[0055](E)每克肿瘤中⑶4+⑶62L淋巴细胞的绝对数目。
[0056](F)使用B1-plex检测血清中细胞因子的浓度。
[0057](G)用流式检测7_AAD+细胞在所有浸润⑶4 +T细胞中的比例。
[0058]图7、TSA和anti_CTLA4共同给药可以显著提高单独给药的治疗效果。
[0059](A)以5X 105B16F0细胞注射小鼠后6天起，用图示的试剂腹腔给药，每两天一次，直到肿瘤体积大于1，OOOmm3或者小鼠死亡，以此确定生存曲线。每组10只老鼠。用Log-Rank test 作统计学计算，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001。
[0060](B)以5 X 105B16F0细胞注射小鼠(每组7只)后6天起，用I μ M/kg TSA或者200 μ g anti_CTLA4或者两者同时腹腔给药，每两天一次。14天后，处死小鼠并称重肿瘤。
[0061](C)分离肿瘤中的淋巴细胞并计数，随后用CD4和CD62L的流式抗体染色来检测淋巴细胞中⑶4+⑶62L细胞的比例。
[0062](D)计算每克肿瘤中⑶4+⑶62L细胞的绝对数目。
[0063]图8、丁酸钠能抑制T细胞的Al⑶过程。
[0064](A)用⑶3抗体诱导2.5X 15Al.1细胞的Al⑶，同时加入不同浓度的丁酸钠，24小时后用PI检测细胞凋亡。
[0065](B)A图的统计结果。
[0066](C)用⑶3抗体和3 μ M 丁酸钠刺激Al.1细胞，不同时间后利用PI染色检测细胞凋亡程度，并作出统计。
[0067]图9、TSA也通过同样机制抑制EL4淋巴癌的生长。EL4淋巴瘤细胞以同样方式注射。14天后肿瘤被称重(A)，随后分离出肿瘤内的淋巴细胞悬液并计数，然后用流式分析其中⑶4+⑶62L细胞的比例和数目(B-C)。
[0068]图10、在EL4淋巴瘤和4TI乳腺癌模型中，TSA和CTLA-4抗体同时给药可以更加促进TSA单独给药的抗肿瘤效果。在第O天，给小鼠肌肉注射5X105EL4细胞(A)或者在乳腺脂肪垫中注射2X 1054T1细胞。从第6天起，每隔一天注射I μ M/kg TSA或200 μ g CTLA-4抗体，直到第22天。肿瘤大小超过1，OOOmm3或者大到严重影响行动后，小鼠被处死。统计生存曲线，每条曲线代表每组10只小鼠。使用Log-Rank test统计显著差异。
[0069]图1UTSA处理小鼠的⑶4+T细胞的过继移植比DMSO处理小鼠能够发挥更有效的肿瘤治疗作用。在第O天向C57BL/6小鼠左大腿肌肉注射B16R)细胞(5 X 15)。从第6天起，每隔一天腹腔注射I μ M/kg TSA,对照组注射DMSO (每组50只)。在第14天，处死小鼠，取得并研磨肿瘤，随后磁珠分选获得⑶4+⑶62L的淋巴细胞。将这些细胞(2X10 6)静脉注射到同时注射B16肿瘤细胞的Ragl 7免疫缺陷小鼠中。14天后，处死小鼠并对肿瘤称Mo 使用 Student’ st-test 统计显著差异，*ρ〈0.05, **ρ〈0.01。
【具体实施方式】
[0070]本发明人经过深入的研究，首次揭示组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂能够阻抑T淋巴细胞的Al⑶过程，从而提高⑶4阳性的T淋巴细胞的存活比例。因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以作为一种升高T淋巴细胞的药物。并且，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以与抗CTLA-4抗体组合用药，具有增效的抗肿瘤作用。在此基础上完成了本发明。
[0071 ] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其用途
[0072]组蛋白去乙酰化酶(Histone deacelytase，HDAC)是严格调控组蛋白以及非组蛋白类的蛋白质的去乙酰化过程的重要酶类。这种酶能够将乙酰基从酪氨酸上移除，从而改变染色质和蛋白质的结构，进而调节许多重要的细胞活动，包括基因转录、信号转导等。因此，组蛋白去乙酰化酶对保持乙酰化的稳态是非常重要的。它们的活性如果出现异常，就会导致基因表达等细胞活动的异常，而这种现象在各种疾病中都有所发现。正组蛋白去乙酰化酶的抑制剂(HDAC Inhibitors, HDIs)是一类从自然来源中提取或者人工合成的小分子。其中，曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)是第一个从自然中提取的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。最近几年来，曲古菌素A和其他的小分子抑制剂已被发现在一些疾病中具有潜在的治疗效果，包括神经退行性疾病，肿瘤，自体免疫性疾病，急性移植物抗宿主病等等，但是具体的治疗机制并没有完全阐释清楚。虽然HDIs被报道能够诱导多种细胞的凋亡，但是其对Al⑶的作用并不清楚。本发明人深入研究后首次揭示:HDIs通过调节Al⑶来发挥抗肿瘤作用。
[0073]本发明人发现，TSA通过抑制T淋巴细胞受体发起的级联信号来抑制Al⑶的发生从而促进了肿瘤中浸润的CD4阳性T淋巴细胞的存活，进而促进了抗肿瘤免疫反应。首先，TSA能够明显抑制B16F0黑色素瘤的生长，而这种抑制作用是依赖于⑶4阳性的淋巴细胞的。不仅如此，还发现肿瘤中浸润的激活的CD4阳性的T淋巴细胞的比例和绝对数量都有了显著的提高。因此，TSA可以显著地提高肿瘤中浸润的⑶4阳性的T淋巴细胞数量。然而，TSA如何提高T淋巴细胞数量的机制还不清楚。本发明人接下来研究了 TSA是否对T淋巴细胞的Al⑶产生影响，惊喜地发现，TSA能够完全阻抑T淋巴细胞的Al⑶过程，从而增加T淋巴细胞的存活，而这种作用是通过抑制FasL的表达来实现的。既然FasL在这个过程中有着重要的作用，本发明人在FasL缺陷的小鼠中建立了同样的肿瘤模型，发现注射TSA无法抑制FasL缺陷小鼠肿瘤的生长，同时浸润T淋巴细胞的数量也没有明显变化。这个发现证实了 TSA通过抑制FasL介导的Al⑶来提高肿瘤中淋巴效应细胞的浸润。
[0074]基于本发明人的上述新发现，本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备促⑶4阳性T淋巴细胞上调剂中的用途。
[0075]多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以应用于本发明中，用作升高⑶4阳性T淋巴细胞的试剂。作为本发明的优选方式，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括:曲古菌素A，丁酸钠。
[0076]基于本发明人的研究结果，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂还具有:提高T淋巴细胞相关细胞因子IL-2、IFN γ、TNF α和/或GM-CSF的含量；抑制FasL的表达或提高Fas的表达；抑制CD4阳性T淋巴细胞的激活诱导的细胞凋亡(AICD)等功能。
[0077]所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可在体内或离体条件下促进CD4阳性T淋巴细胞的上调。一种方式例如是给予需要治疗的对象直接给药组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从而使之作用于体内特定的部位，增加该部位的CD4阳性T淋巴细胞的数量或活性；可以通过靶向给药的方式来使得组蛋白去乙酰化酶抑制剂富集到体内特定的部位。另一种方式例如是将所需治疗的患者体内的CD4阳性T淋巴细胞分离出来，离体条件下以组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理该CD4阳性T淋巴细胞，促进其活性提高或数量增加，再行回输。应理解，在本发明的新发现的基础上，其它本领域技术人员预期可行的给药方式也被包含在本发明中。
[0078]增效的抗肿瘤制剂
[0079]本发明人还发现，在将应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的⑶4阳性T淋巴细胞过继移植给荷瘤小鼠后，该种细胞对于荷瘤小鼠的抗肿瘤效果显著优于以未经组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的CD4阳性T淋巴细胞过继移植的情形。因此，本发明还提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备增效的CD4阳性T淋巴细胞制剂中的用途。所述的增效的CD4阳性T淋巴细胞制剂可以是一种含有经去乙酰化酶抑制剂处理的CD4阳性T淋巴细胞的细胞液制剂。所述的去乙酰化酶抑制剂处理可以是在体的处理，或是离体的处理。
[0080]本发明人的研究还意外地发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与抗人细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抗体共同给药可以进一步促进淋巴细胞的浸润，对于肿瘤生长的抑制作用也更强，两者共用产生了极其显著的增效作用，可大大增加实验动物的生存时间。
[0081]因此，本发明还提供了药物组合物，它含有有效量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂与抗CTLA-4抗体，以及药学上可接受的载体。
[0082]通常，可将所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂与抗CTLA-4抗体配制于无毒的、惰性的和与所述的细胞相容的介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
[0083]如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。
[0084]如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对癌症患者产生功能或活性的且可被癌症患者所接受的量。
[0085]如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，也即属于一种药学上可接受的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub.C0.，N.J.1991)中可找到关于“药学上可接受的”的充分说明。在组合物中与所述学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。
[0086]本发明的组合物含有安全有效量的所述的细胞