一种制剂、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及再生医学和生物学技术领域，尤其设及一种制剂、其制备方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 外泌体（exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies， MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞 分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAsW及信号分子等具有生物学活 性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细 胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。
[0003] 糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软 组织及骨关节系统的破坏与崎形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严 重的溃瘍、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。对于糖尿病足的治疗，一般 采用药物或手术治疗，更甚者采取截肢等手段，治疗效果一般，且对病人产生的创伤较大， 糖尿病足的治疗还采用足静脉细胞注射，但在注射过程中细胞会随血液而流失，起效时间 长，治疗效果一般。
[0004] 现有研究已证明厮带干细胞(MSC)分泌的外泌体在减少屯、肌损伤范围、保护急性 肾小管损伤、促进神经再生W及减少肺损伤等方面有重要作用。而对外泌体的生物特性与 功能机制的深入研究对认识并解决MSC应用中产生的问题有重要作用。并且，外泌体的应用 较之MSC直接应用更为安全，可W开启非细胞治疗的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题在于提供一种制剂，本申请提供的制剂可用于预防和/或 治疗糖尿病足。
[0006] 有鉴于此，本申请提供了一种制剂，包括:外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂， 所述外泌体由厮带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
[0007] 优选的，所述溶剂为生理盐水。
[000引优选的，所述外泌体为所述制剂的2vol %~5vol %，所述白蛋白为所述制剂的 0.5vol%~5vol%，所述生理盐水为余量，所述外泌体的含量为lX106~lX107cells所提 取出来的外泌体总量。
[0009] 优选的，所述外泌体的含量为5 X IO6Cells所提取出来的外泌体总量。
[0010] 优选的，所述外泌体由所述厮带干细胞传代培养至3~5代后提取得到。
[00川本申请还提供了一种制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0012] 在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白；
[0013] 在上述得到的溶液中加入外泌体;所述外泌体由厮带干细胞依次经过原代培养、 传代培养和提取得到。
[0014] 优选的，所述溶剂为生理盐水。
[0015] 本申请还提供了上述方案所述的或上述方案所制备的所述的制备方法所制备的 制剂在预防和/或治疗糖尿病足上的应用。
[0016] 本申请提供了一种制剂，其包括外泌体、白蛋白和生理盐水，所述外泌体由厮带干 细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。本申请所述制剂中的外泌体中含有多种活 性细胞因子，可刺激和促进足部的血管、神经末梢的修复再生，改善足部营养和触感的恢 复，从而使得溃烂的皮肤组织再生，因此对糖尿病足具有预防与治疗作用。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明厮带干细胞2代培养后不同放大倍数下的形貌照片；
[0018] 图2为本发明外泌体不同放大倍数下的形貌照片；
[0019] 图3为本发明厮带干细胞对照组流式检测图；
[0020] 图4为本发明厮带干细胞样品组流式检测图。
【具体实施方式】
[0021] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是 应当理解，运些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的 限制。
[0022] 本发明实施例公开了一种制剂，其包括:外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂， 所述外泌体由厮带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。
[0023] 本申请所述制剂包括外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂，本申请所述制剂中 由于包含外泌体，因此其可用于预防和/或治疗糖尿病足。
[0024] 按照本发明，所述外泌体是由厮带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取制 备得到。所述厮带干细胞的原代培养按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述厮带干细 胞经过原代培养后进行传代培养，所述传代培养的方式为本领域技术人员熟知的，本申请 不进行特别的限制。作为优选方案，本申请所采用的厮带干细胞均为P2~P5代。所述厮带干 细胞经过传代培养后进行提取，得到外泌体。本申请所述外泌体的提取优选按照 invitrogen试剂盒说明书提取。厮带干细胞经过传代培养后提取，得到了外泌体。将所述外 泌体进行保存W备用。
[0025] 本申请提供的制剂，包括外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂。由于本申请提供 的制剂用于治疗糖尿病足，所述制剂的溶剂优选为生理盐水。在所述制剂中，所述外泌体为 优选为所述制剂体积浓度的2%~5%，更优选为2.5%~4.5%，具体的，所述外泌体的含量 为所述制剂体积浓度的2.5%、3%、3.2%、3.5%、4%、4.3%或4.5%。本申请所述外泌体的 含量为1 X IO6~1 X IO7厮带干细胞所提取出来的外泌体总量，优选为5 X IO6~1 X IO7厮带 干细胞所提取出来的外泌体总量。本领域技术人员熟知的，临床应用外泌体时，不会计算外 泌体的具体数量，只对提取外泌体的细胞数目进行控制，运是由于用于提取外泌体的培养 基都是基础培养基，其不含血清等营养物质，目的就是为了让细胞不再分裂增殖，使细胞 "同步化"；在营养相对缺少的微环境下，干细胞自身会分泌很多的活性因子到胞外，即外泌 体。所W，当细胞性质一致时，同种类型、相同数量的细胞分泌的外泌体的数量差异不大。
[0026] 所述白蛋白为本领域技术人员熟知的人血白蛋白，其为市售产品或按照现有已知 的方法提取得到。本申请所述白蛋白优选为所述制剂总体积浓度的0.5%~5%，更优选为 1 %~4%，具体的所述白蛋白的含量为所述制剂体积浓度的1%、1.2%、1.5%、1.8、2%、 2.5%、2.8%、3%、3.2%、3.5%、3.8%或4%。如果人血白蛋白的浓度过大，制剂进入到人 体组织中，会产生较大的渗透压，足部会形成局部水肿；如果人血白蛋白的浓度过小，不利 于组织的愈合修复。
[0027] 本申请还提供了所述制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0028] 在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白；
[0029] 在上述得到的溶液中加入外泌体。
[0030] 在制备所述制剂的过程中，将保存的外泌体取出，在4°C环境中溶解。本申请所述 制剂的溶剂优选为生理盐水。
[0031] 按照本发明，首先在生理盐水中添加人血白蛋白，配制含有人血白蛋白的生理盐 水，然后再含有人血白蛋白的生理盐水中添加外泌体，得到制剂。本申请所述制剂的剂型为 本领域技术人员熟知的，对此本申请不进行特别的限制。
[0032] 本申请提供了一种制剂，其包括外泌体、白蛋白与医学可接受的溶剂。本申请采用 干细胞外泌体进行组织注射，其可避免血液流动而造成外泌体的损失，外泌体可直接修复 损伤组织，增强未损伤组织的抵抗能力，大大缩短组织的修复时间上。同时外泌体制剂不具 有免疫原性，可适用于任何个体，在提取后可长时间保存，在应用时制剂制备更为方便，避 免了细胞治疗方案需要重新培养细胞等的操作。
[0033] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的制剂及其应用进行详细 说明，本发明的保护范围不受W下实施例的限制。
[0034] 实施例1
[0035] 1)厮带干细胞原代培养