专利名称：一种缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及用于医学鉴定的人蛋白基因的PCR检测方法。
人α珠蛋白基因簇位于人第16号染色体短臂末端上(16p13.3)，由3个珠蛋白功能基因、2个假珠蛋白基因和1个尚未阐明功能的基因组成，他们在染色体上的排列顺序为5＇-ζ2-ψζ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-3＇，其中α2和α1是2个最重要的珠蛋白功能基因，丢失这2个基因(或其中之一)在内的α类珠蛋白基因簇基因区的大段缺失是一种常见的先天性遗传缺陷现象，在人基因组DNA中检测出这一现象具有理论和实用价值。本技术所针对的类型是从ψα2近5＇端到θ 3＇端下游约4kb的一种缺失范围约20kb的中国人中常见的基因缺失( —SEA/缺失基因)。检测这种基因缺失最早期的技术是溶液分子杂交法(molecularhybridization in solution)(Kan YW,1976)，这一方法通过测定cDNA探针形成杂交分子后的退火百分率来完成检测，该法的缺点是准确性差且一次分析需准备大量DNA。1978年美国人Orkin SH首次采用由Southern于1975年发明的Southern blotting印迹杂交法进行缺失型α珠蛋白基因的检测(OrkinSH,1978)，该法可根据电泳带型图普分析确定是否有基因缺失，结果准确可靠，但其因操作复杂、耗时，且需同位素而难以被作为实验室的常规方法。1985年正式面世的PCR(polymerase chain reaction，多聚酶链式反应)技术为检测基因缺失提供了一个有用的工具，检测α珠蛋白基因缺失的PCR技术首先报告于1987年(Chehab FF,1987)。由于其引物所扩增的区域位于基因缺失区内，故它是一种凭阴性扩增结果诊断2条染色体人α-珠蛋白基因都缺失的一种方法。本法最大的缺陷是只能诊断遗传学上的缺失纯合子而不能区分正常和杂合子样品，又因PCR过于敏感，产生假阳性结果的风险甚大。在此基础上改进的采用跨越断裂点的PCR技术(也称裂口PCR,gap-PCR)进行人缺失型α珠蛋白基因的方法诊断是近几年方法学上的一个重要进展。gap-PCR采用三引物构成两对独立的跨越2个断裂点的PCR反应的新型设计，其扩增产物分别代表正常和—SEA/缺失基因，能明确区分正常、—SEA/缺失基因杂合子和—SEA/缺失基因纯合子三种基因型。该法最先由台湾人Chang JG报导(Chang JG,1991年)，随后又有多名研究者发表了同一设计思想的而采用不同引物的方法学学术论文(KoTM,1992；Bowden DK,1992；Chen TP,1993；Liu TC,1994；Fucharoen G,1994；Kuo PL,1994；Winichagoon P,1995；Kitsirisakul B,1996；Chan AY,1996；SimkinsRA,1998.)。我们也于1992年于国内最先报告了有自主引物设计的检测人α珠蛋白基因缺失的gap-PCR技术(徐湘民等，1992)。根据在方学法研究中选用各种引物进行的的大量实验观测，我们发现由于现有方法均采用三引物设计方案及传统的引物序列构成，使在同一反应体系中进行2个PCR反应时，引物的浓度难以把握，从而导致检测结果重复性差同时也由于该设计方案在选择引物位点上的局限性，其检测结果只能提供是否存在—SEA/基因这一单一信息量。
本发明的目的是针对目前对人缺失型α珠蛋白基因检测技术所存在的问题而提出一种能简化操作、提高检测的重复性和可靠性、一次检测能提供多种有价值的特定α珠蛋白基因缺失信息的缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测新方法。
本发明的技术方案包括对人基因组DNA待测样品的PCR扩增和对经PCR扩增后的产物进行电泳分析，其特征在于采用4个(2对)引物P1、P2、P7、P4组成2对PCR反应，分别针对正常等位基因和缺失等位基因(—SEA/基因)，该PCR体系的引物设计方案包括(1)引物P1和P2组成一对扩增—SEA/基因的引物，这2个引物采用上述跨越断裂点的gap-PCR引物设计方案，即这2个引物分别位于该缺失基因5’断裂点的上游和3’断裂点的下游；引物P7、P4组成一对扩增正常等位基因的引物，这2个引物的结合点均位于缺失区内，且引物所在区域是—SEA/、-α3.7/和-α4.2/这三种基因的共同缺失点。通过这一新的设计，当被检人基因组DNA中出现涉及—SEA/、-α3.7/和-α4.2/这三种基因的一些特定组合情况时，该对用作参照的扩增引物的检测结果将提供新的信息。此外，这一方案因消除了采用3个引物的现有技术中2个特异性引物在反应时竞争同1个共同引物的状况，有利于确定2对在同一体系下反应的引物浓度和增强特异性。(2)在每条引物的特异性基因序列的5＇端连上一段由20个核苷酸组成的与人类基因不同源的序列，该20个核苷酸长度的寡核苷酸与特异性引物序列直接(不间隔)连接，其合成方式与普通引物相同，这样，构成此2重PCR体系的4个这种加长的寡核苷酸引物的5’端均含有一个共同尾序列，从而使在PCR反应的退火环节4个引物有尽可能一致的结构基础并使延伸步骤的起步条件齐同，从而实现在同一反应体系条件下2个不同长度和序列的特异性片段的同时扩增。
本发明所设计的4个优选引物的序列为P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3’；P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3’；P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCACTTCCTGTGTCACGGT-3’；P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3’。
本发明检测方法的具体检测过程依次包括如下步骤(1)PCR扩增(1.1)在灭菌eppendorf试管中，分别加入等体积等浓度的4个PCR引物P1,P2,P4和P7贮存液，引物的浓度范围为0.1～1.0μmol/L；等浓度的4种脱氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP贮存液，每种dNTP的浓度范围为100～300μmol/L；反应缓冲液，内含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/LKCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明胶0.15mg/ml，再加入人基因DNA待测样品，混匀；(1.2)短暂离心后进行PCR循环；(2)电泳鉴定PCR产物，通过观察电泳凝胶上出现的荧光谱带(DNA扩增带)的数目分析结果若出现P4+P7扩增产物的长度为正常基因片段；若出现P1+P2扩增产物的长度则为缺失型α珠蛋白基因片段。
根据本发明的新方案所建立的缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法，经实验证实可在同一试管内同时实现2对特异性PCR引物的扩增，且有很好的重复性。该项技术可通过在电泳凝胶上出现的荧光普带(DNA扩增带)的数目和组合情况正确区分以下三种α珠蛋白基因的基因型—SEA/、—SEA/—SEA和αα/αα。其检测效果有如下4种情形(1)若只有P4+P7扩增产物，排除缺失型α珠蛋白基因(—SEA/基因)。该样品为正常的基因型(αα/αα)或含点突变的α珠蛋白基因的基因型(ααT/αα或ααT/ααT)。(2)若只有P1+P2扩增产物，样品的基因型为—SEA/—SEA或α—/—SEA。(3)若同时有P4+P7扩增产物和P1+P2扩增产物，该样品的基因型为—SEA/αα或ααT/—SEA。(4)若无阳性扩增带出现，排除样品质量的原因后，该样品的基因型为-α/-α(包括-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2和-α3.7/-α4.2)。
实施例一检测缺失型人α珠蛋白基因的具体操作流程依次包括如下步骤(1)PCR扩增(1.1)取0.5ml灭菌eppendorf试管一支，在50μl总反应体积中，分别加入等浓度(浓度为0.5μmol/L)的4个引物
P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3’、P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3’、P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACTTCCTGTGTCACGGT-3’、P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3’的混合贮存液5μl，等浓度(浓度为200μmol/L)的4种脱氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP的混合贮存液5μl，反应缓冲液，内含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明胶0.15mg/ml，再加入人基因DNA待测样品0.5μg，混匀；(1.2)短暂离心后置PCR循环仪中循环95℃预变性5分钟，继续以95℃变性45秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30循环，最后72℃继续延伸7分钟，取出，4℃存放待检测；(2)电泳鉴定PCR产物取步骤(1.2)中最后产物10μl，加1％的琼脂糖凝胶，其中含有0.5μg/ml EB染料；电泳100V电压×30分钟；在紫外透射仪上观察结果扩增产物的长度，正常基因片段(P4+P7)为1052db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)为740db。
实施例二本实施例的检测操作流程基本与实施例一相同，区别在于在步骤(1)PCR扩增采用的引物为P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTGTGTTCTCAGTATTGG-3’、P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTTATATGGGTCTGGAAGTG-3’、P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTACTTCCTGTGTCACGGT-3’、P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTTCCGACCAGCTTAGCAAT-3’；在步骤(2)电泳鉴定PCR产物时，于紫外透射仪上观察结果为扩增产物的长度，正常基因片段(P4+P7)为1050db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)为736db。
实施例三本实施例的检测操作流程基本与实施例一相同，区别在于在步骤(1)PCR扩增采用的引物为P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCCAAGTTCCTATCGGTCGTA-3’、
P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTACTCCTGACCTCGTGATCCA-3’、P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCAGAGCACCTTGCGGCCTTA-3’、P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAATG-3’；在步骤(2)电泳鉴定PCR产物时，于紫外透射仪上观察结果为扩增产物的长度，正常基因片段(P4+P7)为945db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)为538db。
权利要求
1．一种缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法，包括对人基因DNA待测样品的PCR扩增和对经PCR扩增后的产物进行电泳分析，其特征在于采用4个(2对)引物P1、P2、P7、P4组成2对PCR反应，该PCR体系的引物设计方案为(1)引物P1和P2组成一对扩增—SEA/基因的引物，这2个引物分别位于该缺失基因5’断裂点的上游和3’断裂点的下游；引物P7、P4组成一对扩增正常等位基因的引物，这2个引物的结合点均位于中国人常见的α地贫基因缺失区内，即引物所在区域是—SEA/、-α3.7/和-α4.2/这三种基因的共同缺失点；(2)在每条引物的特异性基因序列的5’端连上一段由20个核昔酸组成的与人类基因不同源的高GC含量的序列，该20个核苷酸长度的寡核苷酸与特异性引物序列直接(不间隔)连接，其合成方式与普通引物相同，这样，构成此2重PCR体系的4个这种加长的寡核苷酸引物的5’端均含有一个共同尾序列。
2．根据权利要求1所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法，其特征在于所采用的4个优选引物的序列为P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3’；P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3’；P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCACTTCCTGTGTCACGGT-3’；P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3’。
3．根据权利要求1或2所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法，其特征在于其检测过程依次包括如下步骤(1)PCR扩增(1.1)在灭菌eppendorf试管中，分别加入；等体积等浓度的4个PGR引物P1,P2,P4和P7贮存液，引物的浓度范围为0.1～1.0μmol／L；等浓度的4种脱氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP贮存液，每种dNTP的浓度范围为100～300μmol/L；反应缓冲液，内含10mmo/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明胶0.15mg/ml，再加入人基因DNA待测样品，混匀；(1.2)短暂离心后进行PCR循环(2)电泳鉴定PCR产物，通过观察电泳凝胶上出现的荧光谱带(DNA扩增带)的数目分析结果若出现P4+P7扩增产物的长度为正常基因片段；若出现P1+P2扩增产物的长度则为缺失型α珠蛋白基因片段。
4．根据权利要求3所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法，其特征在于其检测过程依次包括如下步骤(1)PCR扩增(1.1)取0.5ml灭菌eppendorf试管一支，在50μl总反应体积中，分别加入等浓度的4个引物P1:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3’、P2:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3’、P7:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACTTCCTGTGTCACGGT-3’、P4:5’-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3’的混合贮存液5μl，等浓度的4种脱氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP的混合贮存液5μl，反应缓冲液，内含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明胶0.15mg/ml，再加入人基因DNA待测样品0.5μg，混匀；(1.2)短暂离心后置PCR循环仪中循环95℃预变性5分钟，继续以95℃变性45秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30循环，最后72℃继续延伸7分钟，取出，4℃存放待检测；(2)电泳鉴定PCR产物取步骤(1.2)中最后产物10μl，加1％的琼脂糖凝胶，其中含有0.5μg/ml EB染料；电泳100V电压×30分钟；在紫外透射仪上观察结果扩增产物的长度，正常基因片段为1052db；缺失型α珠蛋白基因片段为740db。
全文摘要
本发明提供一种缺失型人α珠蛋白基因的PCR检测方法,本发明采用4个(2对)引物P1、P2、P7、P4组成2对PCR反应,分别针对正常等位基因和缺失等位基因(－SEA/基因),提供了引物的设计方案和结果的解释。根据本发明的新方案所建立的检测－SEA缺失基因的方法,经实验证实可在同一试管内同时实现2对特异性PCR引物的扩增,且有很好的重复性。本方法除提供－SEA缺失基因检测信息外,还能一次检测提供多种有价值的特定α珠蛋白基因缺失的信息。
文档编号G01N33/50GK1307235SQ0011406
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月3日 优先权日2000年2月3日
发明者徐湘民, 肖维威, 钟雄霖, 刘忠英 申请人:中国人民解放军第一军医大学