专利名称：马氏珠母贝热休克蛋白90基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及海洋经济种马氏珠母贝(/^cteife martensii (Dunker)热休克蛋白90 (HSP90)基因的核苷酸序列和其所编码的热休克蛋白 90的氨基酸序列。
背景技术：
热休克蛋白(Heat shock protein )是从原核生物到真核生物普遍存在的一种高度保守的蛋白质，对维持机体的稳定发挥着重要作用，目前已成为当今世界生命科学研究领域的热点。最早关于HSP的研究是Ritossa于1962年在试验中发现，果蝇唾液腺染色体上出现了特殊的“膨突”。Tissieresr于1974年证实发生这种现象的原因是因为这个过程中产生了一系列分子量为70kDa和^kDa的蛋白质，这些蛋白质被命名为热休克蛋白质。 HSP可提高细胞的应激能力，特别是耐热能力。预先给生物以非致死性的热剌激，可以加强生物对第二次热剌激的抵抗力，提高生物对致死性热剌激的存活率，这种现象称为热耐受。 HSP是一组具有重要生理功能，高度保守的蛋白质分子家族。生理、病理及环境因素等都可诱导热休克蛋白产生，故又称为应激蛋白(Stress Protein) ,HSI^s对机体具有保护性。马氏珠母贝 iPinctada martensii Dunker) 又叫合浦珠母贝 (ft'/^teife/i/cate)，是生产珍珠的主要贝类。广泛分布于中国、日本、印度、澳大利亚等国的热带和亚热带海区。我国主要分布在广东、广西和海南等海区。目前，我国的海水珍珠产业在南海部分地区已成为支柱性产业。目前马氏珠母贝研究的主要方向集中在养殖，育种，病害控制等方面，在功能基因研究领域还是空白，如何利用已知的信息研究马氏珠母贝的主要功能基因是目前研究的热点，而在其中HSP家族基因是必不可少地研究对象，研究马氏珠母贝的HSP家族基因为马氏珠母贝免疫功能的分析具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供马氏珠母贝热休克蛋白90基因的核苷酸序列和其所编码的蛋白的氨基酸序列。本发明通过以下技术方案实现的
马氏珠母贝热休克蛋白90基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。一种由权利要求1所述基因编码的马氏珠母贝热休克蛋白90，其特征在于其氨基序列如SEQ ID No: 2所示。马氏珠母贝热休克蛋白90基因的分离过程包括以下步骤①分析水产类热休克蛋白90的EST序列的同源性；②在高度同源的区域设计简并引物Ml、M2，Ml的序列如SEQ ID No: 3所示；M2的序列如SEQ ID No: 4所示；③利用简并引物Ml、M2扩增得到马氏珠母贝热休克蛋白90基因核心序列；④利用快速扩增cDNA末端RACE反应设计5’引物M3、 M4禾口 3，引物M5、M6，M3的序列如SEQ ID No: 5所示，M4的序列如SEQ ID No: 6所示，M5 的序列如SEQ ID No: 7所示，M6的序列如SEQ ID No: 8所示；扩增得到热休克蛋白90如SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1) 马氏珠母贝热休克蛋白90基因的分离，为进步深入分析HSP90影响下生物抗逆能力，为HSP90在马氏珠母贝中其它功能的筛选和应用打下基础。(2) 本发明通过对马氏珠母贝HSP90 cDNA表达调控规律的研究，进一步验证 HSP90在热激处理下的功能，为探索和提高马氏珠母贝机体防御能力，筛选和培育抗病养殖品种提供支持。(3) 利用HSP90基因的表达情况来监测养殖环境对马氏珠母贝选育的影响， 有针对性的对马氏珠母贝的人工选育提供指导。
具体实施例方式
实施例1 HSP90的CDNA的克隆和测序
1.同源序列的分析及简并引物设计
从NCBI上下载已经公布的水产类HSP90的EST序列，通过DNAMar中的kqMan分析所得序列的同源性，之后在高度同源的区域设计简并引物M1，M2。Ml (SEQ ID No: 3): RGCHGGffGCffGAYATYTCCAT M2 (SEQ ID No: 4) GCTTGACffGCCARRTGRTCT
2.HSP90核心EST序列的扩增 2. 1分离总RNA
本发明中所用的马氏珠母贝采用中国科学院南海海洋研究所大亚湾实验站。在采样前已经做了弧菌感染实验，分别取感染弧菌6小时(h)、12h、24h马氏珠母贝的淋巴细胞、闭壳肌、鳃和足等4个组织，利用一种新型的总RNA提取试剂(Trizol，购自^witrogen公司)， 按照使用说明提取所有处理和时间段的总RNA具体操作如下1. 5ml离心管中加入700微升(μ 1 )Trizol试剂，之后把剪碎的组织加入离心管中充分混勻，室温放置5分钟(min)，使其充分裂解；12000转/分钟(rpm)离心5min，去上清，弃沉淀；按200ul氯仿/毫升(ml) Trizol加入氯仿，振荡混勻15min，室温放置15min ；4°C 12000rpm离心15min ；吸取上层水相，至另一离心管中；按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勻，室温放置5-lOmin。 4°C 12000rpm离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底；按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。两次；室温晾干或真空干燥5-lOmin可用50 μ 1焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC H2O), TRIS-EDTA缓冲液(TE buffer)或0. 5%十二烷基硫酸钠(SDS) 溶解。2.2合成cDNA第一链按照淋巴细胞的RNA做反转录。利用紫外分光光度计和琼脂凝胶电泳检测RNA纯度和质量。按照hvitrogen的superscript III反转录酶试剂盒推荐的方法以Oligo (dT)为引物合成cDNA第一链，具体操作如下1μ g总RNA的mRNA于 1. 5ml离心管，加入PTA 20毫mM (摩尔/升)1 μ 1，三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(dNTP) 10mmol/l Ιμ ，补超纯水(DEPC处理)至16 μ 1，70°C变性IOmin后，立即冰浴5min ；之后加入 5X 第一链buffer 2. 2 μ 1,DDT0. IM 1 μ 1, RNA酶抑制剂(RNase hhibitor)l μ 1，反转录酶(Superscript III) 200U/ μ 1 1 μ 1，用手指轻弹离心管底部，混勻；45°C保温90min ； 70°C变性IOmin ；冰浴。2. 3 PCR 的扩增以此cDNA第一链为模板，利用特异引物Ml、M2进行扩增得到目的片段。产物长度为 660bp。25 μ 1 PCR 反应体系灭菌的 ddH20 16. 3 μ 1,2. 5mM dNTP mix 2 μ 1、10XPCR buffer 2.5 μ l、25mM 氯化镁(MgCl2) 2 μ 1、cDNA 1 μ 1、IOmM 引物 Ml、Μ2 各 0. 5 μ 1、0· 5U/ μ 1 Ex-Taq DNA Polymerase 0· 2 μ 1。PCR反应条件94预变性 2min ;94°C 30S，54°C 30S, 72°C Imin 34个循环，72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂凝胶电泳后，鉴定其特异性。2. 4 PCR产物的克隆
利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Takara)，按产品明书，从1. 5%琼脂糖凝胶上回收目的条带。回收产物连接于PMD18-T载体具体操作如下2Xligation buffer 5μ l,pMD18-T vector 1 μ 1, PCR product 3μ1，Τ4 DNA ligasel μ 1，于 4°C反应过夜，立即转化大肠杆菌，用载体引物M13F、M13R PCR检测转化克隆的插入片段，插入克隆委托商业公司英潍捷基 (上海)贸易有限公司完成。2.5 RACE 反应
Gene Racer 按照 Invitrogen 的 GeneRacer Kit with AMV RT and TOPO TA Cloning kit for Sequencing试剂盒说明操作。按照测序的结果设计RACE引物M3、M4、M5和M6，引物为
M3 (SEQ ID No: 5) :5，-RACEl CATATCCGATTTTGTCCAAGG M4 (SEQ ID No: 6) 5' -RACElnest :AGGCGTCAGATGAGTTGGA M5 (SEQ ID No: 7) :3，-RACEl :GTGAAGGAGGTGGTGAAGAA M6 (SEQ ID No: 8) :3，-RAClEnest :GGTGGTGAAGAAACACAGCC
其PCR扩增的程序，3，-RACE为94°C预变性2min，94 V变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸1. 5min，35个循环，最后72°C衍生7min。5，-RACE的程序为94°C预变性2min，94°C变性 30s，72°C延伸 1. 5min 循环 5 次，94°C变性 30s，70°C延伸 1. 5min 循环 8 次，94°C变性 30s， 68°C延伸30s，71°C延伸1. 5min, 30个循环最后72°C延伸7min。分别将目的片段和pMD18_T (invitrogen)连接(具体操作见见PCR产物克隆)，同样委托英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。结合3，RACE和5，RACE的结果获得HSP90的cDNA序列，长度为1018bp，其中开放阅读框位于34-1018位核苷酸，这一阅读框编码320个氨基酸残基，该氨基酸具有SEQ ID No: 2所述的序列。实施例2 HSP90的cDNA同源序列比较
用本发明得到的马氏珠母贝HSP90 cDNA序列及其编码的蛋白质序列，在GeneBank的数据库中进行BLAST程序进行核苷酸和蛋白同源性比对。结果表明马氏珠母贝HSP90 cDNA 与斑节对虾/^aaeiAS ο/ ο /ο/7 (EF015590)，刀额新对虾ensis (EF470247),
皱纹盘鲍Wioiis discus hannai (⑶014545)的同源性大于60%。在氨基酸水平上马氏珠母贝HSP90蛋白与上与三疣梭子蟹/iOrtozw1S trituberculatus (ACQ90225)栉孔扇贝 Chlamys farreri (AAR11781. 1)褶纹冠蛘 frisiaria plicata (ADN87332. 1)的 HSP90 蛋白同源性都高达97%。其中HSP90蛋白质结构特征包括
分子量为30462道尔顿(Da)，等电点为4. 78，结构包括α螺旋占到40. 06%、随机卷曲占46. 99%、延伸链占12. 95%。因此，HSP90是马氏珠母贝的热休克蛋白。实施例3马氏珠母贝HSP90在热胁迫前后的表达情况用37度海水处理整体马氏珠母贝6小时，同时提取处理和对照的淋巴组织RNA，提取方法参考实施例1中的2. 1，之后利用定量PCR仪(Rotor Gene RG3000，澳大利亚)做表达差异分析，定量PCR引物为M7，M8。
M7 (SEQ ID No: 9) CCAGAAGGACCCTAAGAA M8 (SEQ ID No: 10) CCCAATCATAGGGAAGTG
结果表明，热胁迫处理之后HSP90的表达量明显增加比对照高出3. 5倍，具体见下表
权利要求
1.马氏珠母贝热休克蛋白90基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID No: 1所示。
2.一种由权利要求1所述基因编码的马氏珠母贝热休克蛋白90，其特征在于其氨基序列如SEQ ID No: 2所示。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，涉及海洋经济种马氏珠母贝热休克蛋白90基因的核苷酸序列和其所编码的热休克蛋白90的氨基酸序列。本发明通过对NCBI上的HSP90的表达序列标签(EST)下载分析，利用DNAstar中的SeqMan软件分析所有HSP90的同源性区域设计简并引物；其次利用通用引物扩增在马氏珠母贝HSP90基因核心序列；再次利用快速扩增cDNA末端(RACE)试剂盒得到HSP90的cDNA。马氏珠母贝热休克蛋白90基因的分离，为进步深入分析HSP90影响下生物抗逆能力，为HSP90在马氏珠母贝中其它功能的筛选和应用打下理论基础，并且利用HSP90基因的表达情况来监测养殖环境对马氏珠母贝选育的影响，有针对性的对马氏珠母贝的人工选育提供指导。
文档编号C12N15/12GK102161992SQ20111004747
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者付定坤, 王艳红, 胡超群 申请人:中国科学院南海海洋研究所