专利名称：一种消减杂交文库构建方法
技术领域：
本发明涉及一种消减杂交文库构建方法。
背景技术：
消减杂交技术原理就是让一对具有可比性的基因组序列进行杂交，具有相同的序列就可以进行杂交而形成双链，而有差别的片段由于没有互补链而呈单链状态。设法去除双链，保留和分析单链，这个单链序列极有可能是机体差异表达的基因序列或是病原基因组序列。近年来已由物理消减技术发展到RDA和SSH。
传统的物理消减杂交，存在方法繁复、操作困难，对低拷贝差异基因无法检测等缺点。RDA存在步骤繁多、作为“检测”及“驱赶”的样本要求具有高度的同源性、效率低、仍有假阳性等。SSH是一种最新的差异表达研究方法。原理是在抑制PCR基础上的消减杂交。所谓抑制PCR，就是在引物设计上使同一个引物可以形成颈环二级结构，不能进行有效扩增。而且采用了杂交使各种不同丰度mRNA均衡化的技术，克服了低丰度mRNA不易检测的问题。但仅能比较成对RNA群体间差异表达的基因，起始材料要求较多、对小片段缺失的样本无法检出，由于稀有mRNA不适合杂交动力学而使这部分基因漏掉，使那些不按“全或无”模式表达的基因之间的明显差异变化变得模糊。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、可重复性好、效率高、假阳性率低的消减杂交文库构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用了一种新的消减杂交装置－尼龙膜柱。对检测组和驱赶组进行酶切，使杂交片断长度在200bp-700bp之间，获得最好的杂交动力学条件。并对检测组加通用接头，消减后用分组引物对消减产物进行分组扩增，减少了特异性扩增，使低拷贝cDNA片断也能扩增。
本发明所述的消减杂交文库构建方法，该方法包括以下步骤(1)消减杂交装置的制备将消减杂交装置制成一尼龙膜柱；(2)检测组和驱动组的酶切用限制性内切酶分别酶切检测组和驱动组DNA或cDNA；(3)驱动组的固定将酶切后的驱动组DNA或cDNA加于尼龙膜柱上，紫外交联，固定；(4)检测组连接接头将酶切后的检测组DNA或cDNA连接接头；(5)进行消减杂交将连接接头后的检测组加到固定有驱动组的尼龙膜柱上，进行数轮杂交，得消减产物；(6)消减产物的分组扩增用分组引物将消减产物分组进行扩增，得扩增产物；(7)消减杂交文库的构建扩增产物与T载体连接，构建消减文库。
上述步骤(1)中所述的尼龙膜柱由上柱、下柱、尼龙膜和密封垫圈组成，其中上柱和下柱均为空心柱，上柱的上半部直径大于下半部直径，下柱的上半部直径大于下半部直径，上柱的下半部与下柱的上半部呈紧密配合，尼龙膜置于下柱的上半部与下半部的连接处并在其上放置密封垫圈后由上柱的下半部压紧。
与传统的物理消减杂交方法相比，本发明具有以下优点1)消减杂交装置成本低，制作简单；2)尼龙膜与核酸分子以共价键结合，结合牢固；3)在杂交过程中可控制杂交温度和时间；4)可根据需要控制杂交轮次；5)洗脱体积可按需要控制在数十微升，便于进一步的操作；6)试验操作简单，可重复性好；7)在消减杂交后进行PCR，避免了假阳性的出现；8)消减后进行分组PCR，可使低丰度的差异表达cDNA扩增。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明实施例的操作流程图；图2为本发明所述尼龙膜柱的分解示意图；图3为本发明所述尼龙膜柱的组合示意图；图4为本发明实施例中消减前的分组扩增结果图；图5为本发明实施例中消减后的分组扩增结果图；图6为本发明实施例中消减文库克隆鉴定图。
具体实施例方式
本发明以构建K562细胞的消减文库为例。将正常血细胞的cDNA固定在尼龙膜柱上，加入K562细胞的cDNA进行杂交，反复数次后，即可获得在K562细胞中表达而在正常血细胞中不表达的差异基因。具体步骤如下1、制作尼龙膜柱。尼龙膜柱由上柱1、下柱4、尼龙膜3和密封垫圈2组成，其中上柱1和下柱4均为空心柱，上柱1的上半部1a直径大于下半部1b直径，下柱4的上半部4a直径大于下半部4b直径，上柱1的下半部1b与下柱4的上半部4a呈紧密配合，尼龙膜3置于下柱4的上半部4a与下半部4b的连接处并在其上放置密封垫圈2后由上柱1的下半部1b压紧。
2、分别用限制性内切酶Sau3AI酶切正常血细胞和K562细胞的cDNA。酶切反应可参考以下方法取cDNA约3μg于0.5ml微量离心管中，加入5μl 10×缓冲液，3u Sau3AI，加双蒸水至50μl，37℃反应2h。
3、将正常血细胞cDNA酶切产物在95℃加热，5min后，立即置于冰上，变性。
4、测定浓度为86.5ng/μl，总量为86.5ng/μl×50μl＝4.325μg。
5、将变性后的正常血细胞cDNA酶切产物加于尼龙膜柱上，干燥后，在紫外交联仪中进行交联(90mJ，1min)。
6、加入20μl双蒸水洗脱。
7、测定洗脱液浓度为14.5ng/μl，总量为14.5ng/μl×20μl＝0.29μg。
8、柱上结合量为4.325-0.29＝4.035μg，约4μg。
9、取2μg K562细胞cDNA酶切产物连接接头。接头序列为5’GATCAACGACTCAGTATAGGCATTGCTGAGTCATATCC’5连接反应可参考以下方法取2μg K562细胞cDNA酶切产物于0.5ml微量离心管中，加入2μl 10×缓冲液，接头2μl，T4 DNA连接酶1μl，加水至20μl，16℃反应2h以上。
10、纯化连接产物，进行10个循环的扩增。
引物序列为5’CTATACTGAGTCGTTGATC。
反应体系为在0.2ml微量离心管中，加入1μl连接产物，2μl 10×缓冲液，dNTP(各2.5mmol/L)4μl，引物(25μmol/L)1μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，加双蒸水至20μl，混匀。反应条件为
94℃，5min 72℃，7min11、将PCR产物在95℃加热，5min后，立即置于冰上，变性。
12、测定浓度后，取柱上结合量的1/100，即40ng，与等体积的10×SSC混合后加于尼龙膜柱上。
13、将尼龙膜柱放入加有5×SSC的1.5ml微量离心管中。
14、放入60℃水浴，反应12h。
15、加入20μl 5×SSC洗脱。
16、转入另一个尼龙膜柱。重复2次。
17、取1μl洗脱液进行扩增。所用引物为在上述引物3’末端延伸一个碱基，形成4条引物，两两组合可分为十组，其余条件同上。
18、扩增产物与T载体连接，构建K562细胞与正常血细胞的cDNA消减文库。
权利要求
1.一种消减杂交文库构建方法，包括以下步骤(1)消减杂交装置的制备将消减杂交装置制成一尼龙膜柱；(2)检测组和驱动组的酶切用限制性内切酶分别酶切检测组和驱动组DNA或cDNA；(3)驱动组的固定将酶切后的驱动组DNA或cDNA加于尼龙膜柱上，紫外交联，固定；(4)检测组连接接头将酶切后的检测组DNA或cDNA连接接头；(5)进行消减杂交将连接接头后的检测组加到固定有驱动组的尼龙膜柱上，进行数轮杂交，得消减产物；(6)消减产物的分组扩增用分组引物将消减产物分组进行扩增，得扩增产物；(7)消减杂交文库的构建扩增产物与T载体连接，构建消减文库。
2.根据权利要求1所述的消减杂交文库构建方法，其特征在于步骤(1)中所述的尼龙膜柱由上柱(1)、下柱(4)、尼龙膜(3)和密封垫圈(2)组成，其中上柱(1)和下柱(4)均为空心柱，上柱(1)的上半部(1a)直径大于下半部(1b)直径，下柱(4)的上半部(4a)直径大于下半部(4b)直径，上柱(1)的下半部(1b)与下柱(4)的上半部(4a)呈紧密配合，尼龙膜(3)置于下柱(4)的上半部(4a)与下半部(4b)的连接处并在其上放置密封垫圈(2)后由上柱(1)的下半部(1b)压紧。
全文摘要
本发明公开了一种消减杂交文库构建方法，该方法包括以下步骤(1)消减杂交装置的制备；(2)检测组和驱动组的酶切；(3)驱动组的固定；(4)检测组连接接头；(5)进行消减杂交；(6)消减产物的分组扩增；(7)消减杂交文库的构建。与传统的物理消减杂交方法相比，本发明具有以下优点1)消减杂交装置成本低，制作简单；2)尼龙膜与核酸分子以共价键结合，结合牢固；3)在杂交过程中可控制杂交温度和时间；4)可根据需要控制杂交轮次；5)洗脱体积可按需要控制在数十微升，便于进一步的操作；6)试验操作简单，可重复性好；7)在消减杂交后进行PCR，避免了假阳性的出现；8)消减后进行分组PCR，可使低丰度的差异表达cDNA扩增。
文档编号C12P19/00GK1542138SQ20031011206
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年11月7日
发明者马文丽, 郑文岭, 宋艳斌 申请人:中国人民解放军基因工程研究所