专利名称：：一种检测α-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒。
背景技术：
：地中海贫血(Thalassemia)于1925年由Cooley和Lee首先描述，最早发现于地中海区域，当时称为地中海贫血，国外亦称海洋性贫血。实际上，本病遍布世界各地，以地中海地区、中非洲、东南亚、中国南部较多见，美国黑人发病率也较高。在我国，广东、广西、贵州、四川为多发区。地中海贫血是一类由于常染色体遗传性缺陷，引起珠蛋白链合成障碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，因而红细胞易被溶解破坏的溶血性贫血。我国自然科学名词审定委员会建议将本病的名称改为珠蛋白生成障碍性贫血，习惯上仍称之为地中海贫血，简称地贫。地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致。正常成人血红蛋白中的珠蛋白，主要由两种肽链所组成，即a链和P链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成相应肽链的合成障碍,致使血红蛋白的组分改变。a和P地中海贫血最为常见。人类a珠蛋白基因簇位于16Pter-p13.3。每条染色体各有2个有功能的a珠蛋白基因，一对染色体共有4个a珠蛋白基因。大多数a地中海贫血'(简称a地贫)是由于a珠蛋白基因的缺失所致，少数由基卤点突变造成。a-地贫诊断方法分为两类，一类方法是传统的诊断方法，如Hb电泳，等电聚焦，高效液相色谱分析等；另一类方法就是基因分析。随着DNA分析技术的不断发展，诊断该病患者及致病基因携带者的水平不断提高，可以在婚育之前检出缺陷基因携带者，怀孕后对胎儿作产前诊断，宥效阻止此类疾病传给下一代，对提高人口素质有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒。本发明提供的检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒是经PCR产生扩增产物，然后通过溶解曲线分析和/或变性高效液相色谱而得出a-珠蛋白基因缺失和突变的结果的试剂盒，包括如下引物引物1结合于a-珠蛋白基因簇a2基因的第二内含子靠近第三外显子与a1相比缺失7个核苷酸对的序列处；引物2结合于a-珠蛋白基因簇a2基因终止密码子3'下游区；引物3和引物4分别结合于a-珠蛋白基因簇东南亚缺失断接点的上下游的基因组DNA序列。东南亚缺失区域为从a-珠蛋白基因簇的Wa2的5'上游直至G)基因3'端长约20kb的区段。将引物l、引物2、弓l物3和引物4作为第一组引物，本发明提供的试剂盒还可包括如下第二组引物和第三组引物第二组引物由引物5和引物6组成，弓l物5和引物6分别结合于ct-珠蛋白基因簇-a37缺失区域的上下游的基因组DNA;第三组引物由引物7和引物8组成，引物7和引物8分别结合于a-珠蛋白基因簇-a42缺失区域的上下游的基因组DNA。-a3'7缺失区域为从a2至al二个基因之间的约3.7kb的片段。-a4'2缺失区域为从^al的5'端的X2同源序列盒到ctl基因3'端的X1同源序列盒之间4.2kb的片段。所述突变特指点突变，突变的等位基因用aTa表示，aTa包括三种类型aesa(HbConstantSpring)、aQSa(广西突变)和(1^(1。所述引物l的序列如序列表的序歹ljl所示，所述引物2的序列如序列表的序歹ij2所示，所述引物3的序列如序列表的序列3所示，所述引物4的序列如序列表的序列4所示，所述引物5的序列如序列表的序列5所示，所述引物6的序列如序列表的序列6所示，所述引物7的序列如序列表的序歹ij7所示，所述引物8的序列如序列表的序列8所示。所述试剂盒还包括非特异性的嵌入荧光染料。所述荧光染料为SYBRGreenI。所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR仪或变性高效液相色谱仪。所述试剂盒还包括Realtime-PCR的常规试剂。所述Realtime-PCR的常规试剂包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCh和TaqDNA聚合酶。所述试剂盒可应用于a-地中海贫血的人群筛查、基因诊断和产前基因诊断。本发明还保护包括引物l、引物2、弓l物3和引物4的引物组在制备通过溶解曲线分析和/或变性高效液相色谱检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒中的应用；所述引物l结合于a-珠蛋白基因簇a2基因的第二内含子靠近第三外显子与a1相比缺失7个核苷酸对的序列处；所述引物2结合于a-珠蛋白基因簇a2基因终止密码子3'下游区；所述引物3和引物4分别结合于a-珠蛋白基因簇东南亚缺失区域的上下游的基因组DNA。所述引物组还包括引物5、引物6、引物7和引物8;所述引物5和引物6分别结合于a-珠蛋白基因簇-a37缺失区域的上下游的基因组DNA;所述引物7和引物8分别结合于a-珠蛋白基因簇-a42缺失区域的上下游的基因组DNA。所述引物l的序列如序列表的序列l所示，所述引物2的序列如序列表的序列2所示，所述引物3的序列如序列表的序歹U3所示，所述引物4的序列如序列表的序列4所示，所述引物5的序列如序列表的序列5所示，所述引物6的序列如序列表的序列6所示，所述引物7的序列如序列表的序列7所示，所述引物8的序列如序列表的序列8所示。本发明提供的试剂盒的应用方法和判读方法如下提取样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别进行以下三个体系的Realtime-PCR反应体系甲用引物l、引物2、引物3和引物4进行PCR反应。体系乙用引物5和引物6进行PCR反应。体系丙用引物7和引物8进行PCR反应。将PCR产物进行溶解曲线分析，所用的荧光染料为SYBRGreenI，仪器自动从6(TC缓慢递增到95'C，然后按如下标准进行结果判读并作出诊断(参见表l):情况l:如果采用体系甲进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在9(rc土rc处出现一个峰，在85"C土TC处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83。C士rC处没有峰；采用体系丙进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C土rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为非缺失型(aa/aa或aa/aTa)<=情况2:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9(TC土rC处出现一个峰，在85'C土rC处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83"C土TC处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C士rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为--SEA/aa或—SEA/aTa。情况3:如果采用体系甲进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在9(rc士rc处没有峰，在85'C土rC处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83"C土rC处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C士rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为一SEA/—SEA。情况4:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9(TC土rC处出现一个峰，在85。C士rC没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83'C土rC处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5X:士rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a37aa。情况5:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9(TC土rC没有峰，在85'C土rC处没有峰；采用体系乙进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在83'c土rc处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C士rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-(137-(137。情况6:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在90。c士rc处出现一个峰，在85'C士rC处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83t:土rc处没有峰；采用体系丙进行pc財广增，扩增产物的溶解曲线在82.5t:士rC处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a42/aa。情况7:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9(TC土rC处没有峰，在85。c士rc处没有峰；采用体系乙进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在83。C士rC处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C土rC处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a4'7-a42。情况8:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9(TC士rC处没有峰，在85。C士rC处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83。c士rc处出现一个峰；采用体系丙进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在82.5t:士rC处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-c^'7--SEA。情况9:如果采用体系甲进行PC財广增，扩增产物的溶解曲线在9(rc土rc处没有峰，在85'C土rC处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83'C士rC处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5。C土rC处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a47--SEA。情况10:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在9o'c士rc没有峰，在85。C士rC处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在83。C土rC处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物的溶解曲线在82.5T:士rC处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a37-a42。表1根据溶解曲线中的特异峰判读样本是否为缺失基因型的标准<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将PCR产物在50。C进行变性高效液相色谱(DHPLC)分析，然后按如下标准进行结果判读并作出诊断(参见表2):情况l:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5土0.lmin处出现一个峰，在l士O.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰；采用体系丙进行PC財广增，扩增产物在2.3土0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为非缺失型(aa/aa或aa/aTa)。情况2:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5士0.lmin处出现一个峰，在l士O.lmin处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰；采用体系丙进行PC財广增，扩增产物在2.3士0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为一SEA/aa或--SEA/aTa。情况3:如果采用体系甲进行PC財广增，扩增产物在5士0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3土0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为一SEA/--SEA。情况4:如果采用体系甲进行PC財广增，扩增产物在5土0.lmin处出现一个峰，在l士O.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lrain处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3土0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a37/aa。情况5:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5土0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3土0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a37-a3'7。情况6:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5土0.lmin处出现一个峰，在l土O.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰；采用体系丙进行PC財广增，扩增产物在2.3土0.lmin处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a"/aa。情况7:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5士0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰;采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3土0.lmin处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a47-a42。情况8:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5土0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3士0.lmin处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a3'7—SEA。情况9:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5土0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处出现一个峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处没有峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3士0.lmin处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a42/--SEA。情况10:如果采用体系甲进行PCR扩增，扩增产物在5士0.lmin处没有峰，在1±0.lmin处没有峰；采用体系乙进行PCR扩增，扩增产物在2.5±0.lmin处出现一个峰；采用体系丙进行PCR扩增，扩增产物在2.3土0.lmin处出现一个峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为-a37-表2根据DHPLC图谱中的特异峰判读样本是否为缺失基因型的标准<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>将体系甲的PCR产物在63.8-64.(TC进行变性高效液相色谱(DHPLC)分析，然后按如下标准进行结果判读并作出诊断(参见表3):情况l:如果扩增产物在4.8-4.9min处出现一个单峰，在4.1-4.2rain处没有峰，在4.2-4.4min处没有峰，在4.5-4.6min处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为非突变型(aa/aa)。情况2:如果扩增产物在4.8-4.9min处出现一个双峰，在4.卜4.2min处出现一个双峰，在4.2-4.4min处没有峰，在4.5-4.6min处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为aesa/aa。情况3:如果扩增产物在4.8-4.9min处出现一个单峰，在4.1-4.2min处没有峰，在4.2-4.4min处没有峰，在4.5-4.6min处出现一个双峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为a"a/aa。情况4:如果扩增产物在4.8-4.9min处没有峰，在4.1-4.2min处没有峰，在4.2-4.4min处出现一个三重峰，在4.5-4.6min处没有峰；针对a-珠蛋白基因，样本的基因型为awsa/aa。表3根据DHPLC图谱中的特异峰判读样本是否为突变基因型的标准<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>应用本发明的试剂盒，可以对样本所携带的a-珠蛋白编码基因进行分型，从而判断样本是否为a地中海贫血患者以及样本属于哪种a地中海贫血患者。应用本发明的试剂盒进行检测，具有速度快、自动化、高通量(可同时进行多个样本)、无需使用污染性药品等优点。本发明具有深远的社会意义。图1为第一组样本和第四组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线。图2为第二组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线。图3为第三组样本、第六组样本和第八组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线。图4为第一组样本、第二组样本、第四组样本和第五组样本体系乙的扩增产物的溶解曲线。图5为第一组样本、第二组样本、第六组样本和第七组样本体系丙的扩增产物的溶解曲线。图6为第二组样本体系甲的扩增产物的DHPLC谱。图7为第六组样本的扩增产物的DHPLC谱。图7中，7-A为体系甲的扩增产物，7-B为体系丙的扩增产物。图8为第四组样本的扩增产物的DHPLC谱。图8中，8-A为体系甲的扩增产物，8-B为体系乙的扩增产物。图9为第十一组样本的扩增产物的DHPLC谱。图10为第十二组样本的扩增产物的DHPLC谱。图11为第十三组样本的扩增产物的DHPLC谱。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用到的样本为从抗凝外周血白细胞提取的DNA，实施例中共有39个样本，分为十三组，具体如下针对a-珠蛋白基因，第一组，本的基因型为aa/aa(包括3个样本卜l、1-2和1-3)，第二组样本的基因型为--SEA/aa(包括3个样本2-1、2-2和2-3)，第三组样本的基因型为一SEA/—SEA(包括3个样本3-1、3-2和3-3)，第四组样本的基因型为-a3'7/aa(包括3个样本4-1、4-2和4-3)，第五组样本的基因型为-a37/-a"(包括3个样本5-1、5-2和5-3)，第六组样本的基因型为-a47aa(包括3个样本6-1、6-2和6-3)，第七组样本的基因型为-a42/-a42(包括3个样本7-1、7-2和7-3)，第八组样本的基因型为-a37/—SEA(包括3个样本8-1、8-2和8-3)，第九组样本的基因型为-a47—SEA(包括3个样本9-1、9-2和9-3)，第十组样本的基因型为-a37/-a42(包括3个样本10-1、10-2和10-3)，第十一组样本的基因型为aCS(x/aa(包括3个样本11-1、11-2和11-3)，第十二组样本的基因型为aQSot/aa(包括3个样本12-1、12-2和12-3)，第十三组样本的基因型为awsa/aa(包括3个样本13-1、13-2和13-3)。实施例l、珠蛋白基因缺失和突变试剂盒的制备每一人份的试剂盒由以下组分组成体系甲(22ul体系)的组分引物l:5，-TGCGGGCCTGGGCCGCA-3，，浓度为O.6ug/ul，0.6ul;引物2:5，-CCATCGGGCAGGAGGAAC-3，，浓度为O.6ug/ul，0.6ul;引物3:5，-TCGCGGCCTGGGGTTCACTT-3，，浓度为O.6ug/ul，0.4ul;引物4:5，-TGGACTTAAGTGATCCTCCTG-3，，浓度为O.6ug/ul，0.6ul;2.5ul10Xbuffer(含NH4C1)、2.OuldNTP、2.5ulMgCl2、5.Oul甜菜碱(Betaine)、0.5ulSYBRGreenl、lul1U/ulGold-Taq酶、6.3uldH20。体系乙(22nl体系)的组分引物5:5，-CTTTCCCTACCCAGAGCCAGG-3，，浓度为O.06ug/ul，l.Oul;引物6:5，-GCCCAAGGGGCAAGAAGCATG-3，，浓度为O.10ug/ul，0.4ul;2.5ul10Xbuffer(含NH4C1)、2.5ul7-deaza-dGTP/dNTP(7-deaza-dGTP和dGTP等量)、0.02ule-巯基乙醇、1.5ulDMSO、2.5ul甜菜碱(Betaine)、0.5ulSYBRGreenl、lul2U/ulGold—Taq酶、10.08uldH20。体系丙(22ul体系)的组分引物7:5，-TTTGAATGAAGTCCGAGTAGGCAG-3，，浓度为O.10ug/ul，l.Oul;引物8:5'-CCCTGGGTGTCCAGGAGCAAGCC-3，，浓度为O.10ug/ul，0.3ul;2.5ul10Xbuffer(含NH4C1)、2.5ul7-deaza-dGTP/dNTP(7—deaza-dGTP和dGTP等量)、0.02ulP-巯基乙醇、l.OulDMSO、2.5ul甜菜碱(Betaine)、0.5ulSYBRGreenl、lul2U/ulPlus—Taq酶、10.68uldH20。实施例2、珠蛋白基因缺失和突变试剂盒的应用应用实施例1制备的试剂盒对13组(39份)样本进行检测。每个样本的检测步骤如下一、PCR扩增提取样本的基因组DNA，以3ul基因组DNA为模板，分别进行以下三个体系的Realtime-PCR反应(ABI-5700实时PC財广增仪)体系甲用体系甲进行PCR反应。体系乙用体系乙进行PCR反应。体系丙用体系丙进行PCR反应。体系甲的PCR反应条件:94°ClOrain—94°C20s、64°C30s、72°C40s—94°C20s、63°C30s、72°C40s—94°C20s、62°C30s、72°C40s—94°C20s、61°C30s、72°C40s;34个循环一72°C6min。体系乙和体系丙的PCR反应条件94°ClOmin—94°C20s、65°Clmin、72°C2min—94°C20s、64。Clmin、72°C2min—94°C20s、63°Clmin、72。C2min—94°C20s、62°Clmin、72°C2min—94°C20s、61°Clmin、72°C2min;34个循环一72。C6min。二、溶解曲线分析和变性高效液相色谱分析(一)溶解曲线分析分别将用ABI-5700实时PCR检测仪扩增得到的第一组至第十组的样本直接进行60°C至95°C的溶解曲线分析。每组中的3个样本都显示相同或相近似的溶解曲线。结果见表4。表4通过溶解曲线分析检测样2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>第一组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图l的曲线l，体系乙的扩增产物的溶解曲线见图4的曲线3，体系丙的扩增产物的溶解曲线见图5的曲线3。第二组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图2的曲线1和曲线2(曲线l为样本2-l，曲线2为样本2-2)，体系乙的扩增产物的溶解曲线见图4的曲线4，体系丙的扩增产物的溶解曲线见图5的曲线4。第三组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图3的曲线1。第四组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图1的曲线2，体系乙的扩增产物的溶解曲线见图4的曲线1。第五组样本体系乙的扩增产物的溶解曲线见图4的曲线2。第六组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图3的曲线3，体系丙的扩增产物的溶解曲线见图5的曲线1。第七组样本体系丙的扩增产物的溶解曲线见图5的曲线2。第八组样本体系甲的扩增产物的溶解曲线见图3的曲线2。(二)DHPLC分析1、变性高效液相色谱(50°C)分析分别将第一组至第十组的样本的三个体系的PCR产物在5(TC进行变性高效液相色谱(DHPLC)分析。每组中的3个样本都显示相同或相近似的曲线。结果见表5。表5通过DHPLC分析检测样本的基因型结果(50°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>第十组--++-a3.7/-a4'2第二组样本体系甲的扩增产物的DHPLC谱见图6。第六组样本的扩增产物的DHPLC谱见图7。图7中，7-A为体系甲的扩增产物，7-B为体系丙的扩增产物。第四组样本的扩增产物的DHPLC谱见图8。图8中，8-A为体系甲的扩增产物，8-B为体系乙的扩增产物。2、变性高效液相色谱(63.8°C)分析分别将第一组、第十一组、第十二组、第十三组的样本的体系甲的PCR产物在63.8-64.(TC进行变性高效液相色谱(DHPLC)分析。每组中的3个样本都显示相同或相近似的曲线。结果见表6。表6通过DHPLC分析检测样本的基因型结果(63.8°C)4.1-4.2min4.2-4.4min4.5-4.6min4.8匿4.9min基因型诊断结果第一组，---单峰aa/aa第十一组双峰--双峰acsa/aa第十二组-一双峰单峰aQsa第十三组一三重峰—-awsa/aa第十一组样本的扩增产物的DHPLC谱见图9。第十二组样本的扩增产物的DHPLC谱见图IO。第十三组样本的扩增产物的DHPLC谱见图11的曲线1和曲线2。序列表〈110〉首都医科大学附属北京朝阳医院<120〉一种检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒<130>CGGNARY81959<160>8〈210〉1〈211〉17<212>腿<213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉1tgcgggcctgggccgca17<210>2〈211〉18<212>腿〈213〉人工序列<220><223〉<400>2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>〈220〉〈223〉<400>5ctttccctacccagagccagg21〈210〉6〈211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220><223><400〉6gcccaaggggcaagaagcatg21〈210〉7<211>24<212〉醒〈213>人工序列〈220〉<223><400>7tttgaatgaagtccgagtaggcag24<210〉8<211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223><400〉8ccctgggtgtccaggagcaagcc2权利要求1、一种通过溶解曲线分析和/或变性高效液相色谱检测α-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒，包括如下一组引物引物1结合于α-珠蛋白基因簇α2基因的第二内含子靠近第三外显子与α1相比缺失7个核苷酸对的序列处；引物2结合于α-珠蛋白基因簇α2基因终止密码子3′下游区；引物3和引物4分别结合于α-珠蛋白基因簇东南亚缺失区域的上下游的基因组DNA。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如下两组引物第二组引物由引物5和引物6组成，引物5和引物6分别结合于a-珠蛋白基因簇-a37缺失区域的上下游的基因组DNA;第三组引物由引物7和引物8组成，引物7和引物8分别结合于a-珠蛋白基因簇_a"缺失区域的上下游的基因组DNA。3、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述引物l的序列如序列表的序列l所示，所述引物2的序列如序列表的序歹lj2所示，所述引物3的序列如序列表的序列3所示，所述引物4的序列如序列表的序列4所示，所述引物5的序列如序列表的序列5所示，所述引物6的序列如序列表的序列6所示，所述引物7的序列如序列表的序列7所示，所述引物8的序列如序列表的序列8所示。4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括非特异性的嵌入荧光染料。5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述荧光染料为SYBRGreenI。6、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR仪或变性高效液相色谱仪和Realtime-PCR的常规试剂。7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒应用于a-地中海贫血的人群筛查、基因诊断和产前基因诊断。8、包括引物l、引物2、引物3和引物4的引物组在制备通过溶解曲线分析和/或变性高效液相色谱检测a-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒中的应用；所述引物1结合于a-珠蛋白基因簇a2基因的第二内含子靠近第三外显子与a1相比缺失7个核苷酸对的序列处；所述引物2结合于a-珠蛋白基因簇a2基因终止密码子3'下游区；所述引物3和引物4分别结合于a-珠蛋白基因簇东南亚缺失区域的上下游的基因组DNA。9、如权利要求8所述的应用，其特征在于所述引物组还包括引物5、引物6、引物7和引物8;所述引物5和引物6分别结合于a-珠蛋白基因簇-a37缺失区域的上下游的基因组腿；所述引物7和引物8分别结合于a—珠蛋白基因簇-a"缺失区域的上下游的基因组DNA。10、如权利要求9所述的应用，其特征在于所述引物l的序列如序列表的序列l所示，所述引物2的序列如序列表的序列2所示，所述引物3的序列如序列表的序列3所示，所述引物4的序列如序列表的序歹ij4所示，所述引物5的序列如序列表的序列5所示，所述引物6的序列如序列表的序列6所示，所述引物7的序列如序列表的序列7所示，所述引物8的序列如序列表的序列8所示。全文摘要本发明公开了一种检测α-珠蛋白基因缺失和突变的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括如下一组引物引物1结合于α-珠蛋白基因簇α2基因的第二内含子靠近第三外显子与α1相比缺失7个核苷酸对的序列处；引物2结合于α-珠蛋白基因簇α2基因终止密码子3′下游区；引物3和引物4分别结合于α-珠蛋白基因簇东南亚缺失区域的上下游的基因组DNA。应用本发明的试剂盒，可以对样本所携带的α-珠蛋白编码基因进行分型，在婚育之前检出缺陷基因携带者，怀孕后对胎儿作产前诊断，有效阻止此类疾病传给下一代，对提高人口素质有重要意义。应用本发明的试剂盒进行检测，具有速度快、自动化、高通量、无需使用污染性药品等优点。文档编号C12Q1/68GK101413032SQ20081022789公开日2009年4月22日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者刘敬忠申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院