一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤活性检测技术领域，具体设及一种基于链替代辅助=重放大技术 实现简单、快速、低成本检测癌细胞中端粒酶活性的方法。
【背景技术】
[0002] 端粒是真核细胞染色体末端含有的"帽状"结构，它能防止染色体发生降解、 端-端融合、重组和染色体丢失，从而保护染色体末端的稳定。在正常情况下，由于染色体 存在的末端复制问题，细胞每分裂1次，端粒就丢失50~150个碱基对。随着细胞分裂次数 的增加，端粒DNA末端缩短，当缩短到一定程度时，细胞进入危险期，最终导致细胞死亡。端 粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，主要由RNA模板化TR)催化亚基化TERT)和端粒酶相关 蛋白化TE巧组成。人类端粒酶能够W自身的RNA为模板，在染色体3'末端合成TTAGGG端粒 重复序列，W保持染色体末端端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研究发现，在85%W上的 癌症细胞中，端粒酶活性高度表达，而在正常体细胞中几乎没有表达。（化ayJ.W.，Wri曲t W.E.Telomerasetherapeuticsforcancer:challengesandnewdirections[J].Nat. Rev.DrugDiscov. 2006, 5:577 - 584.) 〇
[0003] 因此端粒酶已经被作为一种广谱性癌症标识物，在癌症的早期诊断，疾病预 知W及癌症病理学研究方面有很重要的作用。（Piatyszek，M. ;Kim，N. ;Weinrich，S.; Hiyama,K. ；Hiyama,E.Wright,W. ；Shay,J.Detectionoftelomeraseactivityinhuman cellsandtumorsbyatelomericrepeatamplificationprotocol(TRAP)[J].Methods CellSci. 1995, 17:1-15.)。发展简便、快速、可靠，灵敏的端粒酶活性检测的方法在基于端 粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。
[0004] 在已报道的端粒酶活性检测的方法中经典的方法是基于聚合酶链式反应（PCR) 的端粒重复序列扩增法（TRAP)。但是该方法需要先将端粒酶延长产物通过在引物和反向 引物混合核巧酸W及热启动聚合酶存在时利用聚合酶链式反应通过一系列循环进行扩增， 使目标物的浓度增大，然后再利用聚丙稀酷胺凝胶电泳和染色方法分析结果，操作过程繁 琐复杂，条件摸索困难，费时费力，同时需要用到多种试剂，运些都很容易使实验结果中出 现假性信号，导致实验结果不是很可靠。为了克服运些缺点，许多研究工作者试图发展无需 PCR辅助，同时能够灵敏检测端粒酶活性的检测技术。已报道的无需PCR辅助的端粒酶活性 检测的方法中，有基于纳米粒子和酶辅助的信号放大技术，但是纳米粒子合成复杂成本高， 而酶需要复杂的操控技术，运都限制了运些技术的广泛应用。而其他一些技术例如表面等 离子体共振（SPR)、等需要昂贵复杂的仪器，也限制了它们的广泛应用。为了克服运些缺点， 不少研究者试图发展不同的检测途径，其中巧光光谱分析方法由于自身的高灵敏性检测， 低成本，操作简单，简单的信号输出也被广泛应用于分析检测中。但是目前已经建立的方法 中利用蛋白酶进行信号放大不仅操作复杂，而且使实验成本增加，同时对探针的预标记不 仅操作复杂而且昂贵，运些都增加了工作的成本和复杂性。
[0005] 此外，N-甲基化嘟二丙酸IX(NMM)是一种巧光染料，对G-四链体有高度选择性， 其本身的巧光信号很弱，嵌插G-四链体后能产生明显的巧光信号，而且与单链，双链或者S链的作用很弱。
[0006] 基于此，本发明结合了链替代辅助S重放大技术与N-甲基化嘟二丙酸IX (NMM)的 巧光特性，提供了一种非标记的简单灵敏的检测端粒酶活性的方法。
【发明内容】
[0007]为了克服现有技术中成本较高、操作复杂、步骤繁琐等缺陷，本发明提供了一种非 标记的，无需酶辅助信号放大，也无需通过聚合酶链式反应就能够实现放大，灵敏度高的基 于=重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法。
[0008] 本发明实现上述目的所采用的技术方案是由W下步骤组成：
[0009] (1)将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，并与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序 列扩增缓冲溶液中，30~37°C解育0. 5~2小时，得到待检液体系；
[0010] 似将发夹DNA探针化、发夹DNA探针肥W及单链A-DNA和单链T-DNA分别用浓 度为50mmol/L、抑=7. 4且含5mmol/LMgClz的S径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲溶液稀释成 浓度为20ymol/L的Hl溶液、肥溶液、A-DNA溶液W及T-DNA溶液； 阳0川做将步骤似配制的A-DNA溶液与T-DNA溶液等体积混合，得到AT-DNA溶液； 阳〇1引（4)向浓度为50mmol/L、抑=7.4 且含5mmol/LMgClz和5mmol/L KCl的S径甲 基氨基甲烧-盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中 加入步骤（2) Hl溶液、肥溶液和步骤（3)制得的AT-DNA溶液，使最终混合体系中Hl、肥、 AT-DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30~37°C解育30~60分钟，向体 系中再加入浓度为100 y mol/L的N-甲基化嘟二丙酸IX溶液，至N-甲基化嘟二丙酸IX在体 系中的浓度为1 ymol/l，按照常规方法测定基底巧光信号值I。； 阳01引妨向与步骤（4)等量的浓度为50mmol/L、抑=7. 4且含5mmol/LMgClz和5mmol/LKCl的立径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲溶液中加入步骤（1)所配制的待检液，混匀，向该混 合体系中加入步骤（2)的化溶液、肥溶液W及步骤（3)制得的AT-DNA溶液，使最终的混 合体系中m、肥、AT-DNA的浓度分别为 150nmol/l、200nmol/l、50nmol/l，37°C解育 30 ~60 分钟，向体系中再加入浓度为100ymol/L的N-甲基化嘟二丙酸IX溶液，至体系中N-甲基 化嘟二丙酸IX的浓度达到1ymol/l，按照常规方法测定其巧光信号值Ii;
[0014] (6)将步骤妨的巧光信号值Ii与步骤（4)的基底巧光信号值I逊行比较，若I。 < Ii,则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细 胞中端粒酶的检测。
[001引上述步骤似配制的化溶液和肥溶液W及步骤（3)的AT-DNA溶液分别加热到 80~95°C保持5~lOmin，自然冷却至室溫，于4°CW下保存，备用。
[0016] 上述步骤（4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量与步骤（1)的端粒酶重复 序列扩增缓冲溶液或憐酸盐缓冲溶液的添加量相等。
[0017] 上述步骤（4)中端粒酶重复序列扩增缓冲溶液与=径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲溶 液的体积比为1:3. 8~4. 2。
[0018] 上述待检液的添加量与步骤（4)的端粒酶重复序列扩增缓冲溶液的添加量相等。
[0019] 本发明的基于=重放大技术非标检测端粒酶活性的方法，是基于链替代反应 (SDR)建立了一种新型的无酶辅助、非标记的灵敏检测端粒酶活性的方法，其是利用发夹DNA探针Hl和肥均在茎部隐藏有能够形成G-四链体的碱基序列，由引发DNA灯-DNA)和 辅助DNA(A-DNA)形成的部分杂交双链DNA(AT-DNA)，当细胞裂解提取的端粒酶与混合核 巧酸、端粒酶底物灯巧同时存在时，端粒酶能够延长端粒酶底物，形成一条较长的单链，该 单链与许多A-DNA结合形成更稳定的结构，释放出大量的T-DNA完成第一步放大，释放的 T-DNA与发夹探针Hl作用，打开Hl形成T-DNA出1复合物，K+存在时，在Hl的末端形成G-四 链体，使N-甲基化嘟二丙酸IX(NMM)嵌插G-四链体产生明显的巧光信号，同时通过链替代 反应，Hl能够与肥形成更稳定的复合物Hl:肥，释放出T-DNA，在r存在时，肥的末端能够 形成另一个G-四链体，使NMM的信号进一步增强实现第二步放大，同时被释放的T-DNA能 够继续打开另一个Hl完成新一轮的链替代反应，实现第=步放大，使该方法能够灵敏、快 速地在均相溶液中检测出待检细胞中端粒酶的活性，从而能够准确判定出待检细胞是癌细 胞还是正常细胞，可用于医学诊断癌细胞，为肿瘤疾病的诊断、治疗W及关于疾病机理研究 提供了新思路，在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义，此外，本发明的方法充 分利用链替代反应，无需酶辅助就能够实现信号放大，也不要复杂的巧光标记过程，响应速 度快，操作简单，成本低，适于推广应用。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明的实验原理图。
[0021] 图2为人急性淋己细胞白血病T淋己（CCRF-CEM)细胞端粒酶延长产物与化、肥、 AT-DNA、NMM作用的巧光光谱图。 阳02引图3为N-甲基化嘟二丙酸IX (NMM)与活性海拉细胞化eLa)端粒酶延长产物与Hl、肥、AT-DNA体系作用的巧光光谱图。 阳02引图4为N-甲基化嘟二丙酸IX (NMM)与失活海拉细胞化eLa)端粒酶的延长产物与Hl、肥、A