一种提高cd4阳性t淋巴细胞存活率和活性的试剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种提高⑶4阳性T淋巴细胞存活率的试剂及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤组织由多种细胞组成，其中，免疫细胞起着至关重要的抗肿瘤作用。在20世纪70年代，人们提出在体内正常细胞会不断地转化成肿瘤细胞，而免疫系统在这时能够阻止这种细胞恶化过程。例如，肿瘤中浸润的免疫细胞，特别是T淋巴细胞，可以分泌大量的不同的细胞因子直接或者间接杀伤肿瘤细胞。因此，肿瘤的免疫治疗被认为是非常有前景的抗肿瘤策略。最近几年，肿瘤浸润T淋巴细胞的过继移植被发现能够显著抑制肿瘤生长。不仅如此，CTLA-4、PD-1以及H)-L1的抗体也进入了临床试验，并且显示了显著的治疗效果O
[0003]但是，肿瘤细胞不会总是被免疫细胞成功清除，这是因为这些免疫细胞在进入肿瘤微环境后会发生凋亡，这是肿瘤逃逸免疫攻击的重要机制。这种凋亡的发生有多种机制，其中很重要的一种是激活诱导的细胞凋亡(AICD)。AICD是在1989年被发现的，对于调节T淋巴细胞的活性和维持免疫稳态起到了至关重要的作用。本发明人之前的研究揭示了Al⑶发生的分子机制:激活的T淋巴细胞在被再次激活后，会迅速表达FasL (⑶95L)，FasL与细胞表面的Fas结合启动细胞凋亡的信号通路。如果人的FasL-Fas通路被破坏，就会导致活化的淋巴细胞的大量积累，进而导致自身免疫性疾病，叫做自发免疫淋巴细胞增殖症(autoimmune lymphoproliferative syndrome，ALPS)。因此，FasL 介导的 AICD 严格控制着免疫反应的程度和活性。由于免疫反应对于肿瘤治疗十分重要，所以调节肿瘤环境中T淋巴细胞的AICD会成为新的肿瘤治疗的重要策略，本领域需要就此进行深入研究，以期开发出基于调节免疫细胞实现治疗的药物。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种提高CD4阳性T淋巴细胞存活率的试剂及其应用。
[0005]在本发明的第一方面，提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备促⑶4阳性T淋巴细胞上调剂中的用途。
[0006]在一个优选例中，⑶4阳性T淋巴细胞的“上调”包括但不限于:CD4阳性T淋巴细胞的数量上调，活性上调。
[0007]在另一优选例中，所述的⑶4阳性T淋巴细胞上调剂包括(但不限于):促进⑶4阳性T淋巴细胞存活的制剂，提高⑶4阳性T淋巴细胞活性的制剂，提高⑶4阳性T淋巴细胞数量的制剂，增加CD4阳性T淋巴细胞有效作用时间的制剂，提高肿瘤浸润细胞中CD4阳性T淋巴细胞的比例的制剂，和/或减少⑶4阳性T淋巴细胞凋亡的制剂。
[0008]在另一优选例中，所述的⑶4阳性T淋巴细胞是⑶62L阴性的细胞。
[0009]在另一优选例中，所述的⑶4阳性T淋巴细胞是存在于肿瘤组织中的⑶4阳性T淋巴细胞。
[0010]在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括:曲古菌素A，丁酸钠。
[0011]在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂还用于:提高T淋巴细胞相关细胞因子IL-2、IFN γ、TNF α和/或GM-CSF的含量。
[0012]在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂还用于:抑制FasL的表达或提高Fas的表达。
[0013]在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂还用于:抑制⑶4阳性T淋巴细胞的激活诱导的细胞凋亡(AICD)。
[0014]在本发明的另一方面，提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备增效的CD4阳性T淋巴细胞制剂中的用途，所述的增效的⑶4阳性T淋巴细胞制剂中，所述的⑶4阳性T淋巴细胞具有高于未经组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的CD4阳性T淋巴细胞的抗肿瘤作用。
[0015]在本发明的另一方面，提供一种用于升高⑶4阳性T淋巴细胞或用于抑制肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括:
[0016]组蛋白去乙酰化酶抑制剂；和
[0017]抗CTLA-4 抗体。
[0018]在一个优选例中，所述的HDAC抑制剂和抗CTLA-4抗体是有效量的。
[0019]在另一优选例中，所述的HDAC抑制剂被包含在药学上可接受的载体中。
[0020]在另一优选例中，所述的抗CTLA-4抗体被包含在药学上可接受的载体中。
[0021]在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括:曲古菌素A，丁酸钠。
[0022]在另一优选例中，所述的肿瘤包括:黑色素瘤，乳腺癌，淋巴瘤。
[0023]在本发明的另一方面，提供所述的药盒的用途，用于升高CD4阳性T淋巴细胞或用于抑制肿瘤。
[0024]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
[0025]图1、TSA通过促进⑶4阳性T淋巴细胞的存活来抑制B16F0黑色素瘤的生长。
[0026](A-B)肌肉注射B16F0细胞(5X105)到野生型小鼠或者裸鼠(各8只)的左大腿处。6天后，每两天腹腔注射I μ M/kg或者3 μ M/kg的TSA，DMSO为对照组。在第14天，小鼠被处死，随后分离肿瘤并称重。
[0027](C)B16在β 2m /或者CIITA 1缺失的小鼠上(各4只)按照同样的步骤建立黑色素瘤模型，也按照同样方法注射I μ M/kg的TSA以及DMS0，14天后称重肿瘤。
[0028](D)分离DMSO组和TSA组的肿瘤中浸润的淋巴细胞并计数，随后用流式检测CD4+CD62L T细胞的比例。
[0029](E)计算统计每克肿瘤中⑶4+⑶62L T淋巴细胞的绝对数目。
[0030](F)使用 Luminex 技术(B1-Plex，B1-Rad)检测血清中 IL_2，IFN-γ，TNF-α 和GM-CSF的浓度。
[0031 ] (G)用7-AAD流式抗体染色⑶4+⑶62L T细胞，并统计7-AAD阳性的细胞比例。统计学检测标准为 Student’ s t-test。*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，ns (不显著)。
[0032]图2、HDAC抑制剂可以抑制T淋巴细胞的Al⑶，从而促进其存活。
[0033](A)在预铺了⑶3抗体的24孔板上，将Al.1T淋巴瘤细胞与不同浓度的TSA共培养24小时。随后细胞被收集起来并做PI染色来检测细胞凋亡比例。
[0034](B)三个如A图的独立实验的统计学结果。
[0035](C)如A中Al.1T淋巴瘤细胞与10nM TSA共培养不同时间来检测凋亡比例。
[0036](D)用CD3抗体诱导AL I细胞AICD，并用10nM TSA处理20小时后，用CCK-8来检测细胞活性。
[0037](E)用⑶3抗体诱导Al.1细胞Al⑶，并用10nM TSA处理20小时后，用台盼蓝染色，统计台盼蓝阴性的细胞数目。数值为三个平行试验的平均值+偏差。
[0038]图3、TSA特异性抑制Al.1中FasL的表达。
[0039](A)Al.1细胞在与10nM TSA共培养的情况下分别被anti_CD3 (10 μ g/ml)，放线菌素D (ActD, 5 μ g/ml)，双氧水(H202，80mM)或者紫外线照射(80J/m2)处理。24小时后，进行PI染色来检测凋亡比例。
[0040](B-C)用⑶3抗体诱导Al.1细胞Al⑶，并用10nM TSA处理，收集细胞和上清来检测FasL信使RNA或者蛋白的表达。
[0041](D)诱导Al.1细胞Al⑶，并用10nM TSA处理，收集细胞并用Fas流式抗体染色来检测Fas蛋白的表达。
[0042](E)在图3C的体系中加入可溶的FasL(Jo2，8 μ g/ml), 24小时后检测凋亡比例。
[0043]图4、TSA通过抑制FasL的表达来抑制⑶4+T细胞的Al⑶。
[0044](A)用CD3抗体和不同浓度的TSA处理CD4+T淋巴细胞(2.5X 15) 12小时，然后通过PI染色检测细胞凋亡比例。
[0045](B)三个如A图的独立实验的统计学结果。
[0046](C-D)收集A中的细胞来检测⑶4+T淋巴细胞在Al⑶过程中Fas和FasL的表达。
[0047]图5、TSA通过抑制NFAT1-Egr2通路来抑制FasL的表达。
[0048](A)用⑶3抗体和不同浓度的TSA来处理Al.1细胞。在不同时间点时收集细胞并分离胞质与胞浆蛋白，并检测NFAT1，p53，GAPDH和Iamin BI蛋白的分布。
[0049](B)用⑶3抗体和10nM的TSA来处理Al.1细胞。在不同时间点时收集细胞并检测FasL，Egr2和Egr3的mRNA的表达水平。
[0050]图6、TSA通过抑制肿瘤微环境中的激活T淋巴细胞的FasL介导的Al⑶过程来发挥抗肿瘤作用。
[0051](A)收集图1中分离的淋巴细胞并检测其FasL信使RNA的表达水平。
[0052](B)这些细胞也被FasL流式抗体染色来检测FasL蛋白的表达水平。
[0053](C)如图1在野生型小鼠和gld/gld小鼠中(各5只)诱导黑色素瘤模型，并给药。14天后，小鼠被处死取出肿瘤并称重。
[0054](D)肿瘤中的淋巴细胞被分离出，然后进行CD4和CD62L流式抗体的染色来检测其中⑶4+⑶62L淋巴细胞的比例。