[0036] 取健康足月剖腹产婴儿的厮带，于超净台中进行无菌清洗，剥离厮带羊膜和动静 脉，取出沃顿胶，用手术剪进行剪碎，用DMEM+10%FBS完全培养基重悬后接种至15cm平皿 中，转移至5 % C〇2,37 °C的环境中培养。
[0037] 于5天后补液，直至细胞爬出，弃去组织块，补充新的完全培养基继续培养，待细胞 形成较大的克隆，即可传代培养。
[0038] 2)厮带干细胞传代培养
[0039] ①取可传代的PO代细胞，弃掉皿内原培养液，加入IOmLPBS缓冲液轻轻冲洗细胞生 长面，弃去洗液。
[0040] ②加入2mL0.25%膜蛋白酶，左右摇晃平皿使膜酶均匀覆盖于皿底；显微镜下观察 可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基 终止消化。
[0041] ③反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离屯、管中，室溫离屯、 1500rpm/5min。
[00创④弃上清，加入DMEM+10%FBS完全培养基重悬细胞，按密度为lX105cells传代培 养。将培养瓶置于37 °C、5 %二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
[0043]⑤待细胞生长至融合时，重复操作⑤进行细胞扩增培养。如无说明，本研究中所用 人厮带干细胞均为P2至P5代，如图I所示，图I为厮带干细胞P2代在不同放大倍数下的细胞 形态照片，其中图Ia为厮带干细胞P2代在40倍放大倍数下的细胞形态照片，图Ib为厮带干 细胞P2代在100倍放大倍数下的细胞形态照片。图3和图4分别为厮带干细胞对照组与本实 施例传代培养的厮带干细胞的流式检测图，由图3和图4可知，本实施例培养的厮带干细胞 是合格的。
[0044] 3)外泌体的分离
[0045] 收集P2-P5代UC-MSCs培养上清，按照invitrogen试剂盒说明书提取外泌体。
[0046] 具体步骤为:将培养上清转至高速离屯、管中，4°C，离屯、，2000g/30min，去除细胞碎 片。取上清，转移至新的高速离屯、管中，W细胞上清液:试剂= 2:1的比例加入试剂，用祸旋 器充分混匀后，置于冰箱中4°C过夜解育。在4°C坏境中1000 Og离屯、60min，弃去上清，用10化 L 4°C的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液，置于-20°C保存。
[0047] 4)外泌体鉴定
[004引取分离纯化外泌体10化，按体积比=1:1，加入4 °C的PBS溶液稀释后滴加于2mm的 载样铜网上，于室溫静置Imin后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3% (w/v)憐鹤酸钢溶液 (PH6.8)室溫负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一遍后室溫惊干，于透射电镜观察并照相。随机选 取20个外泌体测量其直径。如图2所示，图2为本发明外泌体在不同放大倍数下的形态照片， 图2a为外泌体10000倍下的形态照片，图2b为外泌体在20000倍下的形态照片。
[0049] 实施例2
[0化0] 从-20°C取出外泌体，4°C环境中溶解后，按组成：外泌体+1 %人血白蛋白+生理盐 水混匀，充分混匀后置于4°C环境中保存备用，外泌体的含量为：1 X IO6~1 X IO7Cells所提 取出来的外泌体总量，其中优选用量为SXlO6Cells所提取出来的外泌体总量。
[0化1] 配制具体步骤：
[0化2] ①往生理盐水中添加20%的人血白蛋白，使其终体积浓度为1%，配制1%人血白 蛋白的生理盐水体积为2~5mL。
[0化3] ②往含有1 %人血白蛋白的生理盐水中添加体积为10化L、5 X IO6Ce 11S所提取出 来的外泌体总量。
[0054] 实施例3
[0055] 选取具有糖尿病足的裸鼠80只，随机分成4组，每组20只。分别注射下面四种制剂， 分别于1个月和3个月后评价治疗糖尿病足的效果，其中间歇性贩行评分按照下述文章进行 评价：王广宇，朱旅云，马利成.《干细胞移植治疗糖尿病足》，中国组织工程研究，2013,17 (1): 173-180。结果如表1所示。
[0056] 按照实施例2提供的制备方法配制W下制剂：
[0057] A:外泌体（lX106cells)+l%人血白蛋白+生理盐水 [005引 B:外泌体(5X106cells)+l%人血白蛋白+生理盐水
[0059] C:外泌体（lX107cells)+l%人血白蛋白+生理盐水
[0060] 0:1%人血白蛋白+生理盐水
[0061] 表1不同制剂下糖尿病足的治疗效果数据表
[0063]表1不同制剂下糖尿病足的治疗效果数据表(续表）
[00化]从上述表格可知:组别A、组别B和组别C均起到改善糖尿病足的作用，而组别D的改 善作用不明显。其中组别B和组另化对下肢间歇性贩行有较为明显(P<0.05)的提高，评分从 2.6左右下降至1.5左右;对皮肤的溫度和经皮氧分压改善也具有较为明显(P<0.05)的改 善，皮肤溫度平均提高了 2°C，提示了可明显(P<0.05)的改善了血液循环，缺血性指标得到 较明显的改善。
[0066] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行 若干改进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0067] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对运些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可W在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的运些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种制剂，包括：外泌体、白蛋白与医学上可接受的溶剂，所述外泌体由脐带干细胞 依次经过原代培养、传代培养和提取得到。2. 根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述溶剂为生理盐水。3. 根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述外泌体为所述制剂的2vol %~ 5vol %，所述白蛋白为所述制剂的0.5vol %~5vol %，所述生理盐水为余量，所述外泌体的 含量为1 X 1〇6~1 X l〇7cells所提取出来的外泌体总量。4. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述外泌体的含量为5X106cells所提取出 来的外泌体总量。5. 根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述外泌体由所述脐带干细胞传代培养至 3~5代后提取得到。6. -种制剂的制备方法，包括以下步骤： 在医学上可接受的溶剂中加入白蛋白； 在上述得到的溶液中加入外泌体;所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代 培养和提取得到。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为生理盐水。8. 权利要求1~5任一项所述的或权利要求6~7任一项所述的制备方法所制备的制剂 在预防和/或治疗糖尿病足上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种制剂，其包括外泌体、白蛋白和医学上可接受的溶剂，所述外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养和提取得到。本申请所述制剂中的外泌体含有多种活性细胞因子，可刺激和促进足部的血管、神经末梢的修复再生，改善足部营养和触感的恢复，从而使得溃烂的皮肤组织再生，因此对糖尿病足具有预防与治疗作用。本申请还提供了所述制剂的制备方法。
【IPC分类】A61K38/38, A61K35/51, A61P17/02, A61P3/10
【公开号】CN105597088
【申请号】CN201610072769
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王一飞, 卢瑞珊
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月2日