专利名称：一种快速构建差异表达基因文库的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速构建差异表达基因文库的方法。
背景技术：
抑制性消减杂交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)技术是 1996年DiatchenkoL等设计出的以抑制性PCR和消减杂交技术为基础的一种寻找差异表达基因的方法，具有稳定、灵敏等特点，是目前最具应用前景的研究工具之一，在新基因的分离鉴定中显示了重要的价值，得 到了广泛的应用。但此技术存在以下缺陷:①富集的cDNA片段克隆时仍有 10-40% 左右的假阳性(Gurskaya NG, Diatchenko L, Chenchik A., et al.Equalizing cDNA subtraction based on selective suppression of polymerase chainreaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin andphorbol 12-myristate 13-acetate.Anal Biochem.1996 ； 1: 90-97) !②虽然该法富集了差异表达基因，但是一些基因被多次重复克隆、检测，导致库容“虚增”;③该法无法预知多大的文库库容可以包含所有的差异基因，使检测到的表达基因偏少；④此法操作步骤多且成本偏高，普通实验室无力进行。上述原因导致对基因文库的分析极易出现误差，也限制了此技术的更广泛应用(曾勇，陆承平.cDNA微阵列结合抑制性差减杂交研究对虾白斑综合症病毒部分表达基因.病毒学报.2004;3:255-260)。因此，完善SSH技术，消除上述缺陷，为新基因的发现与功能研究提供更为完美、可靠的技术支持具有重要的科学意义。
变性梯度凝胶电泳技术(DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)通过核酸片段在变性条件下不同程度解链，从而导致这些片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率不同以此来显示核酸片段多样性的技术。DGGE技术具有如下优点:①双链DNA在变性梯度凝胶(变性剂浓度从小到大)的泳动过程中，其解链的速度和程度与其序列密切相关，在恰当的条件下，只要有一个碱基对的差异即可相互分开，应用“GC夹板”技术还可使大于500bp的DNA片段检出率提高到100%，能得到几乎所有微生物DNA多样性的信息，在微生物生态学的研究中得到了广泛的应用；②更为可贵的是，电泳凝胶上的条带可以在回收后直接测序，由于能检测出有差异的条带，不会出现重复测序以及漏检现象，从而能够构建“精确基因文库”;③由于取消了 PCR产物克隆程序，也就不会出现因克隆而导致假阳性的现象；④实验成本大幅度降低。但由于DGGE技术“能检异而不富异、不消同”，不能检测出某些丰度低于1%的基因，而恰恰这些丰度低于1%的基因往往就是关键的功能基因，由于未能得到“富集”而得不到检测，使其未能在构建差异表达基因文库中得到应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种快速构建差异表达基因文库的方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为寻找差异表达基因提供科学的依据和指导作用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种快速构建差异表达基因文库的方法，包括如下步骤:
a.提取感染鹅细小病毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总mRNA；
b.利用步骤a所得总mRNA合成双链cDNA，然后进行酶切消化，得酶切消化的双链cDNA ；
c.将步骤b所得酶切消化的双链cDNA分为2管，分别添加不同的接头进行连接，得加有接头的双链cDNA ；
d.将步骤c所得加有接头的双链cDNA先进行正向消减杂交，然后将正向消减杂交产物进行反向消减杂交，得反向消减杂交产物；
e.以步骤d所得反向消减杂交产物进行第一次PCR扩增，然后将扩增产物稀释，并以稀释液为模板进行第2次PCR扩增；
f.将步骤e中第2次PCR扩增的产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳后进行染色，得鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因文库。优选的,所述步骤b是利用步骤a所得总mRNA加入随机弓I物,先合成第一链cDNA,然后合成第二链cDNA，然后用Rsa I进行酶切消化，得酶切消化的双链cDNA。优选的，所述步骤c中，所述不同接头分别为接头I和接头2，所述接头I为5’_ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3，和 3，-ggcccgtcca-5，，所述接头 2 为5，_ctaatacga ctcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt_3，矛口 3，_gccggctcca_5，。优选的，所述步骤d中，所述正向消减杂交为分别取加有接头的双链cDNA，然后分别加入酶切消化的双链cDNA和杂交缓冲液，先在95-98°C条件下变性，再于65_68°C杂交8小时。优选的，所述步骤d中，所述反向消减杂交为将获得的正向消减杂交产物混合，然后加入变性的加有接头的双链cDNA，在65-68°C条件下过夜杂交。优选的，所述步骤e中，所述第一次PCR扩增的引物为5’ -ctaatacgactcactatagggc-S’。优选的，所述步骤e中，所述第二次PCR扩增是将第一次扩增产物稀释10倍作为模板，上游引物为5’ -tcgagcggccgcccgggcaggt-3’，下游引物为5， _agcgtggtcgcggccgaggt_3，。更优选的，所述变性梯度凝胶电泳为配制质量分数为6-8%的丙烯酰氨、变性梯度范围为质量分数25%-45%的变性梯度胶，将步骤e所得第二次PCR产物分别加入不同泳道，先在150V条件下电泳15分钟，再在120V条件下电泳7小时，然后银染显色。本发明的有益效果在于:本发明利用变性梯度凝胶电泳技术取代抑制性消减杂交中引起假阳性等技术缺陷的克隆步骤，将其应用于差异表达基因文库的快速构建，更适合于差异表达基因文库的快速构建。应用本发明公开的方法具有“消同富异”的作用，直接对富集了成百上千倍的差异基因，然后将两次扩增的PCR产物进行DGGE检测，将得到的条带测序后构建差异表达基因文库，既简化了操作程序，降低了实验误差和实验成本，又因不用克隆而彻底消除了 SSH假阳性现象的发生，还因为能电泳检测出有多少条差异性条带而精确知道基因文库的库容，为新基因的发现与功能研究提供更为完美、可靠的技术支持。
图1为构建的差异表达基因文库(I为皮下攻毒组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；2为口服攻毒组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；3为滴鼻攻毒组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；4为阴性对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；5为皮下攻毒对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；6为口服攻毒对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；7为滴鼻攻毒对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带；M为Marker)。
具体实施例方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。1、免克隆抑制性消减杂交(ACSSH)试剂:随机引物、5XFirst_strand Buffer(第一链缓冲液)、连接缓冲液、杂交缓冲液、Taq聚合酶缓冲液、Second-strand EnzymeCocktail (第二链合成酶)、5X Second-strand Buffer (第二链缓冲液)、dNTPs、ddH20、AMV逆转录酶、T4 DNA聚合酶、EDTA/Glycogen Mix (EDTA/糖混合液)、苯酚:氯仿:异戊醇为25:24:1 (体积比)、Rsa I 酶、Rsa 缓冲液、T4 DNA 连接酶、Testerl-1 (转录物 l)、Testerl_2(转录物 2)、Adaptorl (接头 I)、Adaptor2 (接头 2)、5XLigation Buffer (连接缓冲液)、Ligation master mix (连接反应液)和Taq DNA聚合酶，以上试剂均购自上海生工生物工程科技有限公司。 2、变性梯度凝胶(DGGE)试剂:质量分数为40%聚丙烯酰胺贮存液、0%变性梯度凝胶、质量分数为80%变性梯度凝胶、硝酸银染色液、固定终止液(含体积分数为10%乙醇、体积分数为0.5%冰乙酸的溶液)、显影液(12g氢氧化钠溶解于400 mL超纯水中，4°C冰箱冷却约2h,临用前加入2 mL 37%甲醒)、DGGE loading buffer (溴苯酌.蓝0.05g,甲醇0.05g,1XTAE10.00 mL).一种快速构建差异表达基因文库的方法，具体步骤为:
a、提取细胞总mRNA
取140只7日龄无鹅细小病毒(GPV)的雏鹅饲养在SPF动物饲养房，随机分为7组，第一组、第二组和第三组分别为皮下、口服和滴鼻攻毒取样组，每组30只，其中20只为攻毒鹅，10只为同居鹅，攻毒剂量为强毒GPV每只0.1mL ;第四组为阴性对照组(健康对照组)20只，隔离饲养；第五组、第六组和第七组每组10只，分别为皮下、口服和滴鼻感染阳性对照组；攻毒后于24小时、48小时、72小时和6天后采样，攻毒组、同居组和健康对照组每次采3只，采集法氏囊于_80°C保存备用，攻毒后随时观察临床症状和死亡鹅解剖变化。取所有法氏囊样本并分别提取细胞总RNA,提取步骤按照RNeasy plus Mini Kit说明书进行(该试剂盒购自QIAGEN公司)，所提RNA经紫外分光光度计进行浓度测定，然后将总RNA稀释至DNA OD260/OD280在1.6-2.0范围内，其浓度在IO-1OOng/ μ L范围内。、获得双链cDNA ①cDNA第一链的合成
I)在0.5mL经DEPC处理过的离心管中分别加入攻毒组(tester )和阴性对照组(driver)的mRNA各2Pg，然后加入 μ (10μΜ)随机引物，70°C温浴2min，迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物:5 X First-strand Buffer2M-L ；
dNTPs (IOmM) μ ；
ddH20I μ ；
AMV 逆转录酶(20U/>L)Ιμ ；
2)42°C反应1.5小时,然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。②cDNA第二链的合成
1)在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入如下反应物: ddH2048.4μ ；
5 X Second-strand Buffer16.0M-L ；
dNTPs (IOmM)1.6μ ；
20XSecond-strand Enzyme Cocktail4.0M-L ；
2)加入2μ (6U)T4 DNA Polymerase，13_16°C反应 30min。3)加入 20XEDTA/Glycogen Mix 4μ ,以终止反应。4)加入100μ 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(体积比)抽提，然后加入100μ 浓度为3 mo I/L的醋酸铵和IOOPL体积分数为95%的乙醇进行沉淀，沉淀出cDNA双链，经3000r/min离心20 min后 去上清,沉淀用体积分数为80%乙醇进行洗漆，自然干燥10 min后加入50μ 灭菌去离子水溶解，置于-20°C备用。③cDNA的酶切消化
1)将步骤②制备的双链cDNA经35-37°C过夜酶切，酶切体系为: cDNA 双链43.5μ ；
IOXRsa Restriction Buffer5.Ομ ；
Rsa I (lOU/μυ1.5μ ；
2)每管用2.5μ EDTA/Glycogen混合物终止反应。3)加入50μ 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(体积比)抽提，上清置于1.5 mL离心管中加入100μ 浓度为3 mol/L的醋酸铵和100μ 体积分数为95%的乙醇沉淀，而后经体积分数为80%的乙醇洗涤后自然干燥10 min,并沉淀出酶切后的双链cDNA，溶解于5.5μ 双蒸水中。、cDNA连接接头
将步骤b酶切消化的双链cDNA分为两份，一份与接头I连接，另一份与接头2连接，其中接头 I 的序列为 5，-ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3’ (SEQ IDN0.1)和 3，-ggcccgtcca-5，(SEQ ID N0.2);接头 2 的序列为 5，-ctaatacgactcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt-3，(SEQ ID N0.1)和 3，-gccggctcca-5，(SEQ ID N0.3)。具体步骤如下:
1)取IKL酶切的双链cDNA用5PLddH20稀释；
2)连接反应液(LigationMaster Mix)的制备如下: ddH20 3μ ；
5 X Ligation Buffer2 ；
T4 DNA连接酶WL ；3)在两个EP管中分别加入如下试剂
权利要求
1.一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于，包括如下步骤: a.提取感染鹅细小病毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总mRNA； b.利用步骤a所得总mRNA合成双链cDNA，然后进行酶切消化，得酶切消化的双链cDNA ； c.将步骤b所得酶切消化的双链cDNA分为2管，分别添加不同的接头进行连接，得加有接头的双链cDNA ； d.将步骤c所得加有不同接头的双链cDNA分别先进行正向消减杂交，然后将正向消减杂交产物进行反向消减杂交，得反向消减杂交产物； e.以步骤d所得反向消减杂交产物进行第一次PCR扩增，然后将扩增产物稀释，并以稀释液为模板进行第2次PCR扩增； f.将步骤e中第2次PCR扩增的产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳后进行染色，得鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因文库。
2.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤b是利用步骤a所得总mRNA加入随机引物，先合成第一链cDNA，然后合成第二链cDNA，然后用Rsa I进行酶切消化，得酶切消化的双链cDNA。
3.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤c中，所述不同接头分别为接头I和接头2，所述接头I如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述接头2如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3所示。
4.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤d中，所述正向消减杂交为分别取加有接头的双链cDNA，然后分别加入酶切消化的双链cDNA和杂交缓冲液，先 在95-98°C条件下变性，再于65-68°C杂交8小时。
5.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤d中，所述反向消减杂交为将获得的正向消减杂交产物混合，然后加入变性的加有接头的双链cDNA，在65-68°C条件下过夜杂交，再加入稀释液后在65_68°C条件下保温7分钟。
6.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤e中，所述第一次PCR扩增的引物如SEQ ID N0.4所示。
7.根据权利要求1所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征在于:所述步骤e中，所述第二次PCR扩增是将第一次扩增产物稀释10倍作为模板，上游引物如SEQ IDN0.5所示，下游引物如SEQ ID N0.6所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述一种快速构建差异表达基因文库的方法，其特征于:所述变性梯度凝胶电泳为配制质量分数为6-8%的丙烯酰氨、变性梯度范围为质量分数25%-45%的变性梯度胶，将步骤e所得第二次PCR产物分别加入不同泳道，先在150V条件下电泳15分钟，再在120V条件下电泳7小时，然后银染显色。
全文摘要
本发明公开了一种快速构建差异表达基因文库的方法，包括如下步骤先提取感染鹅细小病毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总mRNA；利用获得的mRNA合成双链cDNA进行酶切消化，然后分为2管，分别添加不同的接头进行连接；将加有接头的双链cDNA先进行正向消减杂交，然后将正向消减杂交产物进行反向消减杂交，反向消减杂交后再进行第一次PCR扩增，将扩增产物稀释后，以稀释液为模板进行第2次PCR扩增；最后将第2次PCR扩增的产物进行变性梯度凝胶电泳，电泳后进行染色，得鹅细小病毒胁迫法氏囊的差异表达基因文库；利用本发明的方法构建的基因文库无假阳性，并且具有速度快、灵敏度高、特异性强、成本低廉，操作方便等特点。
文档编号C40B50/06GK103114086SQ20131005240
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者杨金龙, 刘作华, 黄勇, 张素辉, 杨睿, 张邑帆, 郑华, 李成洪, 杨晶旭 申请人:重庆市畜牧科学院, 杨晶旭