一种构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的方法。
【背景技术】：
[0002] 酵母双杂交系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域，DNA结合域 (DNAbindingdomain，BD)及转录激活域（activationdomain，AD)，将已知基因（诱馆基 因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上，当这两种质粒共同 转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编 码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4 转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如Ade、His及Lac等的表达，从而在特定的缺陷 培养基上生长。因此，利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研 宄己知蛋白间的相互作用。
[0003] 其中酵母双杂交cDNA文库的构建一般在cDNA两端加上同源重组序列，然后与革巴 蛋白载体如pGADI7-Rec共同转化革巴蛋白酵母菌株如AH109,在酵母同源重组酶的作用下， cDNA序列整合到载体上，完成cDNA文库的构建。由于绝大多数真核细胞mRNA 3'端具有 P〇ly(A)尾，所以提取真核生物的总RNA后可通过使用带有Oligo(dT)的同源重组序列与其 配对，仅mRNA可被反转录，同时反转录得到的cDNA已加上同源重组序列。
[0004] 但是细菌的mRNA绝大部分不带有Poly(A)尾，并且mRNA仅占总RNA的1-4%，若 使用随机六聚体作为引物，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，合成的cDNA 中96 %来源于rRNA，成分过于复杂。现有的针对细菌文库的构建一般是通过使用限制性内 切酶对细菌基因组DNA进行不完全酶切，然后与文库载体连接后转化大肠杆菌，无法避免 内切酶对位点的偏向性，大大降低文库的丰度，因此细菌的cDNA文库的构建及筛选一直被 限制。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种能高质量构建细菌的酵母双杂交cDNA文库的构建细菌 的酵母双杂交cDNA文库的方法。
[0006] 本发明的酵母双杂交cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 提取细菌总RNA，再去除总RNA中的5s rRNA、tRNA及小分子RNA，再对mRNA进行 富集，使用随机六聚体作为引物对富集的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)合成单链的cDNA， 再通过LD-PCR以单链的cDNA为模板扩增获得双链cDNA，再利用同源重组将全长双链cDNA 与文库载体共同转化靶蛋白酵母菌株，获得细菌的cDNA文库。
[0008] 优选，所述的去除总RNA中的5srRNA、tRNA及小分子RNA是利用试剂盒 MEGAclear?Kit去除的。
[0009] 优选，所述的对mRNA进行富集是利用试剂盒MICROB ExpressTM Bacterial mRNAEnrichment Kit(Ambion)对mRNA进行富集。
[0010] 优选，所述的酵母菌株为酵母菌株AH109。
[0011] 与已有方法相比，本发明提出了一种以细菌mRNA作为模板，反转录合成cDNA后 构建酵母双杂交cDNA文库的方法。由于是以mRNA为模板，不仅避免了以总RNA反转录时 rRNA产生干扰，也可以避免使用限制性内切酶对细菌基因组DNA的位点偏向性，文库的开 放性阅读框的正确性更高，质量非常好。
【附图说明】：
[0012] 图1是细菌总RNA的电泳检测图；
[0013] 图2是去除5srRNA、tRNA及小分子RNA的RNA样品的电泳检测图；
[0014] 图3是富集的mRNA的电泳检测图；
[0015] 图4是扩增获得的双链cDNA的电泳检测图；
[0016] 图5是用BD CHROMA SPIN TE-400滤柱纯化回收双链cDNA的电泳检测图；
[0017] 图6是酵母双杂交菌株Y2HG0LD的SD/-Leu平板涂布生长图；
[0018] 图7是cDNA文库质量检测的电泳检测图。
【具体实施方式】：
[0019] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0020] 实施例1 :细菌总RNA的提取
[0021] 将已活化的变形赖氨酸芽胞杆菌（Lysinibacillusvarians.)[其由赖氨酸芽孢 杆菌（Lysinibacillussp. )GY32(该菌于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2011307,公开于中国专利： ZL201110300903. 8)改名而来]转接到LB液体培养基中，30°C培养至对数生长期，8000rpm 4°C离心2min，弃上清。加入lmLTRIZ0L提取液，摇勾，漩祸振荡lOmin，加200iiL氯仿，混 勾5min，室温放置5min，4°C，13000rpm离心lOmin。吸取上清于另一干净的离心管中（约 600yL)，加入400yL异丙醇，_20°C沉淀lOmin，12000rpm离心lOmin。倒掉上清，加入lmL 75%乙醇，轻弹，8000rpm离心5min，倒掉上清，重复2次。RNA室温风干，加入20-30yLDEPC 处理水溶解，电泳检测如图1所示，_80°C超低温冰箱保存备用，得到总RNA。
[0022] 实施例2 :纯化并去除5srRNA、tRNA及小分子RNA，对mRNA进行富集；
[0023] 2. 1纯化并去除5srRNA、tRNA及小分子RNA
[0024]使用Ambionk'公司的MEGAclear?Kit处理总RNA。往RNA样品添加Elution Solution至体积为 100yL，混勾；添加 350yL的BindingSolution，混勾；添加 250yL100%的乙醇，混勾；把FilterCartridge套入CollectionandElutionTube中，将上述混 合液转移至FilterCartridge，lOOOOrpm离心lmin，倒掉废液；往FilterCartridge添加 500yLWashSolution，lOOOOrpm离心 30sec，倒掉废液，重复一次；把FilterCartridge 套入新的Collection/ElutionTube，往FilterCartridge中心添加 50yLElution Solution，65-70°C处理10min，离心收集溶液并电泳检测，如图2所示，总RNA样品已去除 5srRNA、tRNA及小分子RNA，由此得到去除5srRNA、tRNA及小分子RNA的RNA样品。
[0025]2. 2对mRNA进行富集
[0026]选择Ambinn?-公司的MICROBExpressTMBacterialmRNAEnrichmentKit 对mRNA进行富集，该体系对总RNA的质量和纯度要求是：A260/A280>1. 7,最大量不超过 10yg，并且最大体积不超过15yL;要求EDTA浓度大于ImM，以螯合二价阳离子防止在加 热过程中RNA水解。200yLBindingBuffer加到1. 5mLEppendorf管中（试剂盒提供）， 然后加入 2-10ygTotalRNA(〈10yg，〈15yL)(步骤 2. 1 中得到的去除 5srRNA、tRNA及 小分子RNA的RNA样品），小心混勾。加4yLCaptureOligoMix，小心混勾，低速离心， 将液体收集到管底。70°C加热10min，使rRNA变性破坏其二级结构，以便rRNA与capture Oligonucleotide充分杂交。37°C退火 15min，rRNA与captureoligonucleotide杂交。 延长退火时间对杂交充分有一定的帮助作用。在1.5mLEppendorf管加入所需的Oligo MagBeads，每个样品需要50yL。将1.5mLEppendorf管至于磁力架上，使OligoMagBeads 完全吸附到有磁性的一面，然后，小心地吸取上清并弃掉。加入等体积的Nuclease-free Water，小心地混勾，清洗OligoMagBeads，然后同上操作。加入等体积的BindingBuffer， 小心地混勾，平衡OligoMagBeads，同上操作。加入等体积的BindingBuffer，小心地混勾， 然后放入37°C水浴。向RNA/CaptureOligoMix中加入50yL处理好的OligoMagBeads， 小心混匀，轻轻离心收集到管底。然后37°C温育15min。使用磁力架吸附OligoMagBeads， 然后小心地将上清（含有富集的mRNA)转移到已置于冰上预冷的CollectionTube中。向 OligoMagBeads加入100yL预热到37°C的WashSolution，小心地混勾。然后使用磁力 架吸附OligoMagBeads，最后小心地将上清转移到已经含有mRNA的CollectionTube中。 在已获得的350yL洗脱液中加入1/10体积的3MSodiumAcetate(醋酸钠，35yL)，1/50 体积的5M的Glycogen(糖原，7yL)。加入3倍体积的冰冷的无水乙醇（1175yL)，充分混 匀，-20°C沉淀至少lh。13000rpm离心30min，小心吸去上清。加入70%的乙醇750yL洗涤 沉淀，13000rpm离心10min，再洗绦一次。室温下放置5min后加入50yL的Nuclease-free Water重新溶解沉淀。取出部分进行电泳检测如图3所示，mRNA已被富集，将其余的mRNA 放于-70°C备用，由此得到富集的mRNA。
[0027] 实施例3获得双链cDNA
[0028] 3. 1使用随机六聚体作为引物合成单链cDNA
[0029] 灭菌离心管加1-2yLRNA(0. 025-1. 0ygmRNA)(实施例2中的富集的mRNA)、 1. 0yL⑶SIII/6引物，加入灭菌去离子超纯水至总体积为4. 0yL;混匀，72°C水浴2分钟； 冰水中冷却2分钟，轻微离心；加入以下试剂：2. 0yL5XFirs