I ~10:重组质粒 pAAV-CPLXl/2
[0027] ll:pAAV-ires-GFP。
[00%]图4是目的基因片段的序列测定图。
[0029] 图5是CPLX1/2稳定转染细胞系在光镜和巧光显微镜下的图片；
[0030] 其中（A)C化X1/2稳定转染细胞系在光镜下的图片，图中的标尺代表100皿；（B)运 是在巧光显微镜下的图片，来自与(A)相同的视野。我们构建的CPLX1/2表达载体含有GFP结 构域，在表达CPLX1/2的同时可W表达GFP，因此阳性细胞可W发绿色巧光。图中的标尺代表 100皿。
[0031 ]图6是CPLX1/2过表达载体在小鼠海马CA3区的表达情况。
[00创图7是CPLX1/2对3xTg-AD小鼠学习能力的影响图，其中图7A是CPLX1/2对3xTg-AD 小鼠水迷宫逃避潜伏期的影响；图7B是运动轨迹图；图7C是穿越平台的次数；图7D是探索平 台所需时间；图7E是目标象限活动路程占总路程百分比；图7F是目标象限活动时间占总时 间百分比；图7G是总路程；图7H是平均速度。结果表示为平均值±标准误，每组8-10只小鼠； 用t检验对结果进行统计学分析，. 05认为有统计学差别，p*<0.05VS Tg。
【具体实施方式】
[0033] W下通过具体实施例来说明本发明。
[0034] 实施例1
[00巧]Complexin 1/2过表达载体构建及应用
[0036] -、Complexin 1/2过表达载体构建
[0037] 1、序列获得和引物设计
[003引从NCBI的Nucleotide数据库中Genbank上找到小鼠 complexin l/2(CPLXl/2)基因 mRNA的CDS序列(Accession N0:NM_007756，NM_009946)，然后利用Oligo 7软件分别选取各 个CDS两端的部分序列进行分析，确定上下游引物，再在上游引物的5'端前面加上保护碱基 和EcoRI酶切位点序列（CGGAATTC)，下游引物的5'端加上保护碱基和BamH I酶切位点序列 (CGGGATCC)。引物委托上海生工生物有限公司进行合成，其序列见表1和表2所示：
[0039] 表1.CPLX 1基因扩增引物
[0041 ] 表2.CPLX 2基因扩增引物
[0043] 2、模板CDNA的获得
[0044] 培养Ni3T3细胞(购自ATCC公司），用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA，具体方 法参考RNeasy Mini Kit(QIAgene)说明书，电泳检测所提取的RNA，结果见图1。
[0045] 3、将RNA反转录为cDNA
[0046] 各组细胞总RNA提取并进行纯度测定后，采用反转录试剂盒（S叩er Script? Firs t-Strand)进行cDNA逆转录合成，方法见表2。
[0047] 表2反转录体系成分表
[0049] 37°C，15min;85°C，5s;4°C，w。反转录结束，加入90i^l的RNaseFree地20稀释 cDNA，-2(TC保存备用。
[0050] 4、目的基因的获得
[0051 ] 将新合成的引物加入TE buffer溶解，调整引物的最终浓度为10測，W上述CDNA为 模板，加引物，PrimeSTAR Max DNA Polymerase,
[0052] PCR反应体系（IOul): 漱; 如1 PrimcSTAR Max： 5ul
[005；3] 上游引物： OJul 下游引物； 0.3iU 模祗： 〇.4ul
[0054]设置PCR反应条件如下： m°C Smm 98 T： IOs
[0化5] 55 L； IOs ITQ 15s：
[0056] PCR循环为30个，PCR完后跑1%的琼脂糖凝胶鉴定，结果见图2。
[0057] 将上述反应体系扩大10倍，根据Marker来确定目的基因，切胶回收(步骤参照胶回 收试剂盒）。
[005引 5、目的基因和表达载体的双酶切
[0059] (I)CPLX 1/2 基因酶切体系（50ul): 目的基因： 30ul 反睦buri'cn 细1
[0060]水； 1〇沾 EcoRi: 2.51x1 BanHI: 2,5 姐
[0061 ] (2)pAAV-ires-GFP载体酶切体系（50ul): 载体： 2:()ui BuiTen 5ul
[0062] 7长; 20ul EcoRJj 2..訊 I BamHi: 2.5 山
[0063] 将上述反应体系置于37°C，过夜或酶切5小时。电泳检测酶切产物，并切胶回收。 pAAV-ires-GFP载体购自 CE化 BIOLABS公司。
[0064] 6、连接目的基因和pAAV-ires-GFP
[0065] 将上述酶切的目的基因 CPLX 1/2连接到酶切载体pAAV-ires-GFP上形成重组质粒 pAAV-CPLXl/2,同时取酶切的pAAV-ires-GFP和无菌水为阴性对照，按表3配制IOul