一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物、其制备方法以及在her2阳性乳腺癌诊治中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物，还涉及该纳米棒复合物的制备方法及其在HER-2阳性乳腺癌诊治中应用，本发明属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]随着新药和新方法的临床开发和应用，早期乳腺癌的治疗效果有了很大的提高，但是三期和四期乳腺癌的5年生存率仍然只有57%和20%，其中表皮生长因子2受体(HER2)阳性表达的乳腺癌患者复发转移风险很高，预后尤其差。2006年瑞士罗氏公司研发出了针对乳腺癌细胞HER2靶点的第一个分子靶向药物——曲妥珠单抗，它可与HER2结合，阻断HER2相关的肿瘤生长信号通路，抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。目前曲妥珠单抗已被FDA批准用于各期HER2阳性乳腺癌的治疗，但一些患者在开始曲妥珠单抗治疗时出现原发性耐药，还有许多患者在接受曲妥珠单抗治疗后一年内相继出现耐药。如何克服这个治疗瓶颈是乳腺癌治疗面临的一大难题。
[0003]曲妥珠单抗耐药与许多机制相关，包括糖蛋白MUC4过表达、胰岛素样生长因子过表达和固有的P13K/Akt活性等，至于HER2受体胞外区突变的情况非常少见，在大多数情况下HER2受体本身并无变化，同时控制这些与耐药相关的多个因素非常困难，于是我们想到了以曲妥珠单抗为载体精确靶向到病灶部位进行热疗，通过光热治疗杀死残余耐药肿瘤细胞。
[0004]在众多可应用于生物医学方面的纳米材料中，金纳米家族具有良好的生物相容性和易被修饰特性，因此在肿瘤的诊断与治疗中有较好的应用前景，并取得了一些具有实际应用价值的研究成果。例如，EGFR抗体修饰的金纳米粒子用于肿瘤的早期诊断，可以明显的区分肿瘤细胞与正常细胞。Yang J等人将EGFR特异性抗体一西妥昔单抗Cetuximab连接在金纳米粒子上，利用金纳米粒子的光学特性通过光学图像得以使肝癌细胞区别于正常细胞。Mukherjee P等人研究发现，金纳米粒子可以特异性地结合VEGF-165和bFGF，发挥抑制肿瘤血管生成的作用;Agasti SS等人通过O-硝基节基(0-nitrobenzyl，0ΝΒ)将5-FU连接于金纳米粒子的表面，研制了一种“光反应”性的金纳米粒子-抗肿瘤药物控释系统。
[0005]在这些国内外前期研究的基础上，本发明结合曲妥珠单抗的特异靶向性和金纳米粒子在肿瘤治疗中的应用特征，将通过化学合成制备由曲妥珠单抗键连的金纳米粒子。但肿瘤热疗是一个复杂的过程，由于不同波长的光对组织的穿透能力不同，对组织穿透能力增强的光其热效率就降低，而穿透力不足就无法到达准确病灶部位。由于常用的金纳米壳的径向调节范围单一(仅有球半径可调)，无法满足治疗不同大小肿瘤和体内不同深度肿瘤的需求，我们将金纳米棒键连曲妥珠单抗，同时在结合曲妥珠单抗前通过半胱氨酸-P卜啉键连金纳米棒，利用卟啉近红外荧光显像识别肿瘤病灶部位，到达影像定位和靶向性热疗的效果。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于HER2阳性乳腺癌诊治的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物以及制备方法和用途。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0008](I)制备出长径比不同的金纳米棒，纵向吸收峰为650-850nm，可满足穿透人体组织的最佳光波长，并在少量的CTAB包裹下稳定存在；
[0009](2)制备出键联不同数量的半胱氨酸的卟啉类荧光分子，从而可能有效控制金纳米棒上键联曲妥珠单抗的量；
[0010](3)通过戊二醛化学交联的方法，将金纳米棒-半胱氨酸-扑啉复合物和药物曲妥珠单抗键连，得到的金纳米棒-半胱氨酸-扑啉-曲妥珠单抗复合物，能很好地分散在DMF溶液中。
[0011 ]本发明的一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物，其是通过Au-S键的作用，将金纳米棒和半胱氨酸-扑啉类荧光分子复合物键连，然后通过戊二醛化学交联的方法，将金纳米棒-半胱氨酸-扑啉类荧光分子复合物和药物曲妥珠单抗键连得到，其由以下依次相连的各部分组成:金纳米棒、半胱氨酸、扑啉类荧光分子以及曲妥珠单抗。
[0012]其中，优选的，所述的卟啉类荧光分子为对氯乙氧基苯基卟啉。
[0013]一种制备以上所述的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的方法，包括以下步骤:
[0014]I)金纳米棒的制备
[0015]a.金种子液的制备:向烧杯中加入7.5ml 0.1M的CTAB溶液，在轻微搅拌的条件下加入250μ1 0.0IM的氯金酸溶液，然后加入新鲜配制的O °C的0.0謹的硼氢化钠溶液6(^1，在22-28°C的温度下轻微搅拌l_5min，待用；
[0016]b.生长液的制备:向另一个烧杯里依次加入以下溶液:0.1M的CTAB溶液1ml，
0.0lM的氯金酸溶液425μ1，0.0lM的硝酸银溶液60μ1-100μ1，0.1M的抗坏血酸溶液67μ1，混合均匀后得到生长液；
[0017]c.金纳米棒的制备:将金种子液105μ1加入到生长液中，整个过程均在轻微搅拌以及温度为22-28 V的条件下进行，加完药品后持续搅拌，待溶液变色后，将烧杯移入温度为27-28摄氏度的恒温水浴中，静止过夜处理;反应完后得到金纳米棒溶液，将金纳米棒溶液移入离心管中，离心前将溶液进行加热处理，待溶液中的CTAB全部溶解后，将药品配平后放入离心机，离心，离心完后用吸管将上清液吸出，沉淀用去离子水重新溶解，重复以上离心过程2次，将收集的金纳米棒重悬于适量体积的去离子水中，将收集的金纳米棒溶液放在40C的冰箱里保存，用于之后的表征和再反应；
[0018]2)卟啉金纳米棒键连
[0019]d.卟啉-半胱氨酸溶液的制备:烧瓶中加入25ml的DMF溶液，50mg的对氯乙氧基苯基卟啉，0.75g-1.25g半胱氨酸，搅拌混合均匀后，加入2?3滴三乙胺，加热反应24h，加入饱和食盐水和二氯甲烷进行产物分离，将溶解有目标物质的二氯甲烷相通过柱层析进行提纯，得到卟啉-半胱氨酸溶液；
[0020]e.金纳米棒-半胱氨酸-扑啉的制备:在烧杯中依次加入甲醇，上述步骤c得到的金纳米棒溶液和步骤d得到的卟啉-半胱氨酸溶液，常温搅拌18-24h，反应结束后离心，倒掉上面溶液，加入甲醇再次离心，倒掉上面溶液，然后加入DMF分散沉淀，超声处理使沉淀更好地分散在溶液中，得到金纳米棒-半胱氨酸-扑啉复合物；
[0021 ] 3)曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的制备
[0022]先将金纳米棒-半胱氨酸-扑啉复合物分散在0.005M的CTAB溶液中，使得金纳米棒-半胱氨酸-扑啉复合物的浓度为ΙΟΟηΜ，然后用戊二醛交联法，将1ml的金纳米棒-半胱氨酸-卩卜啉复合物溶液分散在浓度为0.0IM的I3BS溶液中，常温放置0.5-2h，离心处理，沉淀重新分散在配制好的0.0IM的PBS溶液中，然后加入过量的曲妥珠单抗，4°C下孵育12h，离心除去多余的曲妥珠单抗，得到金纳米棒-半胱氨酸-扑啉-曲妥珠单抗复合物，将得到的复合物分散在0.0IM的PBS溶液中，温度40C保存，即得。
[0023]其中，优选的，所述的0.0lM的PBS溶液为含有1.38M NaCl，0.0027M KCl,0.05%(v/v)吐温-20以及5%(v/v)戊二醛的0.01M的PBS溶液，pH 7.4。
[0024]进一步的，本发明还提出了所述的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物在制备HER2阳性乳腺癌诊治试剂中的应用。
[0025]相较于现有技术，本发明的有益效果为:
[0026]本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种可显像的肿瘤靶向性治疗金纳米棒，这种金纳米棒具有更加优越的性能，主要表现它在横向和纵向上具有光学异性特征(横径和纵径均可调)，在径向长度上，其波长范围可以调节到1400nm以上，从而对组织具有更好的穿透能力；在横向上，我们可以将其共振波长调节到600-800nm之间，这个波长范围非常适合肿瘤的光热治疗。因此我们结合曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌的特异靶向性和金纳米棒在肿瘤治疗中的应用优势及卟啉光动力学诊断的灵敏度，通过化学合成制备由曲妥珠单抗和卟啉修饰的金纳米棒，利用曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌的特异靶向性，将卟啉和金纳米棒定点革E向到病灶部位，通过适当波长的光照射，利用卟啉的光动力反应对肿瘤进行定位诊断，可以检测到普通方法很难检测到的原位癌或微转移病灶，同时利用金纳米棒特有的光热特征，对检测到的乳腺癌病灶进行靶向性光热治疗。这种靶向性热疗通过物理方法破坏耐药的肿瘤细胞，可有效解决分子靶向药物耐药的难题。
【附图说明】
[0027]图1为合成的金纳米棒卟啉复合物在透射电镜下的图像；
[0028]图2为不同比例卟啉-半胱氨酸的金纳米棒复合物与HER2高表达肿瘤细胞结合的焚光显像；
[0029]图3为金纳米棒复合物对BT474细胞的光热治疗效果；
[0030]图4为金纳米棒复合物靶向肿瘤病灶成像。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032]实施例1曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的制备
[0033]本发明的实施方案和步骤:
[0034]I)金纳米棒的制备
[0035]a.金种子液的制备:向50ml的烧杯中加入7.5ml 0.1M的CTAB溶液，在轻微搅拌的条件下加入250μ1 0.0IM的氯金酸