转基因水稻pa110-15品系特异性5’端定量pcr检测引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种转基因材料的定量检测引物，特别设及一种转基因水稻PA110-15 品系特异性5'端定量PCR检测引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前，关于转基因食品的安全性受到人们越来越广泛的关注，转基因食品的安全 性成了人们较为关注的话题，在市场上出售的粮油，蔬菜，瓜果等农产品也都打出非转基因 的招牌来吸引客户，但是，所购买的食品是否为非转基因食品，是否渗杂了转基因食品，渗 杂的量是多少，普通的消费者无法鉴别。
[0003] 转基因食品中，粮食作物的转基因尤其受到人们的关注。鉴别转基因作物的一个 有效的方法是PCR检测插入基因序列，但是，很多转基因的作物材料转入的基因在其非转 基因亲本中也含有该基因或者该基因的类似基因，会对PCR的结果造成干扰。在应用PCR 技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、 构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的 连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因 组的连接区序列，和前=种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转 基因产品检测。
[0004] 专利CN201410081539公开了转基因水稻PA110-15品系特异性PCR检测引物及定 性检测方法和试剂盒。专利CN201410081893公开了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁 侧序列及应用。运两个专利都是从转基因水稻PA110-15插入的旁侧序列入手，设计检测的 引物，达到了检测特异性的目的，但是，在实际应用中，消费者不仅要了解其购买的大米中 是否含有该转基因品系，而且，还要了解是否全部为该转基因大米的品系，或者部分是，渗 杂的量（含量）为多少。目前，运两个专利所设置的引物只能做定性检测，无法实现定量检 测。
【发明内容】
[0005] 本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，通过筛选得到转基因水稻PA110-15品 系特异性5'端定量PCR检测引物。
[0006] 定量检测一般采用巧光定量PCR的方法，引物的设计是成败的关键，对于本发明， 计算PCR的特异性引物的巧光量与内参基因巧光量的比值即为转基因品系的渗入量，为了 使该比值检测接近于真实情况，需要对内参引物和特异性引物进行选择优化，具体，我们是 采用如下方法筛选到合适的内参引物和特异性引物的：1)根据引物设计的基本原则，设计 =组引物；2)采用实验的方法对引物进行评价，筛选出最适合的引物。评价内容：是否有巧 光信号的产生；实时巧光PCR反应体系扩增时，特异性引物和内标准基因引物能构建标准 曲线，且标准曲线的R2^ 0. 98,扩增效率在90%~110%之间；能准确的检测水稻产品中转 基因含量。
[0007] -种转基因水稻PAllO-15品系特异性5'端定量PCR检测引物，所述特异性引物 为：PAllO-5-qF，其核巧酸序列如序列表SEQIDNo. 1所示；PAllO-5-qR，其核巧酸序列如 序列表SEQIDNo. 2所示；所述特异性引物的探针序列如序列表SEQIDNo. 3所示。
[000引一种转基因水稻PAl10-15品系特异性的定量检测方法，按照如下步骤进行：
[0009] (1)提取待检测水稻样品的DNA;
[0010] 似W提取的水稻样品的DNA为模板，设定水稻内源基因实时巧光PCR反应体系和 PAl10-15水稻品系特异性实时巧光PCR反应体系，将上述体系放入96孔PCR板；
[0011] 做将96孔PCR板放在水平低速离屯、机中，200化pm离屯、30s，然后放入PCR仪中；
[0012] (4)运行实时巧光PCR反应，若特异性实时巧光PCR反应体系没有扩增信号出现， 则证明样品中不含有转基因PAl10-15水稻品系；
[0013] (5)若特异性实时巧光PCR反应体系扩增出目的巧光信号，则证明样品中含有转 基因PA110-15水稻品系，根据标准梯度样品读取的特异性实时巧光PCR反应的Ct值和水 稻内源基因实时巧光PCR反应的Ct值。WCt值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴， 绘制标准曲线（Ct=kXLg(Copies)+b)，分别得到一条内源标准曲线方程和一条外源标准 曲线方程。再将待测样品中Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数。然 后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因PA110-15水稻品系的含量％=外源基因拷 贝数/内标准基因拷贝数。
[0014] 所述PA110-15水稻品系特异性实时巧光PCR反应体系为：无菌水8yL 2X!"SqMan反应缓冲液 12. 5JiL，10Jimol/LPAllO-5-qFlJiL，10Jimol/LPAllO-5-qRlJiL， 10ymol/LPA110-5-P0. 5yL，DNA模板 2. 0yL。
[001引 所述实时巧光PCR反应的条件为：95°C，5min;95°(：，153,60°(：，603,45个循环。
[0016]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用实验的方法，筛选到转基 因水稻PA110-15品系特异性5'端定量PCR检测引物，并配合使用常见的内参引物PLD，该 引物不仅能够定性检测样品水稻中是否含有转基因水稻PA110-15品系，还能定量检测其 含量，能够全面检测市场上出售大米的转基因产品含量，对政府的监管、检测及消费者的选 购具有指导意义。
【附图说明】
[0017] 图1是PLD内标基因实时巧光PCR扩增曲线。
[001引 图2是PLD内标基因实时巧光PCR扩增标准曲线图。
[0019] 图3是PA110-15转化体5'端实时巧光PCR扩增曲线。
[0020] 图4是PA110-15转化体5'端实时巧光PCR扩增标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0022] 下述实验采用如下所述的实验材料
[002引 1、植物材料
[0024] 转基因水稻PA110-15基体标准物质（100% )，转基因水稻PA110-15受体，非转基 因水稻。
[00幼 2、酶与试剂
[0026] Applied Biosystems的TaqMan'篡Gene Expression Master Mix,天根生化科技 有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物及探针由上海生工合成。
[0027] 3、实验仪器
[0028]分光光度计：ThermoND-1000 ;
[0029]离屯、机：Thermo Bioguge Primo R，中佳科仪SC-3610 ;
[0030]实时巧光定量PCR仪：BioRad CFX96 ;
[0031] 其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。
[0032]连施俩I1植物基因组DNA的提取与检测
[0033] 采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305 (天根生化科技有限公司）进行PA110-15 水稻基因组DNA和普通水稻基因组DNA提取和纯化，提取方法如下：
[0034] 1)取200mg水稻粉末样品；
[003引。加入800yL65°C预热的GPl缓冲液，迅速颠倒混匀，将离屯、管放在65°C水浴 比，水浴过程中颠倒离屯、管W混合样品数次。
[0036]3)加入等体积酪：氯仿（1:1)，充分混匀，12000;rpm离屯、lOmin。
[0037] 4)转移上清至一新离屯、管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000巧m离屯、lOmin。
[0038] 5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
[0039] 6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000巧m离屯、30s，弃掉废液（吸附柱容积 700y以可分次加入离屯、）。
[0040] 7)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液GD, 12000巧m离屯、30s，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。
[0041] 8)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000巧m离屯、30s，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。
[004引 9)重复步骤8。
[0043] 10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000巧m离屯、2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至 于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残余的漂洗液。
[0044] 11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位加入60yL 0.