以及与所述细胞相容的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
[0087]在使用本发明的组合物时，是将安全有效量的本发明的细胞施用于哺乳动物。当然，具体的给予剂量和给予次数还应考虑所施与的患者的体重、年龄、健康状况等因素，这些都是本领域熟练人员技能范围内的。
[0088]本发明的组合物可直接用于升高⑶4阳性T淋巴细胞或用于抑制肿瘤。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
[0089]本发明还提供了一种用于升高⑶4阳性T淋巴细胞或用于抑制肿瘤的药盒，包括:
[0090]容器1，其中包括:有效量(如0.1-2000 μ M)的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，以及药学上可接受的载体；和
[0091]容器2，其中包括:有效量(如0.1-1OOOmg)的抗CTLA-4抗体，以及药学上可接受的载体。
[0092]所述的药盒是便于本领域技术人员特别是临床医生应用的。作为本发明的优选方式，所述的药盒中还包括使用说明书，以指导本领域人员采取适合的方法给药。
[0093]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0094]实施例1、TSA通过促进⑶4阳性T淋巴细胞的浸润来抑制肿瘤生长
[0095]HDAC抑制剂被认为具有潜在的抗肿瘤效果。但是，其具体治疗机制并不清楚。
[0096]本发明人给C57BL/6小鼠和缺失成熟T淋巴细胞的裸鼠肌肉注射B16F0细胞(该细胞购自Jackson)、建立了 B16F0的黑色素瘤模型。首先，为了确定TSA抗肿瘤的最佳浓度，在C57BL/6小鼠和缺失成熟T淋巴细胞的裸鼠上建立了黑色素瘤模型，并且施用了两种浓度的TSA0 一种是较低浓度I μ M/kg,另一种是较高浓度3 μ M/kg ο结果发现，在正常小鼠中，这两种浓度的TSA都能够显著抑制肿瘤生长。而在免疫缺陷小鼠中，只有高浓度的TSA能够发挥抗肿瘤作用，而低浓度的TSA的作用完全消失了，如图1A-B。本发明人推测低浓度的TSA是通过T淋巴细胞发挥治疗作用的，而高浓度TSA会直接杀伤肿瘤细胞。为了验证上述推测，本发明人利用同样缺失T淋巴细胞的Ragl基因缺失小鼠(常规方法敲除Ragl基因)，施用TSA，发现低剂量TSA的治疗作用消失了。这说明T淋巴细胞在TSA的抗肿瘤作用中扮演了必不可少的角色。本发明人还使用不同浓度的TSA来体外刺激B1肿瘤细胞，结果发现TSA能够浓度依赖地诱导肿瘤细胞凋亡，提示高浓度TSA可以通过直接杀伤肿瘤细胞来发挥抗肿瘤作用。
[0097]本发明人的这一发现很重要，这是由于:高剂量的TSA对于个体而言副作用很大，而低剂量的TSA会有较少的副作用，也更安全。并且，低剂量的TSA实际上并不发挥直接的抑制肿瘤的作用，其作用是提高CD4阳性的T淋巴细胞的数量。所以，在之后的试验中本发明人都采用的I μ M/kg的TSA来进行研究，研究TSA调节免疫细胞(T淋巴细胞)的机制。
[0098]由于T淋巴细胞可以分为两个亚群，⑶4阳性T淋巴细胞和⑶8阳性T淋巴细胞，本发明人接着研究哪个亚群在低剂量TSA的抗肿瘤效果中起了更加重要的作用。本发明人利用了两株基因敲除的小鼠，i32m缺失的老鼠(购自Jackson)不能产生⑶8阳性T淋巴细胞，而CIITA缺失小鼠(购自Jackson)没有成熟的⑶4阳性T淋巴细胞，如前制备黑色素瘤动物模型，并施用TSA(1 μ M/kg)。本发明人发现，TSA依然能够抑制β 2m缺失的小鼠的肿瘤生长，然而，在CIITA缺失小鼠中，TSA完全没有治疗效果，如图1C。这说明⑶4阳性T淋巴细胞，而非⑶8阳性T淋巴细胞，在TSA的抗肿瘤过程中发挥了至关重要的作用。
[0099]考虑到⑶4阳性T淋巴细胞的这种作用，本发明人检测了正常C57BL/6小鼠中⑶4阳性T淋巴细胞在肿瘤中的浸润情况，分离DMSO组和TSA组(I μΜ/kg)的肿瘤中浸润的淋巴细胞并计数，随后用流式检测CD4+CD62L T淋巴细胞的比例，并且计算统计每克肿瘤中⑶4+⑶62L T淋巴细胞的绝对数目。结果发现，TSA的处理能够显著提高肿瘤浸润细胞中⑶4阳性T淋巴细胞的比例，而且其绝对数量与溶剂处理组也有着显著的差异，如图1D-E。更重要的是，TSA处理小鼠血清中T淋巴细胞相关细胞因子IL-2、IFNy、TNFa、GM-CSF的含量也显著提高，如图1F。综上所述，TSA的给药能够显著提高肿瘤中浸润的⑶4阳性T淋巴细胞，促进抗肿瘤免疫作用，从而抑制肿瘤生长。
[0100]本发明人接下来研究TSA给药下，肿瘤中浸润的CD4阳性T淋巴细胞增加的具体机制。本发明人检测了这些细胞的凋亡情况，通过7-AAD的染色发现，TSA给药组中肿瘤浸润⑶4阳性T淋巴细胞的凋亡显著减少，如图1G。因此提示TSA通过抑制这类细胞的凋亡从而增加其数量来发挥抗肿瘤作用。
[0101]实施例2、HDAC抑制剂能够抑制激活诱导的细胞死亡，从而促进T淋巴细胞杂交瘤的存活
[0102]尽管本发明人证明了 TSA通过提高T淋巴细胞浸润来治疗肿瘤，但是，具体的机制还不清楚。由于HDAC抑制剂被报道促进细胞凋亡，接下来本发明人在体外检测HDAC抑制剂是否对激活的⑶4阳性T淋巴细胞的凋亡有作用。激活的T淋巴细胞主要会经历激活诱导的细胞凋亡(Al⑶)。Al.1细胞(用poly-18/完全弗氏佐剂免疫BALB/cCr小鼠，分离淋巴结T细胞，激活产生T cellblastso将这些细胞与BW5147胸腺瘤细胞融合，选择发生融合的CD4阳性细胞从而得到Al.1细胞)是一种CD4阳性的T淋巴细胞杂交瘤，已被广泛应用于研究Al⑶及其机制。本发明人首先通过用⑶3抗体(ant1-⑶3)激活Al.1细胞来诱导Al⑶，同时加入不同浓度的TSA，24小时后检测Al.1细胞的凋亡水平。出人意料的是，较高浓度的TSA可以完全地抑制Al.1细胞的凋亡，如图2A-B。而且，进一步发现，TSA在Al⑶的起步阶段就抑制了细胞凋亡，如图2C。本发明人还使用了另一种HDAC抑制剂，丁酸钠，以其取代TSA重复了上述实验，并发现了相同结果，如图8。
[0103]既然TSA能够抑制Al.1细胞的凋亡，本发明人推测其能够促进Al.1细胞的存活。为了验证这个推测，本发明人利用台盼蓝染色来检测Al.1细胞的存活情况。结果发现，TSA处理后，台盼蓝阴性，即存活的Al.1细胞数目比未处理组有显著提高，如图2E。本发明人接着还采用了 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)来检测细胞活性，结果发现，TSA可以促进Al.1细胞的活性，如图2D。
[0104]综上，HDAC抑制剂能够通过抑制凋亡进而促进T淋巴细胞存活。
[0105]实施例3、HDAC抑制剂能够抑制T淋巴细胞杂交瘤上FasL的表达
[0106]如前所述，HDAC抑制剂能够抑制T淋巴细胞的AICD。然而，在肿瘤微环境中，有多种T淋巴细胞凋亡的途径，不同途径又是由不同机制调控的。为了具体研究HDAC抑制剂抑制AICD的机制，本发明人检测了 TSA对于其他类型凋亡的抑制情况。分别用放线菌素D、双氧水或者紫外线来诱导Al.1细胞的凋亡。有趣的是，TSA的处理并没有抑制这些刺激诱发的细胞凋亡，反而还有所促进，如图3A。这个结果提示，TSA对于Al⑶的抑制是特异性的，抑制的具体机制也应该与AICD机制相关。
[0107]Al.1细胞的Al⑶是由TCR的激活起始，进而诱导FasL的表达。FasL与Fas的结合会导致胱天蛋白酶的活化，从而激活下游凋亡信号。因此，在该系统中，TSA的作用可能有以下两种，一是TSA能够在早期对FasL的表达产生影响，二是TSA能够抑制FasL-Fas凋亡信号通路。为了研究TSA抑制凋亡的具体机制，本发明人首先检测TSA是否对AICD中Al.1细胞的FasL表达产生影响。本发明人惊喜地发现，TSA不仅从信使RNA水平上，还在蛋白水平上完全抑制FasL的表达，如图3B-D。使用丁酸钠取代TSA进行试验也发现了相似的结果。为了让结果更加可信，本发明人使用⑶90抗体来诱导Al.1细胞上FasL的表达，结果发现，TSA依然能够抑制FasL的表达，从而抑制⑶90抗体诱导的细胞凋亡。综上所述，HDAC抑制剂能够抑制FasL的表达从而发挥其抗凋亡作用。
[0108]为了验证这一结论，本发明人在系统中加入了可溶的FasL，结果发现TSA的抑制效果被逆转了，如图3E。更有趣的是，可溶FasL加入后，TSA反而能够非常显著地促进细胞凋亡。由于这种凋亡需要Fas-FasL的结合，所以本发明人检测了 Al.1细胞上Fas分子的表达，结果发现，TSA能够剂量依赖地促进Al.1细胞表面Fas的表达。
[0109]综上所述，即使TSA提高了 Fas的表达，但是TSA可以完全阻止FasL的表达，因此可以完全抑制Al⑶的发生。
[0110]实施例4、TSA通过抑制FasL表达，来抑制原代⑶4阳性T淋巴细胞的Al⑶
[0111]就像本发明人之前总结的，HDAC抑制剂能够通过抑制Al.1细胞FasL表达来抑制其AICD的发生。但是，本发明人使用的Al.1细胞是人工制作的，在原