一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的snp标记的检测引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。检测引物包括：ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；AS?SN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。
【专利说明】-种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物 及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种【技术领域】，具体涉及一种与马氏珠 母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。
【背景技术】：
[0002] 马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开 展了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海 地区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争 力减弱，养殖经济效益下滑。就其原因，除了养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要 原因是：多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种；种苗质量参差不齐，育珠母贝性 状退化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展， 培育适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。
[0003] 育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是 目前国内外研究的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育 种离不开分子标记的开发，用在海洋贝类遗传育种研究的分子标记主要有限制片段长度 多态性（RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性（AFLP)、锚定简单重复 序列（ISSR)、简单重复序列（SSR)、单核苷酸多态性（SNP)、表达序列标签（EST)、线粒体 DNA(mtDNA)、核糖体DNA内转录间隔区标记（ITS)分子标记等。Qiu等对合浦珠母贝不 同群体进行EST-SSR标记与生长及珍珠层性状的关联分析，结果表明在野生群体中基因 PmartE05、PmartE35与壳高、总重显著相关，基因 PmartE64与珍珠层厚度显著相关，在养殖 群体中发现基因 PmartE05与壳高显著的相关。Cong等利用SNP标记研究太平洋牡蛎的胰 岛素相关多肽基因（〇IRP)的多态性与生长性状的关联分析，发现在〇IRP基因1.5kb处发 现31个SNPs，其中6个与生长性状显著相关，特别是标记T1358G和标记G1437A与壳高、壳 长、壳宽、总重、软体部重5个生长性状显著相关。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检 测引物。
[0005] 本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包 括：
[0006] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0007] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0008] ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0009] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其特 征在于，其特异性检测引物为：
[0011] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0012] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0013] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0014] ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
[0015] 本发明的第三个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在鉴定马 氏珠母贝闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
[0016] a、提取马氏珠母贝样品基因组DNA ;
[0017] b、采用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 对马氏珠母贝样 品基因组DNA进行PCR扩增；
[0018] c、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207bp和180bp大 小2条带的为AG型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180bp大小1条带的为GG型，个 体为闭壳肌重大的个体。
[0019] 优选，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：12. 5yL PCR反应体系如下：包含马 氏珠母贝样品基因组 DNA40ng，lXPCR Mixture，引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、 ASSN815R0 各 0·5μΜ，0·125υ Taq DNA 酶，余量为水；反应条件为：94°C，5min;94°C35s， 62°C 40s ;72°C 40s，5 个循环；94°C 35s，6(TC 40s，72°C 40s，15 个循环；94°C 35s，58°C 40s， 72°C 40s，15 个循环：72°C延伸 lOmin。
[0020] 本发明的第四个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠 母贝分子标记辅助育种中的应用。
[0021] 利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出 肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可 直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早 期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。
【专利附图】
【附图说明】：
[0022] 图1是与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的扩增电泳图，其中泳道1-12为 马氏珠母贝样品，Μ为marker。
【具体实施方式】：
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1 :
[0025] 随机取来至于同一群体的50个马氏珠母贝个体，清洗干净后，取其闭壳肌组织用 电子天平称重并一一对应记录，然后取一小块闭壳肌组织置于95%乙醇中，于_20°C保存。 使用HiPure Universal DNA Kit (广州美基生物公司）对闭壳肌的基因组DNA进行提取， 相关操作参见试剂盒说明书进行。DNA提取后，于1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性， 紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度，于-20°C保存。
[0026] 与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物为：
[0027] ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ；
[0028] ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ；
[0029] ASSN815F0 ： TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ；
[0030] ASSN815R0 ：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC
[0031] 用上述引物 ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0 对马氏珠母贝样品基 因组DNA在PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应体系如下：扩增体系12. 5ul，包含马氏珠母 贝样品基因组 DNA0. 4μ L，6. 25μ L2XPCR Mixture, ΙΟμΜ 引物（ASSN815FI、ASSN815RI、 ASSN815F0、ASSN815R0)各0· 5 μ L, 0· 125U Taq DNA酶（广州东盛生物科技有限公司），双 蒸水补足至 12. 5μ L。反应条件为：94°C，5min ;94°C 35s，62°C 40s ;72°C 40s，5 个循环； 94°C 35s，60°C 40s，72°C 40s，15 个循环；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 个循环：72°C延伸 lOmin。PCR产物用3%琼脂糖（广州康龙科技生物公司）凝胶电泳，用凝胶成像系统观察 电泳图谱。分型电泳图如图1所示，出现具有207和180bp大小2条带的AG型（泳道6和 8)，只出现180bp大小1条带的为GG型（泳道2-4、7、9-12)。在这50个个体中，AG型个体 29个，肌肉重0. 68±0. 34g，GG型个体有21个，闭壳肌重1.07±0. 37g。采用SPSS17. 0软 件中的单因素方差分析（One-way AN0VA)对SNP位点与肌肉重进行关联分析，GG型个体的 闭壳肌重显著大于AG型个体（p〈0. 01)，即认为它们之间具有极其显著的统计学差异。
[0001] 说明书 序列犮 <110>中国科学院南海海洋研究所 <12?>-种与马氏珠母K闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用 <160 >4 -210-1 <211 >22 <212>DNA <213>人工序列 <400〉1 TCCATCGTGG ACAAACGTGT AA 22 <2102 <211>27 <212>DNA <213>人1:序列 CjTCjTC \A/\GT AAACTGTATC TCGTGCC 27 <210>3 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 [0002] <4003 TAGAATTGGC AAAGGAACAA GCAT 24 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <400>4 AATAATTCCT AACAGGTGCC CGTC 24
【权利要求】
1. 一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
2. -种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其特征在于，其特异性检测引物为： ASSN815FI ：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA ； ASSN815RI ：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC ； ASSN815F0 ：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT ； ASSN815R0 :AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
3. 与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在鉴定马氏珠母贝闭壳肌重大小中的应 用，其特征在于，包括以下步骤： a、 提取马氏珠母贝样品基因组DNA; b、 采用权利要求1所述的检测引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0对 马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增； c、 根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207bp和180bp大小2 条带的为AG型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180bp大小1条带的为GG型，个体为 闭壳肌重大的个体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为： 12.5yL PCR反应体系如下：包含马氏珠母贝样品基因组DNA40ng，lXPCR Mixture，检测 引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815F0、ASSN815R0各0·5μM，0·125UTaqDNA酶，余量 为水；反应条件为：941：，51^11 ;941：358,621：4〇8;721：4〇8,5个循环；941：358,6〇1：4〇8， 72°C 40s，15 个循环；94°C 35s，58°C 40s，72°C 40s，15 个循环：72°C延伸 lOmin。
5. 权利要求2所述的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记 辅助育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104099415SQ201410289345
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】何毛贤, 李琴 申请人:中国科学院南海海洋研究所