一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，设及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失 减毒疫苗的方法。
【背景技术】
[0002] 单纯瘤疹病毒化e巧es simplex virus,服V)是一类严重危害人类健康、引起皮肤 病和性病的常见病原体，HSV- 1最常见的感染部位是口腔和唇，HSV- 2主要通过性传播。美 国每年有生殖器瘤疹5万多例，70多万孕妇为预防胎儿经产道感染HSV而被迫施行剖宫产分 娩。据WHO估计，每年生殖器瘤疹的新发病例约2000万。临床上80%HSV感染者表现为无症状 感染或症状未被识别，运是造成HSV感染流行的重要因素。
[0003] 尽管现有的抗病毒药物应用能缩短生殖器瘤疹感染的病程，并且其治疗复发性感 染具有一定的效果，但运些抗病毒药物不能有效预防瘤疹病毒原发感染W及控制瘤疹病毒 潜伏感染和复发性感染。研制和接种HSV疫苗是预防该病毒感染的理想方法。
[0004] 动物实验的结果显示，HSV疫苗能预防病毒原发感染，并能有效地控制复发性生殖 器瘤疹感染。目前HSV疫苗的研制日益受到人们的重视，研究较多的HSV疫苗主要有灭活病 毒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、复制受限疫苗、活载体疫苗W及DNA疫苗等。
[000引早期的灭活病毒疫苗是利用加热、化学处理、紫外线照射等方法将接种在鸡胚中 的HSV病毒灭活制备疫苗。现在的灭活疫苗是将在细胞中培养的病毒灭活并经过一系列的 纯化过程制成的。但灭活疫苗存在免疫原性弱、不能诱导机体产生广泛持久的免疫反应、不 能确定是否所有病毒均被灭活、裂解的DNA片段潜在致癌的可能性、生产费用高等缺点。
[0006] 近年来，HSV减毒活疫苗的研制主要集中在特异性地造成HSV病毒基因缺失某一区 段，使HSV的神经毒性减弱，建立潜伏感染的能力降低，DNA复制障碍等，同时保持病毒的增 殖能力和免疫原性运一目标上。但有报道指减毒活疫苗隐患较多，一方面，重组的HSV病毒 经过反复的细胞培养后，仍然不能获得稳定的减毒株，减毒活疫苗可能重新获得病毒毒性； 另一方面，减毒的病毒可能会潜伏于病人体内，有可能会与感染的HSV野生病毒株重组，重 新获得病毒毒性。此外，某些HSV基因也存在致癌的潜在可能。新型DNA疫苗虽能同时诱导体 液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在 单纯瘤疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着重要的作用，由于上述现有 的几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可W在临床 上应用的单纯瘤疹病毒疫苗上市，单纯瘤疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶 段。基因缺陷减毒疫苗是一种利用基因技术方法制备得到的疫苗，结合了减毒活疫苗W及 灭活疫苗的优点。制备方法是将病毒复制必需的基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在经过 遗传改造过的细胞株里生长，W构成性地表达缺失基因的病毒产物。子代病毒缺乏必需基 因产物，因而没有传染性。研究表明，在动物实验中，运种疫苗具有抗HSV原发感染作用。
[0007] 传统的细胞培养生产病毒疫苗，产量低，纯度不高。微载体为单层贴壁细胞的生长 繁殖提供了一个大的表面区域，为细胞生长提供了一个匀质的悬浮培养系统。反应器微载 体培养系统具有很大的优势：1)比表面积大，Ig微载体提供的表面积约等于15个T75规格的 细胞培养瓶提供的表面积，较大的比表面积可有效的节省空间和培养基W及昂贵的添加剂 如血清、生长因子等的成本，提高了培养基的利用率和单位体积细胞的产率;2)有利于反应 器中高效的气液传递，有效的维持细胞生长的关键物理、化学和生物环境;3)反应器微载体 培养系统可用于调整和检测细胞培养所需的抑、P化、剪切力水平、揽拌和营养成分，因此可 实现更严格的调整细胞增殖、分化等不同的生物过程，批次间具有较高的重现性;4)微载体 密度和体积远大于细胞，产物与细胞可方便的分离，换液简单，除了作为错地依赖型细胞增 殖的基质外，微载体也用来提供分化和未分化细胞的放大培养。贴壁细胞的微载体培养系 统被认为是今后对抗传染性疾病大流行的一种关键技术。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的 方法。本发明提供的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法可W大量制备 高质量的单纯瘤疹病毒I型化5基因缺失减毒疫苗，可W实现工业大规模生产瘤疹病毒疫 苗，同时，本发明制备的疫苗可W安全有效的激活人体的免疫应答，降低瘤疹病毒对人体的 感染。
[0009] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： 一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，包括W下 步骤：Sl、敲除单纯瘤疹病毒I型的化5基因，制备单纯瘤疹病毒I型化5基因缺失质粒，即 BAC-HSV-AUL5质粒；S2、构建PCDNA3.1-UL5真核表达质粒并转染到Vero细胞，使Vero细胞 表达化5蛋白，制备表达化5蛋白的Vero细胞;S3、微载体扩增培养S2所述的表达化5蛋白的 Vero细胞;S4、将Sl所述的BAC-HSV-A化5质粒转染至不加微载体常规培养的表达化5蛋白 的Vero细胞中，3-5天后观察到细胞有病变并且出现空斑，再收集细胞反复冻融获得病毒悬 液;S5、将S4收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到S3中微载体培 养的表达化5蛋白的Vero细胞培养基中；S6、收集S5中的培养液上清，过滤，得病毒液;S6、病 毒加入冻干保护剂，制成疫苗； 所述单纯瘤疹病毒I型化5基因敲除制备BAC-HSV-A化5质粒的方法包括W下步骤：1) 制备UL5同源重组片段UL5-Kam-sacB;2)将UL5-Kam-sacB基因片段转染至含有BAC-服V-I质 粒的大肠杆菌中，经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了化5-Kam-sacB基因片段的大肠杆菌； 3)鉴定化5成功敲除的菌落，提取BAC-服V-A化5质粒。
[0010] 优选地，所述的化5同源重组片段的制备方法包括W下步骤：1)W抗卡那霉素基因 Kam-sacB为模板，通过PCR扩增制备化5C-Kam-sacB片段，所述PCR扩增的引物包括上游引物 CBUL5，其序列为5 ' -CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTC AACAAAGCCA-3'（SEQ ID N0.1)和下游引物UL5ab2，其序列为5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3' (沈Q ID側.2);2)^化5(：-1(3111-33。8片段为模板，通过?0?扩增制备化5同源重组片段，所述 PCR扩增的引物包括上游引物ULSabl，其序列为5 ' -GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTA AGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC-3 '（SEQ ID NO. 3)和下游引物UL5ab2，其序列为 5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3' (沈Q ID NO.2)。
[0011] 优选地，所述的抗卡那霉素基因 Kam-sacB是W Kam-sacB全片段为模板，通过PCR 扩增获得，所述PCR扩增的引物包括上游引物Kam-sacB sense,其序列为5'-CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAA-3 '（ SEQ ID NO . 4)和下游引物Kam-sacB antisense,其序列为5' -GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG -3'（沈Q ID N0.5)。
[001引优选地，所述的PCDNA3.1-UL5真核表达质粒载体的构建包括W下步骤：1) WBAC-HSV-I质粒为模板，通过PCR扩增化5基因片段，所述PCR扩增引物包括上游引物为化5_F，其 序列为5'-AATTGGATCCGAGCGTGGT-GCGGTCATG -3'（沈Q ID 側.6)和下游引物化5_1?，其序列 为5'-AAGCTCGAGAGGGGACG-GCGGGTTAATAG -3'（SEQ ID N0.7);2)用BamHI,趾01 双酶切 PCDNA3.1和扩增的化5基因片段，再用T4连接酶连接PCDNA3.1和化