缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，具体设及一种快速检测-a 缺失型地中海贫血 等位基因的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常 见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有a-地贫和0-地贫。中国人群中，a-地贫 的基因型常见的为缺失型一SE\-ai7和-a4^2。2013年，钦州市妇幼保健院检测出了一种 命名为'钦州型a地贫缺失型'的罕见地贫基因型，由于该基因型的分子生物学机制为a 珠蛋白基因簇（NG_000006. 1)中一段21. 9化的DNA序列的缺失，因此简写为-a3L9^ong J,YanS,LaoK,PangW,YeX,SunL.Thediagnosisandmolecularanalysisofanovel 21. 9kbdeletion(Qinzhoutypedeletion)causing曰+thalassemia.BloodCellsMol Dis. 2014 ;52 (4) :225-9.)。在日常工作中，申请人发现该基因型在广西有一定的分布几率， 为降低该基因型的漏诊，需建立一种可W快速-aU'9等位基因的检测试剂盒。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测-Q2I^9缺失型地中海贫血等位基 因的试剂盒。采用该试剂盒可W实现单管单次反应完成-aU'9缺失型地中海贫血等位基因 的检测，具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，W及较高的特异性。
[0004] 本发明所述的快速检测-aU'9缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒，包括扩增引 物，所述的所述的扩增引物为：一对可W扩增a-珠蛋白基因簇中-a21^9等位基因的特征 序列的引物21.9-F和21.9-R，其中： 阳005] 21. 9-F:5> -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3> ;
[0006] 21.9-R: 5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'。
[0007] 本发明所述试剂盒适用于溶解曲线法、琼脂糖凝胶电泳法等，尤其适用于溶解曲 线法。
[0008] 本发明所述的快速检测-aU'9缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒还包括一些 现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、染料、MgClz和dNTP等。具体地，酶液为 Taq聚合酶体系，包括可用于溶解曲线法的热启动酶体系等；缓冲液为常规的PCR缓冲液； 当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为与 GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。所述的染料为现有技术中的常规选择，如可 W是SYBRGreenI染料。
[0009] 当本发明所述试剂盒应用于溶解曲线法（即基于溶解曲线法的快速检测-a21^9缺 失型地中海贫血等位基因的试剂盒）时，采用该试剂盒快速检测-a9缺失型地中海贫血 等位基因的方法包括W下步骤：
[0010] 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
[0011] 2)配制反应体系，具体为： 阳01引将引物21. 9-F和21. 9-R;W及PCR缓冲液、酶液、染料、MgClz、dNTP、水和DNA模 板配制成反应体系；
[0013] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，实验结束后采用实时巧光定 量PCR仪自带分析软件读取溶解曲线数据；
[0014] 4)数据分析及结果判定：根据实时巧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果，当样本的溶解曲线在82. 5~83. 5°C有峰时，则表示该样本携带-a21'9等位基因；若样 本的溶解曲线在82. 5~83. 5°C没有峰时，则表示该样本不携带-a21^9等位基因。
[0015] 上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。
[0016] 上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA:1~化g/ yL;各引物：0. 3 ~0. 5ymol/L;DNA模板：20 ~200ng;儀离子：1. 5 ~1. 9mmol/L;染料稀 释到1X;反应体系的终体积优选为20yL。
[0017] 上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95°C预变性8~12分钟，然后95°C15~ 30秒，60°C退火50~70秒，39~49个循环，所有循环结束后进行溶解曲线分析。
[0018] 与现有技术相比，本发明的特点在于：
[0019] 1、本发明所述试剂盒可W实现单管单次反应完成-a2I'9缺失型地中海贫血等位 基因的检测，具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，W及较高的特异性。
[0020] 2、当本发明所述试剂盒应用于溶解曲线法中W检测-a2I'9缺失型地中海贫血等 位基因（即基于基于溶解曲线法的快速检测-a21^9缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒） 时，无需开管操作，极大限度地降低实验室PCR产物污染的可能；另一方面，采用溶解曲线 分析法，该方法是目前使用实时巧光定量PCR仪中最廉价的实验体系构建方法，成本更低 也更易于推广。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中1#样本的溶解曲线； 阳022] 图2为本发明实施例1中2#样本的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，W更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于W下实施例。
[0024] 实施例1 :采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果 阳0巧]1、试剂盒的组成：
[0026] 可W扩增a-珠蛋白基因簇中-Q2I'9等位基因的特征序列的引物对21.9-F和 21. 9-R：
[0027] 21. 9-F:5,-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3,（SEQIDNO:1);
[0028] 21. 9-R:5'-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'（沈QIDNO:2);
[0029] 其它组成成分：
[0030] SYBRGreenI染料、GoldStarTaqDNAPolymerase、与GoldStarTaqDNA Polymerase配套的缓冲液和dNTPs均购自康为世纪，MgClz购自LifeTechnology。
[0031] 按下述表I配制PCR反应体系：
[0032] 表 1 :(ml表示mmol/LJiM表示Jimol/L)
[0033]
[0034] 2、实施方法：
[0035] PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95°C预变性 10分钟，然后95°C15秒，60°C退火60秒，40个循环，所有循环结束后进行溶解曲线分析。
[0036] 样本处理：采用L油-AidDNAminiextractionkid度i〇-V,Xiamen)试剂盒抽提 DM,W双蒸水稀释至20~20化g/yL备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提 取。
[0037] 样本检测：将1份用常规方法检测确定的已知基因型待检样本（简称1#样本）， W及1份正常基因型（aa/aa，N/N)样本（简称2#样本），根据上述反应体系和反应程 序，于实时巧光定量PCR仪上进行扩增检测，所有循环结束后进行溶解曲线分析。
[0038] 3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的DNA样本。
[0039] 4、数据分析及结果判定：若待检样本的溶解曲线在82. 5~83. 5°C有峰，则表示 该样本携带-O21^9等位基因；若该溶解曲线在82. 5~83. 5°C没有峰，则表示该样本不携 带-Cl21'9等位基因。经过检测，1#样本的溶解曲线如图1所示，在83°C有峰出现（具体请见 表2)，表示1#样本携带-a2L9等位基因；2#样本的溶解曲线如图2所示，在82. 5~83. 5°C 没有峰出现（具体请见表3)，表示2#样本不携带-a21^9等位基因。
[0040] 表2 :
[0041 ]
[0042] 表3 :
[0043]
W44] 可见，采用本发明所述试剂盒用于溶解曲线分析法进行-aU'9缺失型地中海贫血 等位基因检测，结果准确；而且野生型样本无法检测出扩增峰，具有较高的特异性。
[0045] 实施例2:本发明所述试剂盒在随机基因型样本中的检测效果。
[0046] 1、试剂盒的组成： W47] 同实施例1。
[0048] 2、实施方法： W49] 同实施例1。
[0050] 3、样本来源：
[0051] 样本为13例随机样本（由钦州市妇幼保健院提供），W双蒸水稀释至20~20化邑， 作为待检样本），W及经Gap-PCR验证的2例正常样本，1例阳性样本。
[0052] 4、数据分析及结果判定：
[0053] 若待检样本的溶解曲线在82. 5~83. 5°C有峰，则表示该样本携带-aU'9等位基 因；若该溶解曲线在82. 5~83. 5°C没有峰，则表示该样本不携带-a21^9等位基因，结果如 下述表4所示。
[0054]表 4 : 阳化引
[0056] 注：样本类型中化gCtrl=阴性对照，PosCtrl=阳性对照，化kn=未知样本类 型，检测结果中，None=未检出。
[0057] 结果显示，除了阳性样本外，随机样本并未检测出-a21^9等位基因。
【主权项】
1. 快速检测-a 21'9缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒，包括扩增引物，其特征在 于： 所述的所述的扩增引物为：一对可以扩增a -珠蛋白基因簇中-a 21'9等位基因的特征 序列的引物21.9-F和21.9-R，其中： 21. 9-F :5' -GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3' ； 21. 9-R :5' -TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3'。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括缓冲液、酶液、染 料、MgCljP dNTP。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测-α21.9缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒。该试剂盒包括扩增引物，扩增引物具体为一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物21.9-F和21.9-R，其中：21.9-F：5’-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3’；21.9-R：5’-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3’。采用本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应完成-α21.9缺失型地中海贫血等位基因的检测，具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。本发明试剂盒应用于溶解曲线法时，无需开管操作，降低PCR产物被污染的可能；成本更低也更易于推广。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105154579
【申请号】CN201510702373
【发明人】龙驹, 吴素萍, 孙雷
【申请人】钦州市妇幼保健院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月26日