专利名称：缺失型α珠蛋白基因的多重PCR检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种用于医学检测人α-珠蛋白基因的多重PCR检测方法。
背景技术：
α-珠蛋白基因位于第16号染色体短臂末端α-珠蛋白基因簇中。该基因簇包括二个重复的α基因(α2和α1)、一个胚胎期α类基因(ξ2)、三个假基因(ψξ1、ψα2、ψα1)和一个功能未明的基因(θ1)，其序列顺序为5’-ξ2-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1-3’，全长50kb(Buckle VJ，1988；Lauer J，1980；Michelson AM，1983；Hatton CS，1990)。其中ξ基因编码ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达。在胎儿后期至出生后，ξ逐渐被α2，α1所代替。
α2和α1基因处于两个高度同源的重复单元中，这些单元包括了三个同源的片段(X、Y和Z盒)，其间被三个非同源区(I、II和III)所分隔(图2A)(Higgs DR，1989)。当减数分裂时，同源染色体间的错配和不等交换，导致两α间丢失3.7kb而产生α2-α1融合基因，记作-α3.7(Higgs DR，1989)。由于互换在右侧α1基因上进行，α3.7又称右侧缺失(Higgs DR，1984)。当互换发生两个X片段之间，结果产生缺失左侧α2基因4.2kb的染色体，称为左侧缺失，记作-α4.2(Embury SH，1980)。
另外，在东南亚人群中发现有两个α珠蛋白基因完全缺失的情况，其缺失基因序列达20kb，记作--SEA(Nicholls RD，1985)。由于主要发生在东南亚人群中，又叫东南亚缺失。--SEA是我国南方最常见的缺失类型，其缺失范围从α-珠蛋白基因簇的基因5’端到高变区(3’HVR)5’端上游1kb间，含ψα2、ψα1、α2、α1和θ1基因在内的约20kb的大DNA片段。东南亚型(--SEA)，右侧缺失(-α3.7)和左侧缺失(-α4.2)在我国最常见。
早在1987年，Chehab等(Chehab FF，1987)即将PCR技术运用于对Bart’s水肿胎儿的产前诊断。由于此法是凭阴性扩增结果诊断--SEA突变，故产生假阳性结果的风险甚大。而Chang等(Chang JG，1991)提出的Gap-PCR技术则可克服这种缺陷。
运用PCR技术对--SEA进行基因检测已很成熟，对于-α3.7和-α4.2两种缺失型的检测已日渐成熟。现能够用三个PCR反应及琼脂糖凝胶电泳方法快速准确地检测α-珠蛋白基因的三种缺失型。如能用一管多重PCR完成三项检测，对于使用者无疑方便了许多。但由于α-珠蛋白基因G-C含量高达70％以上，其扩增片段长，加之基因簇内同源序列多，增加了实验难度。Shaji RV等人应用多重PCR技术同时检测-α3.7、-α4.2和--SEA三种缺失，但其扩增的片段太大，且PCR运行时间长，效率也不高(Shaji RV，2000)。Samuel等也发表了他们运用多重PCR技术同时筛查-α3.7、-α4.2、--SEA、--MED、-(α)20.5、以及--FIL六种缺失的研究论文(Samuel，2000)，这一多重PCR体系中包含多种引物，最多能扩增出7条特异扩增带。
发明内容
针对中国人中最常见的三种缺失型α-地中海贫血的检测问题，本发明提供了一种快速、稳定、重复性好的单管多重PCR检测方法。
本发明的技术方案包括对人基因组DNA待测样品的PCR扩增和对PCR扩增产物进行电泳分析。其特征在于采用7个(4对)引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7组成四重PCR(表1)，分别检测正常等位基因和缺失等位基因。该PCR体系的引物设计方案包括该PCR体系的引物设计方案为引物P1、P2可从-α3.7缺失的基因中扩增2.0Kb的产物，引物P3、P4则可从-α4.2缺失的基因中扩增1.6Kb的产物，引物P5、P6则可从东南亚缺失的基因中扩增1.3Kb的产物。此外在三种缺失型的共同缺失区域内使用了引物P7，使引物P1、P7可从正常等位基因(αα或αTα)扩增1.8Kb的产物，而不能从三种缺失型的任何一种扩增出产物。因此，引物A、B可同时作为所有这三种缺失型的内对照。
表1检测α-珠蛋白基因三种缺失型PCR引物序列
本发明的检测方法其具体检测过程依次包括下列步骤(1)PCR扩增在灭菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反应体系中，分别加入等浓度的7个PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’
P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’的混合贮存液7μl。
等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合贮存液6μl。
反应缓冲液为10μl，其组分为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蜡30μl。
加入人基因组DNA1μl，PCR反应用酶1μl，短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35个循环；72℃5min。
(2)电泳鉴定PCR产物取PCR产物10μl，加2μl电泳加样缓冲液，混匀。加入1.0％的琼脂糖凝胶加样孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel电泳约40min。在UVP或紫外灯下观察结果。结果判定见表2。
表2缺失型α-地中海贫血基因检测结果判断
根据本发明所建立的缺失型α-地中海贫血检测方法，不仅可同时检测中国人常见的缺失型α-地中海贫血，而且有很好的重复性和稳定性。
图1检测α-珠蛋白基因三种缺失型PCR引物设计示意图有字黑框代表a-珠蛋白基因簇中的5个连锁的功能基因或假基因，即ψa2、ψa1、a2、a1、θ1。黑色条带为每种缺失型相应于a-珠蛋白基因簇的缺失区域。
具体实施例方式
实施实例一检测缺失型α-地中海贫血过程依次包括下列步骤(1)PCR扩增在灭菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反应体系中，分别加入等浓度的7个PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合贮存液7μl。
等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合贮存液6μl。
反应缓冲液为10μl，其组分为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蜡30μl。
加入人基因组DNA1μl，PCR反应用酶1μl，短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35个循环；72℃5min。
(2)电泳鉴定PCR产物取PCR产物10μl，加2μl电泳加样缓冲液，混匀。加入1.0％的琼脂糖凝胶加样孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel电泳约40min。在UVP或紫外灯下观察结果。结果判定见表2。
实施实例二同时对多人DNA样品进行缺失型α-地中海贫血筛查的检测过程依次包括下列步骤(1)PCR扩增在灭菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反应体系中，分别加入等浓度的7个PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合贮存液7μl。
等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合贮存液6μl。
反应缓冲液为10μl，其组分为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蜡30μl。
加入多人(2-6人)基因组DNA混合物1μl(每人DNA量不得低于0.1μg)，PCR反应用酶1μl，短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35个循环；72℃5min。
(2)电泳鉴定PCR产物取PCR产物10μl，加2μl电泳加样缓冲液，混匀。加入1.0％的琼脂糖凝胶加样孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel电泳约40min。在UVP或紫外灯下观察结果。如只出现一条1.8kb条带，则所检测的样品均为正常人。如除出现一条1.8kb条带外，还出现1.3kb或/和1.6kb或/和2.0kb，则所测样品中有缺失型α-地中海贫血患者。应按实施实例一的方法进行确诊。
权利要求
1.缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR检测方法，包括对人基因DNA待测样品的PCR扩增和对经PCR扩增产物进行电泳分析，其特征在于采用7个(4对)引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7组成四重PCR，该PCR体系的引物设计方案为引物P1、P2可从-α3.7缺失的基因中扩增2.0Kb的产物，引物P3、P4则可从-α4.2缺失的基因中扩增1.6Kb的产物，引物P5、P6则可从东南亚缺失的基因中扩增1.3Kb的产物。此外在三种缺失型的共同缺失区域内使用了引物P7，使引物P1、P7可从正常等位基因(αα或α′α)扩增1.8Kb的产物，而不能从三种缺失型的任何一种扩增出产物。
2.根据权利要求1所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR检测方法，其特征在于其所采用的7条优选引物序列为P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’
3.根据权利要求1或2所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR检测方法，其特征在于其检测过程依次包括下列步骤(1)PCR扩增在灭菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，分别加入等体积等浓度的7个PCR引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7贮存液，引物浓度范围为0.1-1.4μg/μl。等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP，dGTP。每种dNTP的浓度范围为50-400μmol/L。反应缓冲液为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。加入人基因组DNA，PCR反应用酶，混匀。短暂离心后进行PCR循环。(2)电泳鉴定PCR产物通过电泳后凝胶上出现的荧光条带的数目和不同的组合来分析判断结果如出现引物P1、P2的扩增产物2.0Kb条带，则有-α3.7基因片段；如出现引物P3、P4的扩增产物1.6Kb条带，则有-α4.2基因片段；如出现引物P5、P6的扩增产物1.3Kb条带，则有--SEA基因片段。如出现引物P1、P7的扩增产物1.8Kb条带，则为正常等位基因。
4.根据权利要求3所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR检测方法，其特征在于其检测过程依次包括下列步骤(1)PCR扩增在灭菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，在25μl的反应体系中，分别加入等浓度的7个PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’的混合贮存液7μl。等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合贮存液6μl。反应缓冲液为10μl，其组分为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2。石蜡30μl。加入人基因组DNA 1μl，PCR反应用酶1μl，短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35个循环；72℃5min。(2)电泳鉴定PCR产物取PCR产物10μl，加2μl电泳加样缓冲液，混匀。加入1.0％的琼脂糖凝胶加样孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel电泳约40min。在UVP或紫外灯下观察结果。
全文摘要
本发明提供一种缺失型人α－珠蛋白基因的PCR检测方法，本发明采用7个(4对)引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7组成四重PCR反应，针对正常等位基因和中国人常见的缺失等位基因(－
文档编号C12Q1/68GK1626671SQ20031011255
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者李泽松, 耿永尧, 张文 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司