专利名称：：在乳腺癌和膀胱癌中差异表达的基因及编码的多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达的新的人基因。本发明尤其涉及编码名为C35的新的人多肽的多核苷酸。本发明还涉及C35多肽及其载体、宿主细胞、C35多肽的抗体，及其重组制备方法。本发明进一步涉及检测癌的诊断方法，包括人乳腺癌和膀胱癌。本发明另外涉及C35基因及多肽在免疫原性组合物或疫苗中的组成和应用，以诱导针对表达C35基因的靶细胞(例如肿瘤细胞)的抗体和细胞介导的免疫。本发明还涉及鉴定C35活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。
背景技术：
：在美国，每年约有一百二十万人受癌症折磨。其中大约50%的癌症可以利用手术、放疗和化疗进行医治。尽管这三种疗法取得了显著的技术进步，仅美国每年仍有500，OOO以上的人死于癌症(Jaffee，E.M.，Ann.N.Y.Acad.Sci.886:67-72(1999))。多数在远端例如肝、脑、骨和肺复发，故急需改善系统疗法。癌症治疗的目标在于发展特异性针对肿瘤细胞的方法，从而避免对正常组织不必要的副作用。免疫疗法有可能为多数类型的癌症提供一种可选择的系统疗法。免疫疗法较之放疗和化疗的优势在于，它可以特异性作用于肿瘤，而不引起正常组织损伤。疫苗是免疫疗法的一种形式，它还可以提供主动免疫接种，从而放大免疫应答，所以格外引人注意。此外，疫苗可以产生记忆型免疫应答。开发癌症疫苗的努力基础是改变肿瘤细胞的特性，使免疫系统识别为非我，从而诱导保护性免疫的可能性。此策略是否可行，取决于如何改变转化细胞的特性。由突变在肿瘤转化中重要作用的理解得出假说，肿瘤抗原是遗传不稳定细胞随机突变的结果。虽然随机突变可产生免疫原性，但可以预计其将诱导每种肺瘤所特有的特异性免疫。这不利于开发广泛有效的肺瘤疫苗。但另一假说认为，肿瘤抗原可能是与转化过程有关的、系统性及可再生性组织特异性基因失调的结果。这可以引起某些类型肺瘤中共有抗原表达的的质或量的差异，这些抗原可能是免疫治疗的合适目标。早期研究结果证明，某些实验肿瘤的免疫原性可以回溯到随机突变(DePlaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2274-2278(1988);Srivastava,&Old,Immunol.Today9:78(1989)),显然支持第一种假说。但无法解释随机突变和系统性基因失调不能均引起肺瘤表达新免疫原的原因。实际上，近来实验胂瘤(Sahasrabudhe等，Jli隱nol.151:6202-6310(1993);Torigoe等，J.Immunol.147:3251(1991))以及人黑素瘤(vanDerBruggen等，Science254:1643-1647(1991);Brichard等，J.Exp.Med.178:489-495(1993);Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3515-3519(1994);Boel等，Immunity2:167-175(1995);VandenEynde等，J.Exp.Med.182:689-698(1995))的研究清楚表明，由失调的正常基因编码的肿瘤共有抗原表达。MAGE-l及其它各种人黑素瘤共有抗原的鉴定，为今后开发多种肿瘤疫苗带来巨大希望。尽管黑素瘤取得了进展，但对于其它人类肿瘤来说，能为细胞毒性T细胞识别的共有抗原几乎未被描述过。主要是技术性难题。鉴定唯有胂瘤细胞表达的免疫原性分子，最普遍以及迄今最成功的方法是筛选肿瘤特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的cDNA文库。已经应用此策略鉴定了数个主要在人黑素瘤中表达的基因家族。然而此方法的两个主要局限是，(l)筛选需要繁重的转染工作，将众多重组DNA小库转染到分离的目标群体(为表达抗原递呈所需的一种或多种MHC分子，其本身经常需要修饰)，以测定由某些库的微量组分产生的T细胞刺激；(2)可能除肾细胞癌以外，难以从其它类型肿瘤(特别是包含8096以上人类肿瘤的上皮细胞癌)病人的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或PBL中分离肺瘤特异性CTL。似乎是存在组织特异性特征，其导致黑素瘤中肺瘤特异性CTL被隐蔽。用肿瘤特异性基因产物直接免疫，对于诱导针对某些肿瘤共有抗原的免疫应答是必要的。已有人争辩说，如果肿瘤表达强抗原，则在其具有临床表现之前应已被根僚。或许肺瘤只表达弱抗原。免疫学者一直对是什么使抗原弱或强的问题感兴趣。有两个主要假说。弱抗原可能没有很好加工，不能有效递呈给T细胞。或者，生物体中具有适当特异性的T细胞数量可能不足以产生强有力的应答(所谓〃holeinther印ertoire〃)。阐明抗原性肽联合MHC分子以转运到细胞表面并呈递给T细胞的复杂细胞过程，是现代免疫学的胜利。实验清楚证实，加工缺陷或其它肽的竟争作用所引起的递呈失败，可以降低特定肽的免疫原性。反之，由于技术原因，更难证实T细胞库中典型克隆的频率是低水平应答的重要机制。然而最近研究表明，T细胞受体转基因小鼠中蛋白质抗原的免疫显性和隐性肽之间关系的变化提示，肽特异性T细胞的相对频率确实是T细胞应答中特定肽是隐性或显性的决定性因素。这促进了疫苗开发。使用目前方法修饰胂瘤抗原肽加工及T细胞递呈的方式，是复杂和困难的。然而可以通过在预先接种，直接并有效地增加特异性T细胞的相对频率。因此这是使原先隐性的应答得到免疫保护的关键。隐性或亚显性抗原的这些方面，与肺瘤可能通过诱导耐受而逃避免疫特别有关。现有证据提示，肿瘤宿主的肿瘤特异性T细胞没有反应性，可能是在非专司APC上递呈抗原的结果(Morgan,D.J.等，J.Immunol.163:723-27(1999);Sotomayor,E.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:11476-81(1999);Lee,P.P.等，NatureMedicine5:677-85(1999)).因此，肺瘤免疫显性抗原的特异性T细胞预先耐受可能导致了难以开发癌症免疫治疗的成功策略。这些结果提示，免疫显性肺瘤抗原的特异性T细胞对于既成肺瘤的免疫治疗不大可能有效，因为它们很可能已经耐受了。因此，亚显性抗原的特异性T细胞或最初以较低频率存在的T细胞可能会更为有效，因为它们避免了生长中肺瘤耐受的影响。开发广泛有效的人类疫苗所关心的另一主要方面是，HLAI类分子的高度多态性。腿CI类细胞肽复合物是特异性008+CTL的靶抗原。细胞肽由内源合成的蛋白质降解产生，移位到前高尔基小室，在此与I类MHC分子结合，转运到细胞表面。CD8分子有助于T细胞和目标通过结合l类重链a3结构域而相互作用的亲和力。因为所有内源性蛋白质都转变，来源于任何胞质或核蛋白的肽可能结合MHC分子并转运，呈递于细胞表面。这使T细胞比抗体针对的细胞蛋白质群体更大，抗体只局限于识别那些分泌的或整合于细胞膜的蛋白质的构象决定蔟。T细胞受体的抗原结合位点与肽以及周围MHC的决定簇相互作用。因此必须按照MHC:肽复合物来确定T细胞的特异性。肽结合MHC分子的特异性很广，与特异性抗体的抗原结合位点相比，其亲和力相对较低。I类分子结合的肽一般长为8-IO个残基，并调节氨基酸侧链，限定某些关键位点的多样性，以匹配MHC肽结合位点的口袋。结合特定MHC分子的肽的这些主要特征，构成肽结合基序。因此，需要促进人类肺瘤、癌症和感染细胞的特异性T细胞诱导和分离的方法，以及有效筛选编码由这些处于适当MHC环境下的T细胞识别的主要靶抗原的基因的方法。发明概述本发明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达的新的多核苷酸C35及其编码多肽。本发明另外涉及载体、宿主细胞、抗体，以及产生C35多肽和多核苷酸的重组方法。本发明进一步涉及C35多肽和多核苷酸在免疫原性组合物中的组成和应用，以针对表达C35基因产物的耙细胞(例如肺瘤细胞)，诱导抗体和细胞介导的免疫。还提供检测C35基因和多肽相关疾病的诊断方法，包括用作癌症(例如人乳腺癌)的预后标志，以及上述疾病的治疗方法。本发明另外涉及筌定C35的结合配偶体的筛选方法。附图简述图1(图A-B).图A显示C35DNA编码序列(SEQIDNO:1)。紧接预测的ATG起始密码子上游的序列如小写字母所示，符合Kozak，M.，J.Biol.Chem.266(30):19867-19870(1991)所述预期特征。图B显示推断的C35氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图2.(图A-C).图A:C35在乳腺肺瘤细胞系中过表达。上图将3周龄人胸腺、病人21的正常乳腺上皮细胞系H16N2、以及一年后取自同一病人21的原发或转移结节的4个乳腺肿瘤细胞系21NT、21PT、21MT1和21MT2的300ng的poly-ARNA，用1%琼脂糖/甲醛凝胶分离，转到GeneScreen膜。印迹与"P标记的C35探针杂交。将印迹在胶片上曝光15小时，进行杂交检测。下图为测定RNA载样量，切下相同印记，与"P标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的探针重杂交。根据GAPDH信号归一化每个样品的C35信号。数字代表每个样品相对于H16N2的C35表达倍数。图B:C35在正常组织中低水平表达。包含lug每种指定的成人正常组织poly-ARNA(Clontech)的印迹，与3卞标记的035探针杂交。印迹在胶片上曝光15小时(上图)或96小时(下图)，进行杂交检测。图C.C35在原发乳腺肿瘤中过表达。包含3种原发浸润乳腺导管癌T1、T2、T3和l种正常乳腺上皮细胞N(Invitrogen)的2ngpolyARNA的印迹，与"P标记的C35探针杂交。杂交混合物中包括"P标记的p-肌动蛋白探针，以归一化载样量。印迹在胶片上曝光6小时，进行杂交检测。数字代表每个样品中相对于正常乳腺上皮细胞的C35表达倍数。图3.C35在乳腺胂瘤细胞系中的表达。C35在各种乳腺肺瘤细胞系中过表达。上图BT474(ATCCHYB-20，乳腺导管癌)、SKBR3(ATCCHTB-30,乳腺腺癌)、T47D(ATCCHTB-133，乳腺导管癌)、病人21的正常乳腺上皮细胞系H16N2以及来源于同一病人21的原发肺瘤结节的乳腺肿瘤细胞系21-NT的300ngpoly-ARNA，经l%琼脂糖/甲醛凝胶分离，转到GeneScreen膜。印迹与"P标记的C35探针杂交。将印迹在胶片曝光15小时，进行杂交检测。下图为测定RNA载样量，切下同一印迹，与"P标记的(3-肌动蛋白的探针重杂交。根据肌动蛋白信号归一化每个样品的C35信号。数字代表每个样品中相对于H16N2的C35表达倍数。图4(图A-C):流式细胞术检测C35蛋白质的表面表达。用3.5ulBALB/c小鼠的针对Linel小鼠肿瘤细胞(转导有编码人C35的逆转录病毒)的抗血清，或放血前的BALB/c血清作对照，染色lx105个乳腺肺瘤细胞。温育30分钟后，用染色緩冲液(PAB)洗涤细胞两次，与FITC-山羊抗小鼠IgG(lug/样品)温育30分钟。洗涤样品，用EPICSElite流式细胞仪分析。图A:21NT图B:SKBR3。图C:MDA-MB-231。选择这三个乳腺肺瘤细胞系代表Northern印迹中高、中和低水平表达C35RNA的肿瘤细胞(参见图3)。缩写nms,ns,正常小鼠血清；C35，C35免疫血清。图5(图A和B).CML选择的重组牛痘cDNA克隆刺激肿瘤特异性CTL。图A:测定CML选择的牛痘克隆在感染B/C.N后，刺激肿瘤特异性CTL分泌y干扰素的能力。ELISA测定细胞因子的量，以OD490表示(14)。OD490为1.4近似等于4ng/mlIFNg，OD490为0.65近似等于1ng/mlIFNg。图B:CML选择的克隆使宿主细胞对肿瘤特异性CTL的裂解敏感。指定牛痘病毒克隆按moi二l感染6孔板中的单层B/C，N。感染14小时后收获感染细胞和指定的对照耙细胞，用"Cr标记。靶细胞按指定比例与肺瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37。C温育4小时，测定特异性裂解的百分率(15)。此实验至少重复三次，得到相似结果。图6(图A和B).肺瘤抗原由核糖体蛋白质L3基因编码。H2.16和rpL3的序列为45-56位氨基酸。图A:cDNA克隆rpL3的氨基酸(单字母表示)和核苷酸序列(GenBank入藏号Y00225)。图B:相对于发表的L3核糖体等位基因，H2.16肿瘤cDNA中的C170T单核苷酸置换是唯一的序列改变。此置换导致蛋白质中氨基酸T54I的置换。图7(图A和B).鉴定肿瘤特异性CTL识别的肽表位。图A:CML分析鉴定肿瘤特异性CTL识别的肽。用"Cr标记靶细胞(15)。在"Cr温育期间，B/C.N细胞样品与lpM肽L348-56(154)、100jiML348—56(T54)或100pM肽L345—54(154)温育。靶细胞与指定比例的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37。C温育4小时，测定特异性裂解的百分率。此实验至少重复三次，得到相似结果。图B:肽L34856(I54)的滴定。用"Cr标记耙细胞。在"Cr温育期间，B/C.N细胞样品在不加入肽(D)或与指定浓度(l^iM、10nM、lnM)的L3化—56(154)(b)温育，BCA39细胞用作阳性对照(▲)。靶细胞与13指定比例的胂瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞37。C温育4小时，测定特异性裂解的百分率。实验重复两次，结果相似。图8(图A-C).各个细胞系表达的L3的分析。图A:公开的rpL3和H2.16.的Sau3AI图谱。首先所示为公开的核糖体蛋白质L3基因(上图)和H2.16(下图)的Sau3AI限制性图谱。公开的L3序列cDNA经消化产生200、355、348、289和84bp的片段。除了C170T所致168位另一Sau3AI位点以外，H2.16的图谱相同。该置换产生168bp消化产物，而不是200bp片段。图B:BCA肺瘤表达L3的两个等位基因。利用L3特异性引物，从各个细胞系或vH2.16中获得RT-PCR产物，然后用Sau3AI消化，3%琼脂糖凝胶80伏分离2小时。图C:免疫原性L3等位基因在B/C.N、BCB13和胸腺中的表达水平大幅降低。利用"P末端标记的5'PCR引物，从各个指定样品中获得L3特异性RT-PCR产物。以各个样品的RNA为PCR模板，不经cDNA合成，则无PCR产物，表明样品没有污染基因组DNA。凝胶纯化PCR产物，保证其纯度，用Sau3AI消化，3%琼脂糖凝胶60伏分离15小时。不加入模板的对照PCR样品没有观察到PCR产物。此结果共重复3次。图9(图A-C).用iL3免疫具有免疫保护性。图A:用H2.16免疫诱导了肿瘤特异性CTL。通过皮下注射5X106pfu的vH2.16或对照载体v7.5/tk,免疫Balb/c小鼠(2只/组)。7天后收获脾细胞，用肽1^348-56(154)再刺激(26)。第二次再刺激五天后，如图ll所述进行铬释放分析试验测定淋巴细胞。L348—56(154)肽使用浓度为lnM，1^348-56(丁54)肽使用浓度为100pM。重复该免疫实验，获得相似结果。图B和C:雌性Balb/cByJ小鼠按指定方法免疫(27)。腹壁SC注射200，000个活BCA34胂瘤细胞，激发小鼠。激发后35天获取数据。这些数据代表4次独立实验。图10(图A和B).图A:翻译的C35编码序列；5'和3'非翻译区用小写字母表示。方框中为预测的3，端异戊二烯化位点CVIL。图B:C35基因在染色体17上的基因组排列。图ll(图A和B).C35在乳腺癌中的表达。通过随机引发反应用，标记C35，并按l()6cpm/ml进行Northern印迹杂交。切下每个印迹，用GAPDH或P肌动蛋白再探查，以归一化mRNA载量。数字表示相GAPDH/p-肌动蛋白归一化的密度测定法比值。指定正常细胞系H16N2的值为1，所有数值都相对于该标准细胞系的表达水平。图A:C35在乳腺上皮细胞系中的表达。图B:C35在原发乳腺组织/胂瘤中的表达。将300ngmRNA进行O.8%碱性琼脂糖凝胶电泳，然后转印到GenescreenPlus,图B最左侧图例外，其上样来自3个原发胂瘤和1个正常组织对照的1ugmRNA(RealTu隨Blots，Invitrogen)。所示对所有印迹同样的曝光结果。图12.C35在膀胱癌中的表达。C35通过随机引发反应标记上"P,按106cpm/ml与肿瘤和正常RNA进行Northern印迹杂交。切下印迹，用P-肌动蛋白重探查，以归一化mRNA载量。数字表示相对p-肌动蛋白归一化的光密度法比值。数值相对于正常膀胱样品的表达水平。将300ngm靈进行O.8%碱性琼月旨糖凝胶电泳，然后印迹到GenescreenPlus。图13(图A和B).利用抗C35抗体进行FACS分析。图A:利用经Linel细胞(用C35重组逆转录病毒感染的)免疫的小鼠的血清(上图)以及2C3纯化的单克隆抗体(下图)或同型对照，染色乳腺细胞系。图B:利用2C3纯化的单克隆抗体或同型对照染色膀胱细胞系。图14.2C3抗体存在下的肿瘤生长抑制。21NT乳腺肿瘤细胞或H16N2正常乳腺上皮细胞与所示浓度的2C3抗C35单克隆抗体或非特异性同型对照抗体温育。在有或无抗体的情况下温育72小时后，利用XTT试验测定细胞生长。图15(图A和B).由表达C35的树突状细胞刺激的CTL特异性溶解C35+乳腺(21NT)和膀胱(ppTllA3)肿瘤细胞系，对正常乳腺(MEC)、永生化的生瘤乳腺(H16N2)和膀胱(SV-HUC)细胞系、或NK敏感细胞系(K562)具有较小的活性。图A:T细胞抹系4自正常人PBL产生。图B:从抹系4中筛选C35特异活性的T细胞克隆10G3。把细胞系MEC、ppTllA3和SV-HUC为天然HLA-A2阳性。把细胞系21NT和H16N2用HLA-A2转染，以提供所需MHC限制成分。图16(图A和B).在靶物质的刺激下T细胞克隆10G3释放细胞因子。图A:IFN-y分泌。图B:TNF-a分泌。乳腺和膀胱靶细胞系区别在于是否表达HLA-A2和C35肿瘤抗原、C35的氨基末端50个氨基酸片段(C35-50aa)或无关的小鼠L3核糖体蛋白质。每个标志或为内源性表达的，或通过转染HLA-A2.1构建体(pSV2.A2)或感染C35(vv.C35、vv,C35-50aa)、L3(vv.L3)或HLA-A2(vv.A2)的重组牛痘疫苗而引入的。图17(图A和B).抗CD40配基抗体(抗-CD154)阻断鼠T细胞与特异性移植抗原反应性的效果。用107C57B1/6(H-2"脾细胞腹膜内免疫DBA/2(H-2b)小鼠，并在接种时以及两天后另外注射盐水或O.5mg单克隆抗CD40配基抗体(MR1，抗CD154，PIiarmingen09021D)。免疫后第IO天，取出这些小鼠的脾细胞，用C57Bl/6或经照射(20Gy)的异源C3H(H-2k)对照脾细胞体外刺激。体外刺激5天后，利用特异性标记靶细胞的"Cr释放分析，按不同效应细胞靶细胞比例，分析C57B1/6和C3H特异性的溶细胞反应，在此情况下，用同源脾细胞裂解物脉冲C3H或C57Bl/6树突状细胞。针对C3H同种抗原对照，在盐水和抗CD154处理的小鼠中都诱导显著的细胞毒性(图17A)，而对于C57B1/6，只在哉水处理小鼠中诱导细胞毒性反应，而在抗CD154处理的小鼠中没有诱导细胞毒性反应(图17B)。发明详述定义提供下列定义，以帮助对本说明书所用某些术语的理解。本发明中"分离"是指物质从其天然环境分离(例如，如果其为天然产生时的自然环境)，并因而人工改变其自然状态。例如，分离的多核香酸可以是载体或物质组合物的部分，或者包含于细胞中，但仍然是"分离"的，因为载体、物质组合物或特定细胞并非该多核苷酸的原始环境。本发明中"膜"C35蛋白质是通过直接或者间接与脂双层连接(尤其包括通过羧基末端氨基酸基序的异戊二烯化)而表达于细胞表面的一种蛋白质。异戊二烯化包括通过加入法呢基或香叶基香叶基类异戊二烯共价修饰蛋白质。异戊二烯化发生在蛋白质羧基末端附近的半胱氨酸残基上。C35多肽112-115位包含氨基酸Cys-Val-Ile-Leu，其C末端残基为Leu。基序Cys-X-X-Leu(其中"X"代表任何脂肪族氨基酸)导致在Cys残基上加入20碳的香叶基香叶基基团。一般在加入该脂类以后，3个末端氨基酸残基将从多肽上断裂，脂类基团甲基化。异戊二烯化促进大多数蛋白质(其多肽中具有参与将该异戊二烯化蛋白质导向原生质、核或高尔基膜的序列基序)的膜定位。异戊二烯化在蛋白质-蛋白质相互作用中起作用，许多异戊二烯化蛋白质与信号转导有关。异戊二烯化蛋白质的例子包括Ras和核纤层蛋白B。(Zhang，F.L.andCaseyP.J.，插.胁,"/oc力e"/.65:241-269(1996)).利用小鼠抗人C35抗血清进行荧光分析，已经在两个乳腺肿瘤细胞系表面上检测到C35蛋白质(图4)。本发明中"分泌"的C35蛋白质是指能够通过信号序列导向到ER、分泌小泡或细胞间隙的蛋白质，以及释放到细胞间隙的不一定包含信号序列的C35蛋白质。如果C35分泌蛋白质释放到细胞间隙，则其可经胞外加工，产生"成熟"C35蛋白质。可以通过许多机制释放到细胞间隙中，包括胞吐作用和蛋白水解裂解。此处所用C35"多核苷酸"是指具有SEQIDN0:1中包含的核酸序列的分子。例如，C35多核苷酸可包含全长cDNA的核苷酸序列，包括5'和3'非翻译序列、编码区、有或者没有信号序列、分泌蛋白质的编码区，以及该核酸序列的片段、表位、结构域和变体。此外，此处所用C35"多肽"广义是指具有由多核苷酸翻译的氨基酸序列的分子。特定的实施方案中，本发明的多核苷酸长度少于300nt、200nt、100nt、50nt、15nt、10nt或7nt。另外的实施方案中，本发明的多核苷酸包含C35编码序列中至少15个连续核苷酸，但不包含任何C35内含子的全部或部分。另一实施方案中，包含C35编码序列的该核酸，不包含基因组侧翼基因的编码序列(即在基因组中C35基因的5'或30。本发明全长C35编码序列如SEQIDNO:l所示。C35"多核苷酸"也指编码C35多肽的分离的多核苷酸，及其紧密相关的多核苷酸。C35"多核苷酸"也指编码SEQIDN0:2所示氨基酸序列或其生物学活性片段的分离的多核苷酸。C35"多核普酸"还包括能够在严谨的杂交条件下，与SEQIDN0:1所含序列、其互补序列或保藏克隆中的cDNA杂交的多核苷酸。"严谨杂交条件"是指在包含50%曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt's液、10。/。硫酸葡聚糖和20ug/ml变性断裂鲑鱼精DNA的溶液中42。C温育过夜，然后用O.lxSSC约65。C洗膜。当然，"多核苷酸"的定义中不包括仅与polyA+序列(例如cDNA的任何3，端polyA+区)或T(或U)残基互补的序列杂交的多核苷酸，因为这种多核苷酸可以与任何包含poly(A)区或其互补序列的核酸分子(例如特别是任何双链cDNA克隆)杂交。C35多核苷酸可由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，可以是未修饰或者修饰的RNA或DNA。例如，C35多核苷酸可由单链和双链DNA、单双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单双链区混合的RNA以及包含单链或一般为双链或单双链区混合的DNA和RM的杂合分子组成。此外，C35多核香酸可由包含RNA、或DNA、或RNA和DNA的三链区组成。C35多核苷酸还可包含因稳定性或其它原因而修饰的一个或多个修饰碱基或DNA或RNA主链。〃修饰〃碱基包括，例如三苯甲基化碱基以及稀有碱基，例如次黄苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此〃多核苷酸〃包含化学、酶学或代谢修饰的形式。C35多肽可由通过肽键或修饰的肽键彼此相连的氨基酸(即肽同排体)组成，并可包含除基因编码的20种氨基酸以外的氨基酸。可以通过天然过程(例如翻译后加工)或者本领域熟知的化学修饰技术修饰C35多肽。在基础教科书中详尽的专题论文及长篇研究文献中详细阐述了上述修饰。可以在C35多肽的任何位点进行修饰，包括肽主链、氨基酸側链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度位于给定C35多肽的数个位点。此外，给定的C35多肽可包含多种修饰。C35多肽可以是分枝的，例如通过泛素化引起的，也可是环状、有或没有分枝。可利用翻译后天然过程或合成方法产生环状、分枝以及分枝的环状C35多肽。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂类或脂类衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y—羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、裤酸化、异戊二烯化、外消旋化、竭代化(selenoylation)、疏酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加，例如精氨酰化和泛素化。18(例如参见Proteins-StructureAndMolecularProperties,2ndEd-,T.E.Creighton,FreemanandCompany,NewYork(1993);PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,Ed.，AcademicPress,NewYork,pgs.1-12(1983);Seifter等人，淑A肠"cJ182:626-646(1990);Rattan等人，細腦ca"".鎖4《-M(1992).)〃SEQIDNO:1〃是指C35多核苷酸序列，而〃SEQIDNO:2〃是指C35多肽序列。"具有生物学活性〃的C35多肽是指在有或没有剂量依赖性的情况下，按照特定生物学方法测定，具有与C35多肽(包括成熟形式)的活性相似而不一定相同的活性的多肽。在有剂量依赖性的情况下，不必与C35多肽相同，而是与C35多肽相比，基本上类似于剂量依赖性的给定活性(即，候选多肽活性高于C35多肽活性、或不低于其活性的约25倍以上、优选不低于约十倍以上、最优选不低于约三倍以上。)C35多核苷酸和多肽最初利用衍生自同一原发和浸润乳腺导管内癌病人的胂瘤和正常乳腺上皮细胞系中的poly-ARNA消减杂交分离348bpC35片段。Band,V爭人，C朋cerWes.50:7351-7357(1990)。根据该序列及其重叠的EST序列(登入号W57569)设计引物，从BT-20乳腺肿瘤细胞系(ATCCHTB-19)扩增和克隆包括全长C35编码序列的cDNA。该C35cDNA包含SEQIDN0:1所示的全部编码区。除348bp编码序列之外，C35克隆还包括167bp3'非翻译区。开放阅读框架开始于N端1位核苷酸的甲硫氨酸，终止于348位核苷酸的终止密码子(图l)。包含全部或大部分SEQIDN0:l序列的典型克隆于2000年8月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(〃ATCC〃)，ATCC保藏号为PTA-2310。ATCC位于10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,USA。按照国际承认的以专利程序为目的进行微生物保藏的布达佩斯条约条款，在ATCC进行保藏。因此，SEQIDN0:1和翻译的SEQIDN0:2十分精确，适用于本领域熟知的以及下文进一步描述的各种用途。例如，SEQIDNO:l可用于设计核酸杂交探针，以检测SEQIDNO:l所示核酸序列或者保藏克隆包含的cDNA。这些探针也可与生物样品中的核酸分子杂交，从而建立本发明的各种法医学及诊断方法。类似地，SEQIDNO:2确定的多肽可用来产生特异性结合C35的抗体，或者与细胞表面MHC分子结合刺激对C35衍生肽具有特异性的T细胞。然而，通过测序反应获得的DNA序列可能含有测序错误。所得DNA序列的错误包括核苷酸识别错误、或者核苷酸插入或缺失。错误插入或缺失的核苷酸会引起所预测的氨基酸序列的阅读框架发生移码。这种情况下，即使获得的DNA序列与实际的DNA序列的同一性大于99.9%(例如1000个碱基以上的开放阅读框架中，插入或缺失l个碱基)，所预测的氨基酸序列也不同于实际的氨基酸序列。因此，对于要求精确的核苷酸序列或氨基酸序列的应用，本发明不仅提供SEQIDNO:l所示得到的核苷酸序列和SEQIDNO:2所示预测的翻译的氨基酸序列。根据已知方法，将保藏的克隆测序，很容易确定保藏的C35克隆的核苷酸序列。因而能从上述保藏物证实预测的C35氨基酸序列。此外，还可以通过肽测序，或者在包含保藏的人C35cDNA的适当宿主细胞中表达蛋白质、收集该蛋白质并确定其序列，以直接确定保藏克隆编码的蛋白质的氨基酸序列。本发明还涉及对应于SEQIDNO:l或者保藏克隆的C35基因。可以按照已知方法，利用此处公开的序列信息分离C35基因。上述方法包括根据公开序列制备探针或引物，以及从合适来源的基因组物质中筌定或扩增C35基因。本发明还提供了C35的物种同系物。可以根据此处提供序列制备合适的探针或引物，并于合适的核酸源中筛选目的同系物，由此分离和鉴定物种同系物。〃C35多肽〃是指此处描述的所有形式的C35蛋白质和多肽。可以采用任何适当的方式制备C35多肽。这些多肽包括分离的天然多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽或者综合使用这些方法制备的多肽。制备这些多肽的方法本领域众所周知。C35多肽可能是膜蛋白质或分泌蛋白质形式(包括成熟形式)，或者可能是大蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分(参见下文)。包括附加的氨基酸序列通常是有利的，其中包含分泌或前导序列、前-序列、有助纯化的序列(例如多个组氨酸残基)或者为了重组制备期间稳定性的附加序列。C35多肽优选地以分离形式提供，并优选地以基本上纯化的形式提供。可以利用Smith和Johnson,6fe/e67:31-40(1988)所述一步法基本纯化重组制备的C35多肽(包括分泌多肽)。还可以利用本发明的针对C35蛋白质的抗体，按照本领域所熟知的方法，从天然或重组来源中纯化C35多肽。多核苷酸和多肽变体〃变体〃是指与C35多核苷酸或多肽不同、但保持其基本特征的多核苷酸或多肽。一般来说，变体与C35多核苷酸或多肽总体非常类似、并且很多区域相同。具有与本发明的参考核苷酸序列例如至少95%〃同一性〃的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了该多核苷酸序列可以在编码C35多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括至多5个突变点以外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5%的核苷酸可被删除或用其它核苷酸置换，或者参考序列中可能插入至多参考序列总核苷酸数5%的若干核苷酸。查询序列可能是SEQIDN0:1所示全部序列、ORF(开放阅读框架)或者此处所述的任何指定片段。实际上，任何特定的核酸分子或者多肽，都可以利用已知的计算机程序，按常规确定其是否与本发明的核苷酸序列具有至少90%、95%、2196%、97%、98%或99%的同一性。可以利用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)算法的FASTDB计算机程序，确定用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间最佳总体匹配的优选方法，也称为整体序列比对。在序列比对中，查询和目标序列都是DNA序列。将U变为T可以比较RNA序列。所述整体序列比对的结果表示为同一性百分比。在DNA序列的FASTDB比对中，计算同一性百分比所用的优选参数是矩阵=一元的、k-t叩le二4、错配罚分=1、连接罚分=30、随机组长度=0、分值阈值(CutoffScore)=l、空位罚分=5、空位大小罚分O.05、窗口大小=500或者目标核苷酸序列的长度(采用其中较短者)。如果由于5，或3，缺失而不是由于内部缺失，使目标序列短于查询序列，必须对结果进行手工修正。这是因为在计算同一性百分比时，FASTDB程序不解释5'和3'端截短的目标序列。对于5'或3'末端截短的目标序列，通过计算目标序列5，和3，不匹配/比对的查询序列碱基数目占查询序列碱基总数的百分比，校正其相对于查询序列的同一性百分比。通过FASTDB序列比对结果确定核苷酸是否匹配/比对。然后从利用以上FASTDB程序按指定参数计算的同一性百分比中减去该百分比，得到最后的同一性百分比分值。该校正的分值用于本发明。为了手工调整同一性百分比分值，只计算通过FASTDB比对显示的位于目标序列5，和3，以外、与查询序列不匹配/比对的碱基。例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列比对，以确定同一性百分比。目标序列5，存在缺失，因此FASTDB比对不显示5，端前10个碱基的匹配/比对。该10个未配对碱基代表序列的10%(不匹配的5，和3'端碱基数/查询序列的碱基总数)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比分值中减去10%。如果其余的90个碱基完全匹配，最后的同一性百分比应是90%。另一个例子，90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列相比较。这次缺失是内部缺失，所以目标序列的5'或3'没有与查询序列不匹配/比对的碱基。在这种情况下，对FASTDB计算的同一性百分比不进行手工校正。再一次，只手工校正与查询序列不匹配/比对的目标序列的5，和3，碱基。不为本发明做其它的手工校正。具有与本发明的查询氨基酸序列例如至少95%〃同一性〃的氨基酸序列的多肽，是指除该目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每ioo个氨基酸中包括至多5个氨基酸改变以外，该目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换言之，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽，目标序列中至多5%的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸置换。参考序列的改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基端或羧基端或者该末端之间的任何位置，分别散布于参考序列的残基之中或者在参考序列内分布成一个或多个连续组。实际上，任何特定的多肽，都可以利用已知的计算机程序，按常规确定其是否与例如SEQIDNO:2所示氨基酸序列或者由保藏的DNA克隆编码的氨基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。可以利用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6:237-245(1990〕算法的FASTDB计算机程序，确定用于确定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间最佳总体匹配的优选方法，也称为整体序列比对。在序列比对中，查询序列和目标序列都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果表示为同一性百分比。用于FASTDB氨基酸比对的优选参数是矩阵二PAMO、k-t叩le二2、错配罚分=1、连接罚分=20、随机组长度=0、分值阈值=1、窗口大小=序列长度、空位罚分=5、空位大小罚分=0.05、窗口大小=500或者目标氨基酸序列的长度(采用其中较短者)。如果由于N-或C-端缺失而不是内部缺失，使目标序列短于查询序列，必须对结果进行手工修正。这是因为在计算整体同一性百分比时，FASTDB程序不考虑目标序列的N-和C-端截短。对于N-或C-端截短的目标序列，通过计算目标序列N-和C-端与对应目标残基不匹配/比对的查询序列残基数目占查询序列碱基总数的百分比，校正其相对于查询序列的同一性百分比。通过FASTDB序列比对结果确定残基是否匹配/比对。然后从利用以上FASTDB程序按指定参数计算的同一性百分比中減去该百分比，得到最后的同一性百分比分值。该最后的同一性百分比分值用于本发明。为了手工调整同一性百分比分值，只考虑目标序列N-和C-末端与查询序列不匹配/比对的残基。即，只查询目标序列最N-和C-末端残基以外位置的残基。例如，将90个氨基酸残基的目标序列与100个氨基酸残基的查询序列比对，以确定同一性百分比。目标序列的N-端发生缺失，因此FASTDB比对不显示N-端前10个残J^的匹配/比对。该10个未配对残基代表序列的10%(不匹配的N和C-端残基数/查询序列的残基总数)，所以从FASTDB程序计算的同一性百分比分值中减去10%。如果其余的90个残基完全匹配，最后的同一性百分比应是90%。另一个例子，90个残基的目标序列与100个残基的查询序列相比较。这次缺失是内部缺失，所以目标序列的N-或C端没有与查询序列不匹配/比对的残基。在这种情况下，不对FASTDB计算的同一性百分比进行手工校正。再次重申，只手工校正FASTDB比对中显示的与查询序列不匹配/比对的目标序列N-和C端以外位置的残基。不为本发明^故其它的手工校正。C35变体的编码区、非编码区或两者都可以包含改变。特别优选的是包含产生沉默置换、添加或缺失的改变，而不改变编码多肽性质或活性的多核苷酸变体。优选由遗传密码简并性所致沉默置换产生的核苷酸变体。此外，还优选其中5-10、卜5或l-2氨基酸以任何组合置换、缺失或添加的变体。可因各种理由制备C35多核苷酸变体，例如为了优化特定宿主表达的密码子(将人mRNA密码子改为细菌宿主如E.coli偏性密码子)。天然存在的C35变体称为〃等位基因变体〃，是指占据生物体染色体给定基因座的基因的几个不同形式之一(GenesII，Lewin，B.，ed.,JohnWiley&Sons,NewYork(79《5人人等位基因变体也能以〃串联等位基因〃的形式存在，是存在于生物体染色体不同基因座的高度同源序列。这些等位基因变体可以在多核香酸和/或多肽水平上不同。另外，利用诱变技术或直接合成，可制备非天然产生的变体。利用已知的蛋白质工禾呈和重组DNA技术方法，可能产生C35多肽特性提高或改变的变体。例如，可以将分泌蛋白质N-端或C-端的一个或多个氨基酸缺失，而基本上不损失生物学功能。yo/7爭入，/.&0丄C力e迈.24(7^^;报告了甚至在缺失氨基端3、8或27个氨基酸残基后仍具有肝素结合活性的KGF蛋白质变体。类似地，缺失羧基端8-10氨基酸残基后，Y干扰素显示高达10倍的活性(Dobeli等，此外，充分证据表明变体通常保持与天然蛋白质类似的生物学活性。例如，Gayle及合作者(/:Wo丄历'e历》^Vi^^5"-^777(7卯3"对人细胞因子IL-la进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变产生了3，500个以上独立的IL-la变体，每个变体分子全长中平均有2.5个氨基酸改变。在每个可能的氨基酸位置检测出多个突变。研究者发现〃可以改变分子的大部分，而对其结合或生物学活性没有影响〃(参见摘要)。事实上，在检测的超过3，500个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列，产生了活性显著不同于野生型的蛋白质。此外，即使多肽N-端或C-端的一个或多个氨基酸缺失引起一种或多种生物学功能的改变或丧失，仍然可以保留其它的生物学活性。例如，从N-端或C-端除去分泌形式的少数残基时，缺失变体诱导和/或结合识别分泌形式抗体的能力可被保留。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少蛋白质N-或C-端残基的特定多肽是否保留上述免疫原性活性。因此，本发明进一步包括显示基本生物学活性的C35多肽变体。该变体包括根据本领域已知的一般规则选择的不影响活性的缺失、插入、倒位、重复和置换。例如，BowieJ.U.等人，Science247:1306-1310(1990)提供了有关制备表型沉默的氨基酸置换的指南，其中作者指出研究预改变的氨基酸序列耐受性有两种主要的策略。第一种策略利用进化过程中的自然选择产生氨基酸置换的耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可以鉴定保守的氨基酸。这些保守的氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相反，通过自然选择而耐受的置换的氨基酸位点，表明其对于蛋白质功能不重要。因此，可以修饰耐受的氨基酸置换的位点，而仍然保持该蛋白质的生物学活性。第二种策略利用基因工程在克隆的基因的特定位点引入氨基酸改变，以鉴定对于蛋白质功能重要的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine—scanningmutagenesis)(在分子中的每个残基引入单个丙氨酸突变)。(CunninghamandWells,5"cie/ce24々7。《7-7^"5(1989).)然后测试产生的突变分子的生物学活性。如作者所述，这两种策略揭示了蛋白质非常耐受氨基酸置换。作者进一步指出蛋白质某些氨基酸位点的氨基酸改变很可能是容许的。例如，最隐蔽(蛋白质三级结构内部)的氨基酸残基需要非极性側链，而一般很少保留表面側链的特征。此外，耐受的保守氨基酸包括脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的置换；羟基残基Ser和Thr的置换；酸性残基Asp和Glu的置换；酰胺残基Asn和Gln的置换，碱性残基Lys、Arg和His的置换；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的置换，以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的置换。除了保守氨基酸置换，C35的变体还包括(i)用一个或多个非保守氨基酸残基置换，其中被置换的氨基酸残基可能是或不是由遗传密码编码的，或者(ii)用一个或多个具有取代基团的氨基酸残基置换，或者(iii)成熟多肽与另一化合物的融合，例如增强多肽稳定性和/或可溶性的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)多肽与另外的氨基酸的融合，例如IgGFc融合区肽、或前导或分泌序列、或便于纯化的序列。可以认为本领域技术人员根据此处教导可以理解该多肽变体。例如，包含氨基酸置换(用其它带电荷的或中性的氨基酸置换带电荷的氨基酸)的C35多肽变体，可以制备具有较好特性的蛋白质，例如较少聚集的蛋白质。药物制剂聚集因聚集物的免疫原性活性而使活性减低、清除率提高。(Pinckard爭人，df早/顶迈,丄2:331-340(1967);Robbins爭乂，Z^aA"es1.838-845(1987);Cleland爭人，Cr化b.7^era/e""c"zt/《Car,ier10:307-377(1993).)多核苷酸和多肽片段本发明中〃多核苷酸片段〃是指具有保藏的克隆所含的或SEQIDN0:1所示的核酸序列的短的多核苷酸。该短核苷酸片段长度优选至少约15nt、再优选至少约20nt、更优选至少约30nt、最优选至少约40nt。例如"至少20nt长"的片段是指包括保藏克隆所含cDNA序列或者SEQIDN0:1所示核苷酸序列中20个或更多连续的碱基。这些核苷酸片段用作此处所述的诊断探针和引物。当然优选大片段(例如至少50、100、150、200、250、300个核苷酸)。此外，C35多核苷酸片段的典型例子包括，例如具有SEQIDN0:1或者保藏的克隆所含cDNA中大约核苷酸编号为1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300或301到终点的序列的片段。其中〃大约〃包括所述的特定范围，可以在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1)核苷酸。优选地，这些片段编码具有生物学活性的多肽。更优选地，这些多核苷酸可以用作此处所述的探针或引物。本发明中〃多肽片段〃是指SEQIDN0:2所示或保藏克隆所含cDNA所编码的短氨基酸序列。蛋白质片段可能是〃独立的〃或包含在大的多肽内，形成其部分或区域，最优选地作为单个连续区域。本发明多肽片段的典型例子包括，例如大约氨基酸编号为1-20、21-40、41-60、61-80、81-100或101到编码区终点的片段。此外，多肽片段长度可以为9、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。其中〃大约〃包括所述的特定范围，可以在一端或两端多或少几个(5、4、3、2或1)氨基酸。优选多肽片段包括分泌的C35蛋白质及其成熟形式。更优选片段包括氨基或羧基末端或两者都有一系列连续缺失的残基的分泌的C35蛋白质或成熟形式。如上所述，即使蛋白质N-端的一个或多个氨基酸缺失引起该蛋白质的一种或多种生物学功能改变或丧失，仍然可以保留其它的生物学活性。因此，从N-端除去完全或成熟多肽的少数残基时，短的C35突变蛋白质通常可保留诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少完整多肽N端残基的特定多肽是否保留上述免疫学活性。N端氨基酸残基大量缺失的C35突变蛋白质并非不太可能保留某些生物学或免疫原性活性。实际上，仅由9个氨基酸残基组成的肽通常可能诱发免疫应答。因此，本发明还提供在SEQIDNO:2所示C35氨基酸序列的氨基端缺失一个或多个残基、直至位点编号105的苏氨酸残基的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。还如上所述，即使蛋白质C-端的一个或多个氨基酸缺失引起该蛋白质的一种或多种生物学功能改变或丧失，仍然可以保留其它的生物学活性。因此，从C-端除去完全或成熟多肽的少数残基时，短的C35突变蛋白质通常可保留诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力。利用此处所述及本领域已知的常规方法，很容易确定缺少完整多肽C端残基的特定多肽是否保留上述免疫学活性。C端氨基酸残基大量缺失的C35突变蛋白质并非不太可能保留某些生物学或免疫原性活性。因此，本发明还提供在SEQIDNO:2所示C35羧基酸序列的羧基端缺失一个或多个残基、直至位点编号10的缬氨酸残基的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。此外，本发明还提供在氨基和羧基端都缺失一个或多个氨基酸的多肽。优选实施方案中，本发明涉及具有SEQIDN0:2的残基S-9到V-17;V-10至!]V-17;E-16到V-23;E-16到R-24;E-16到I-25;S-21到F—35;C30至!)T一38;E—31至l)Y—39;E—36至寸A—43sA—37多jA—45;A—37至寸V-46;Y-39到V-46;S-44到l-53;A-45到l-53;G-52到L-59;E-54到T一62;S—57多jF-75;R—58至!]l一67;G—61多jl一69;G—63多F—83;E—66至寸L一73;E—66至!]V—74;F—83至寸E103;D—88多』A—96;L—89多jA—96;A—92至!]T-101;R-95到L-102;A-96到K-104;K-104到V-113;1-105到V-113;l-105到l-114的多肽以及编码该多肽的多核苷酸。可以通过序列数据库公开地获得和利用很多的多核苷酸序列，例如EST序列。在EST数据库的BLAST检索中，鉴定了下述人EST序列。这些序列被认为是所述GenBank登录号鉴定的cDNA插入片段的部分序列。在所述的28:US:ONaiMs)哪，IV:(9S，ai8渭6H:(SS:ONCO03S):(M:ON0103S)SSS^:(SS:ONCI(SS:ONai鹏Z96IKHV:(IS:ONqi鹏ZSS89SVV:(OS:ONa工的s)柳弧IV:(6t:0Nai03S)SSS9SSIV:(8t:0NaiMS)M0Z6丄(Zt:ONGI鹏S9SS6H-'(外..ON(3103S)Z6S0S曙(W:ON(II03S)9腦ZSVV，0NGI616柳W:(St:ONaiW9S80IV:附ONai鹏6Z"IH:(IWONai8S9匿VV:(Ot:ONai鹏:(6S:0Nai03S)(8S:0Nai6nSZSVV:(ZS:O腿03S)SSS，(9S:0N(II鹏S69翻(SS:O腿0I6ISN:(M:ONai鹏^SI，(SS:ONGI鹏附SI8VV:(M:ONai鹏UOZSSVV:(IS:ONai:(OS:ONa工加s)SZS固(62:ONai的s)ZS6t8丄(8Z:0Nai&3S)ISIZS丛(ZS:ONdlG3S)96S，SNai鹏册SM:(SrONai鹏9HH:(M:ONai。3S)SS096H:(SS:ON(IIm9譜V:欲ONai2S9606IV:(IS:ONai&3S)SM90t丛V:(OZ:ONai03S)SZ090t丛V:(6I:0NaiOSt"S丛V:(8T，GI03S)獄SS6VV:Ul:ONai03S)MS9SH:(9I.'0Nai03S)8S096H，GISS8柳(，1:0N(H弧ZSOVV:(SICO:(SI:ONai。3S)680弧VV:(II:ONai:(01:ONai03S)ISSMH:(6:O謹鹏8S9U6VV:(8:0Nai63S)8f2^tN:(Z:ONai。3S)SS^ZSii:(9:ONai03S)06SS9丛:(S:ONaiS9Z88SIV:(，ON(II的S):(S:ON(IIZS8IZ6VV:备吝吾^uBgu9f)'《阜l:0Nai03S^《f《土'畔降°鴻53+—^哥》妙葉祖^紫智K^W射睹r血'+^铧谅^、〖'耳黎宗梦^￥聘哥3^+每+—錄'蜂咏。莉酱玄"2接5a争货(吉瓣)lhl蕃W哥畜睹Wfi纟努'+07丄SV18。^争菩臬^H^事^^效53fel》《^囟茶辨哥3'丁攻味。嘲土萄'凍^^(S)哥夸^效53fel》^^+纽芽W鲁别^。豫fOH)+每^够￥紫褂"￥^,,^^〃'扭紫镩凍^、〖'Y3釉事^梦系铧￥(3)哥茶睹。M^紫feifi吝》贵阜茶'+事辨^紫铧豫^uBau"AA707623(SEQIDNO:58);AI051009(SEQIDNO:59);AA026774(SEQIDNO:60);W51792(SEQIDN0:61);A1362693(SEQIDN0:62);AA911823(SEQIDN0:63);H96422(SEQIDN0:64);A1800991(SEQIDN0:65);A1525314(SEQIDN0:66);A1934846(SEQIDN0:67);A1937133(SEQIDNO:68);AW006797(SEQIDNO:69);A1914716(SEQIDN0:70);A1672936(SEQIDN0:71);W61294(SEQIDN0:72);A1199227(SEQIDN0:73);A1499727(SEQIDN0:74);R32154(SEQIDN0:75);A1439771(SEQIDN0:76);AA872671(SEQIDN0:77);AA502178(SEQIDN0:78);N26715(SEQIDN0:79);AA704668(SEQIDNO:80);R68799(SEQIDN0:81);H56704(SEQIDN0:82);A1360416(SEQIDN0:83).因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含此处所述多核苷酸片段以及全长多核苷酸(例如编码区域)、而不包括一种或多种上述EST的多核苷酸。还优选以结构域或功能域为特征的C35多肽和多核苷酸片段。本发明的优选实施方案包括含有MHC结合表位和异戊二烯化位点的片段。其它优选片段为生物学活性的C35片段。生物学活性片段应具有与C35多肽的活性类似而不一定相同的活性的片段。片段的生物学活性可以包括提高的需要的活性，或降低的不合需要的活性。表位&抗体由内源合成的蛋白质降解产生的细胞肽，被移位到前高尔基小室，在此与I类MHC分子结合，以转运到细胞表面。这些I类MHC:肽复合物是特异性CD8+细胞毒性T细胞的靶抗原。因为所有内源性蛋白质都〃转变〃，来源于任何胞质或核蛋白的肽可能结合MHC分子并转运，以呈递于细胞表面。这使T细胞比抗体针对的细胞蛋白质群体更大，抗体只局限于识别那些分泌的或整合于细胞膜的蛋白质的构象决定簇。T细胞受体的抗原结合位点与肽以及周围MHC的决定簇相互作用。因此必须按照30MHC:肽复合物来确定T细胞的特异性。肽结合MHC分子的特异性很广，与特异性抗体的抗原结合位点相比，其亲和力相对较低。结合I类分子的肽一般长为8-IO个残基，并在某些关键位点容忍有限多样性的、可以匹配MHC肽结合位点的口袋的氨基酸侧链。与特，C分子结合的肽的这些主要特征，构成肽结合基序。已经描述了许多计算机算法，来鉴定大蛋白质中符合特异性MHCI类或MHCII类分子的肽结合基序要求的肽。由于MHC分子的广泛多态性，不同的肽常常结合不同的MHC分子。表l-3列出了利用三种不同算法预测的MHC结合肽。特别地，利用在SYFPEITHI网站(wysiwyg:〃35/http:〃134.2.96.221/scriptslhlaserver.dll/EpPrediet,htm)发现的规贝ll,并根据Raminensee，H.G.，Bachmann，J.和Steva丽ic，S.(Chapman&Hall,NewYork1997)的著作〃跳LigandsandP印tideMotifs〃预测的C35HLAI类和II类表位，列于表1和5。利用网上得到的NIHBIMAS程序(http:〃bi迈as.dcrt.nih.gov/cgi_bin/molbio/ken_pa:rke:r_coinboform)预测的来源于C35序歹'J的MHC结合肽，列于表2。最后，表3和6所列为利用T印itope程序(该程序用于预测可与多个不同的MHCII类分子结合的肽)预测的C35肽。利用T印itope，确定出四种C35肽为结合各种HLAII类分子的可能候选者。通常这些肽比结合HLAI类的肽长，在结合多种HLAII类分子方面更为筒并。表lSYFPEITIH网站预测的C35肽(分值反映连接强度)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>37ATYLELASA1997SNGETLEKI1.8105ITNSRPPCV182SGEPGQTSV1745AVKEQYPGI1738TYLELASAV1661GTGAFEIEI1685YEKDLIEAI1665FE.IEINGQL15107NSRPPCVIL1541ELASAVKEQ1458RLGGTGAFE1459LGGTGAFEI1466EIEINGQLV1468eing'qlvfs1481ggfpyekdl1494rrasngetl14HLA-A*0201十聚体(decamers)位置分值123456789058rlggtgafei2296asngetleki19104k:itnsrppcv1937atylelasav1817vepgsgvriv1733cgfeatylel1644savkeqypgi1692airrasnget1639ylelasavke1553IEIESRLGGT1565FEIBINGQLV15105ITNSRPPCVI151MSGEPGQTSV1463GAFEIEINGQ1468EINGQLVFSK1469INGQLVFSKL1483FPYEKDLIEA1488DLIEAIRRAS1493IRRASNGETL1472QLVFSKLENG1389LIEAIRRASN138TSVAPPPBEV1216EVEPGSGVRI123450YPGIEIESRL1260GGTGAFBIEI1281GGFPYEKDLI12106TNSRPPCVIL12HLA-A*0203九聚体位置分值_123456789_35FEATYLELA12HLA-A*0203十聚体位置分值_123456789036EATYLELASA18位置分值_12345678977KLENGGFPY292SGEPGQTSV1821SGVRIVVEY1816EVEPGSGVR1729YCEPCGFEA1742一—一———一LAS—AVlC豆Q—一1731EPCGFEATY1634GFEATYLEL1639YLELASAVK14■84PYEKDLIEA1466EIEINGQLV1313PPEEVEPGS1246VKBQYPGIE1252GIEIESRLG1296ASNGBTLEK1236HLA-A1十聚体位置分值123456789020GSGVRIVVEY2029YCEPCGFEAT1976SKLENGGFPY182SGEPGQTSVA1752GIEIESRLGG1766EIEINGQLVF1741ELASAVKEQY1646VKEQYPGIEI1616EVEPGSGVRI1530CEPCGFEATY1539YLELASAVKE1577KLENGGFPYE1486EKDLIEAIRR1498NGETLEKITN1434GFEATYLELA1264AFEIEINGQL12101TLEKITNSRP12HLA-A26九聚体位置分值12345678968BINGQLVFS24100ETLEKITNS2488DLIEAIRRA2354EIESRLGGT2241ELASAVKEQ2145AVKEQYPGI2031EPCGFEATY1934GFEATYLEL193873tLVFSKLENG1916EVEPGSGVR1877KLENGGFPY'1866EIEINGQLV1721SGVRIVVBY1637ATYLELASA1624RIVVEYCEP159SVAPPPEEV1422GVRIVVEYC1451PGIEIESRL1470NGQLVFSKL1457SRLGGTGAF1365FEIEINGQL1325IVVEYCEPC1248YPGIEIE1267IEINGQLVF1275FSKLENGGF1281GGFPYEKDL12104KITNSRPPC12105ITNSRPPCV12HLA-A26十聚体位置分值123456789041ELASAVKEQY2766EIEINGQLVF2668EINGQLVFSK2326VVEYCEPCGF2116EVEPGSGVRI2088DLIEAIRRAS19100ETLEKITNSR1974VFSKLENGGF1833CGFEATYLEL1754EIESRLGGTG1756ESRLGGTG'AF1720GSGVRIVVEY1631EPCGFEATYL1664AFEIEINGQL1569INGQLVFSKL1561GTGAFEIEIN1473LVFSKLENGG149SVAPPPBEVE1325IVVEYCEPCG1345AVKEQYPGIE1372QLVFSKXENG1377KLENGGFPYE1379ENGGFPYEKD134BPGQTSVAPP127QTSVAPPPEE1230CEPCGFEATY1236EATYLELASA1237ATYLELASAV1276SKLENGGFPY1289LIEAIRRASN12HLA-A3九聚体位置分值_-12345678939YLELASAVK2877KLENGGFPY254216EVBPGSGVR2458RLGGTGAFE2267IBINGQLVF1996ASNGETLEK1892AIRRASNGE179.SVAPPPEEV16101TLEKITNSR1622GVRIVVEYC1531EPCGFEATY1545AVKEQYPGI1572QLVFSKLEN1521SGVRIVVEY1468EINGQLVFS1469INGQLVFSK1488DLIEAIRRA1491EAIRRASNG1425IVVEYCEPC1337ATYLELASA1355IESRLGGTG1357SRLGGTGAF1379ENGGFPYEK1387KDLIEAIRR13104KITNSRPPC1324RIVVEYCEP1242LASAVKEQY1266EIEINGQLV1289LIEAIRRAS1290IEAIRRASN124494RRASNGETL12HLA-A3十聚体位置分值123456789068EINGQLVFSK2216EVEPGSGVRI2038TYLELASAVK2041ELASAVKEQY2066EIEINGQLVF209SVAPPPEEVE1958RLGGT^AFEI1939YLELASAVKE1892AIRRASNGET1895RASNGETLEK1845AVKEQYPGIE1754EIESRXGGTG1688DLIEAIRRAS1689LIEAIRRASN1626VVBYCEPCGF1537ATYLELASAV1522GVR1VVBYCE1477KLBNGGFPYE1493IRRASNGETL1425IVVEYCEPCG1330CEPCGFEATY1352GIEIESRLGG1376SKXENGGFPY1378LENGGFPYEK13101TLEKITNSRP13<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>32PCGFEATYL1283FPYEKDLIE12106TNSRPPCVI12HIA-B*0702十聚体位置分值123456789031EPCGFEATYL2450YPGIEIESRL2118EPGSGVRIVV2083FPYEKDLIEA164EPGQTSVAPP1511APPPEEVEPG1593IRRASNGETL14106TNSRPPCVIL1469INGQLVFSKL1333CGFEATYLEL1264AFEIEINGQL12HLA-B*08八聚体(oct匿rs)位置分值1234567883FPYEKDLI25.66EIEINGQL1652GIEIESRL1518EPGSGVRI1454EIESRLGG1491EAIRRASN1495RASNGETL14100ETLEKITN1433CGFEATYL1245AVKEQYPG1258RLGGTGAF1268EINGQLVF1271GQLVFSKL1275FSKLENGG1282GFPYEKDL12107NSRPPCVI12108SRPPCVIL12HLA-B*08九聚体'位置分值12345678975FSKLENGGF1983FPYEKDLIE1945AVKEQYPGI1885YEKDLIEAI18107NSRPPCVIL17<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>94RRASNGETL13HIA-B*2705九聚体位置分值12345678957SRLGGTGAF2694RRASNGETL2567IEINGQLVF1987KDLIEAIRR1951PGIEIESRL1781GGFPYEKDL1765FEIEINGQL1669INGQLVFSK1696ASNGETLEK1616EVEPGSGVR1534GFEATYLEL1550YPGIEIESR1570NGQLVFSKL15101TLEKITNSR1523VRIVVEYCE1432PCGFEATYL1439YLELASAVK1479ENGGFPYEK1493IRRASNGET1421SGVRIVVEY1327VEYCEPCGF1375FSKXENGG1386EKDLIEAIR13107NSRPPCVIL1317VEPGSGVRI12页31EPCGFEATY1277KLENGGFPY12HIA-B*2709九聚体位置分值_123456789_94RRASNGETL2557SRLGGTGAF2081GGFPYEKDL1634GFEATYLEL1451PGIEIESRL1365FBIEINGQL1323VRIVVEYCE12107NSRPPCVIL12<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>PPEEVEPGS1338TYLELASAV1345AVKEQYPGI1363GAFEIEING1394RRASNGETL1312PPPEEVEPG1233CGFEATYLE1250YPGIEIESR1266EIEINGQLV1285YEKDLIEAI1295RASNGETLE12105ITNSRPPCV12HLA-B*5101八聚体位置分值1234567883FPYEKDLI2595RASNGETL2310VAPPPEEV2118EPGSGVRI2133CGFEATYL2198NGETLEKI1919PGSGVRIV1860GGTGAFEI1862TGAFEIEI1863GAFBIEIN1471GQLVFSKL1448EQYPGIEI1367IEINGQLV1357106TNSRPPCV12II类MHCHLA-DRBP0101十五聚体(15-mers)位置分值12345678.90123472QLVFSKLENGGFPYE2937ATYLELASAVKEQYP2626VVEYCEPCGFEATYL2563GAFEIEINGQLVFSK2524RIVVEYCEPCGFEAT2436EATYLELASAVKEQY2439YLELASAVKEQYPGI2453IEIESRLGGTGAFEI2456ESRLGGTGAFEIEIN2414PEBVEPGSGVRIVVE235843ASAVKEQYPGIEIES2320GSGVRIVVEYCEPCG2062TGAFBIEINGQLVFS2032PCGFEATYLELASAV1947KEQYPGIEIESRLGG1964AFEIEINGQLVFSKL1982GFPYEKDLIEAIRRA1934GFEATYLELASAVKE1854EIESRLGGTGAFEIE1890IEAIRRASNGETLBK1899GETLEKITNSRPPCV1831EPCGFEATYLELASA1749QYPGIEIESRLGGTG1758RLGGTGAFEIEINGQn66BIEINGQLVFSKLEN1767IEINGQLVFSKLENG1768EINGQLVFSKLENGG1784PYEKDLIEAIRRASN1786EKDLIEAIRRASNGE1735FEATYLELASAVKEQ1674VFSKLENGGFPYEKD1687KDLIBAIRRASNGET1691EAIRRASNGETLEKI16IMSGEPGQTSVAPPPE154EPGQTSVAPPPEEVE15IIAPPPEEVEPGSGVRI1512PPPEEVEPGSGVRIV1529YCEPCGFEATYLELA15PGQTSVAPPPEEVEP146GQTSVAPPPEEVEPG1444SAVKEQYPGIEIESR1452GIEIESRLGGTGAFE1461GTGAFEIEINGQLVF1350YPGIEIESRLGGTGA12HLA-DRB1*0301(DR17)十五聚体位置分值1234567890123464AFEIEINGQLVFSKL2639YLELASAVKEQYPGI2572QLVFSKLENGGFPYE2362TGAFBIEINGQLVFS2224RIVVEYCEPCGFEAT1971GQLVFSKLENGGFPY1986EKDLIBAIRRASNGB197QTSVAPPPEEVEPGS1823VRIVVEYCEPCGFEA1850YPGIEIESRLGGTGA18卯IEAIRRASNGETLEK1820GSGVRIVVEYCEPCG1787KDLIEAIRRASNGET1799GETLEKITNSRPPCV162SEYCEPCGFEATYLEL1537ATYLELASAVKEQYP1448EQYPGIEIESRLGGT1478LENGGFPYEKDLIEA1414PEEVEPGSGVRIVVE1370NGQLVFSKLENGGFP136243ASAVKEQYPGIEIES1252GIEIESRLGGTGAFE1254EIBSRLGGTGAFEIE1274VFSKLENGGFPYEKD1282GFPYEKDLIEAIRRA12HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)十五聚体位置分值12345678901234536EATYLELASAVKEQY2862TGAFEIEINGQLVFS2886EKDLIEAIRRASNGE2687KDLIEAIRRASNGET26卯IEAIRRASNGETLEK2672QLVFSKXENGGFPYE2282GFPYEKDLIEAIRRA22<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>10VAPPPEEVEPGSGVR1212PPPEEVEPGSGVRIV1216EVEPGSGVRIVVEYC1229YCEPCGFEATYLELA1230CEPCGFEATYLELAS1231EPCGFEATYLELASA1234GFEATYLELASAVKE1235FEATYLELASAVKEQ1242LASAVKEQYPGIEIE1248YPGIEIESRLGGT1249QYPGIEIESRLGGTG1253IEIESRLGGTGAFEI1258RLGGTGAFEIEINGQ1259LGGTGAFEIEINGQL1261GTGAFEIEINGQLVF1263GAFEIEINGQLVFSK1267IEINGQLVFSKLENG1268EINGQLVFSKLENGG1269INGQLVFSKLENGGF1285YEKDLIEAIRRASNG1293IRRASNGETLEKITN1294RRASNGETLEKITNS1296ASNGETLEKITNSRP1297SNGETLEKITNSRPP1266表2HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型Al选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果_—......排位起始位点亚序列残基列表分值(包舍亚序列的分子估计的分解半衰期)77225.000216EVEPGSGVR329TfCEPCGFEA4—5一細439Y1jELRSAVK'36涵2SGEPGQTS"V2,250-6.26VVEiTCEPCG'796'ASNGETXEK8101o.卯o9891054EIESRLGGT1166ErEINGQLV0.900i52GIEIESRLG13'86E咖IEAIR0.5oo14420.500,153EPCGFEATYl669ji卿lvfsk:0.250173498NGETIiEKIT0.2251i961GTGRFEIEI"is1io790.100响应的用户肽序列(长度=115个残基)67HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A—0201选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20......................-----■-------'----------------:记分结果..........……-..........排位4起始位点58104S3"5"37亚序列残基列表RLGGtGAFElKtTNsRPPCVMSGEpGQTSV50I卿IVFSKL1017VEPGsGVRIV分值(包含亚序列的分手估计的分解半衰期)25,506'4.5023.1733-1(3524RIVVeYCEPC〗1353IEIEsBXGGTi4TSVApPPEEV1"i■44jSAVKeQYPGIi仏217!16i211.SGVRiWEYC■i0.201117i55I￡SEUGGTGAi"jSONGG印YEKDL■.L——■i19.i811|20i105ITNSrPPCVT;1:...0.101响应的用户肽序列(长度=115个残基)93万270HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A24选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果..—..............................排位起始位点i序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期)i34G『￡ATYLEL33涵249370NG.QIiVFSKLli.0843858281GGFPYE咖，7io7NSRPPCVIL;,800875FSKLENGGF90分SNGETLEKIi.3io45AVKEQYPGIi.i(k)…u611，i!)'61259LGGTGAFEIl.l(K)1365t、EIEXNGQIj1.(^)81451PGIE工ESRL'l厕IS106TWSRPPCVI16o鹏17i94:RRASNGETL'oi6o18.28,ErcEPCGPE'涵u!1932—0.4002047KEQYPGIEI:0.330i响应的用户肽序列(长度二115个残基)73<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A3选择的记分亚序列长度10逸择的榆入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结莱排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期)68一'258RLGGtGAFEI2，i341l細14:780.810;95RASHgETLEK!6j20iGSGVrtWEYi"7ibo1ETI^klTWSR0.203■■〗261WEYCEPCGFi977iiq(561EIEr卿LVFi"24i。1KITHsRPPCV0.060j。37114381,j"183j1"1105!|ITMSrpPCVI1…..0,6.45ii"172■LQLVFSKL￡HG1.一.......0.045i"j30,|CEPCgFEATTj.....—■.6.03^i".|GVRIvVElfCE1_.......一0.02^j201i6JEVEPgSGVRI1"27响应的用户肽序列(长度二U5个残基)76HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A—1101选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位起始位点亚序列残基列表分值(包舍亚序列的分午估计的分解半衰期)139乂■*"一■…0.400269I—QLVFSK,316EVEPGSGVR__.■….....-—',,,,-----"4101TfEKITNSR'0,U8CJ5GlGTGATEIE.];'6:咖6.50YPGIEIESR7966涵887T7KLENGGFPYio79EHGGF&YEK,O-眼119SVAPPPEEV0.020■—^'a-——,"一———----——*1245AVKEQYPGI《0201337AT化ELASA1434GFEATYIjEL0.U1215105環SRPPCV1622GVRIWEYC;17J3S,o.(iS，—■-----■-----------!;------------------■-18:|82;GFPYEKbLI19129YCEPCGFEfl謂6■■■20j73LVFSKIENG响应的用户肽序列(长度=115个残基)77HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20逸择的HLA分子类型A—3101选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果.—......................................—............排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期).i16EVEPGSGVR350YPGIEIESR0,40039YLELASAVK0.200;6770,180j737ATYLELASA860I卿LVFSK0-0241945avkeqypg工0.026106111SVAPPPEEV0.020li24RIVVEYCEP13341473u;fskleng0.0121538TYIXLASAV0,01216105IT咖PPCV'177210.00818GFPYEKDIiI1o.ociS19i1041kitnsrppc1"06io1791ENGGFPYEK10.006响应的用户肽序列(长度=115个残基)78<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型A68.1选择的记分亚序列长度10逸择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结杲...—..................—，排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期)100ETIiEkITNSR300.0()02368EINGqLVFSK9.000415KEVEpGSGVRSi.000'5M'RASNgETLEK3細6852.25079SVAPpPEEVEs8GEKDLiEAIRRii73LiVFSkLENGGi，10251,200U105ITNSjcPPCVI123713780,960148TSVApPPEEV0.600522GVRIvVEYCE1618EPGSgVRlW0.600171MSGEpGQTSV!18381$49GYPGiEIESRa一50012045响应的用户肽序列(长度二115个残基)83<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>记分结果....______…■.-............<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>响应的用户肽序列(长度-115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B60选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>响应的用户版序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>响应的用户狀序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B—5102选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结泉排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期)iEPGSGVTUV81GGFPYEKDL'iio涵359LGGTGRPEI7052SGEPGQTSV'651783FPYEKDLIE8197SNGETLEKX6.600110j19PGSGVRIW4-840,111「106TNSRPPCVI4掘GTGAFEIEI4涵i13j82GF打EKDliI4.000EPCGFEATY3柳J15厂63GAFEIEINGJ"〖36■2.50017j501YPGIEIESR118J452,4^)119[9—:SVAPPPEEVi20.j105ITWSRPPCV,响应的用户肽序列(长度二115个残基)120HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而逸择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B—5103选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果............_...........排位起始位点亚序列残基列表分值(包舍亚序列的分午估计的分解半衰期)i44_no厕'281GGFPyEKDLI3ISEPGSgVBIW460GGTGaFElEl44.000336376.600731E卩CGfEATYL6，i50083FPYEkDL工EA.6,^0々80NGGFpYE咖'6扁1050YPGIeIESRL6.000U361221SGVEUVVEYCf4加132JSGEfgQTSVA141jMSGEpGQTSV2,420151658jRLG(StGAFEI2.4201796jASWGeTliEKI:2.200182，1916jEVEPgSGV^I2.20020105jITNSrPE"CVI:一2涵响应的用户肽序列(长度=115个残基)123HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而逸择的方法确切数字要求的结果数20逸择的HLA分子类型B—5801选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位起始位点亚序列残基列表分值(包含亚序列的分午估计的分解半衰期)1i7540涵-，4207NSRPPCV亿"加61GTGAFEIEIj遍":1053,000一i637ATYLELASA,711MSGEPGQTS■、8:67IEI卿LVF9156SSRLGGTGA0,60(J一10,210.54O1U」27VEYCEPCGF0.400GAFEIEING0.330'tooi4,950.30diI5■20GSGVRIVVEi).'240,16196ASNGETLEK:17144:1"!2;19!10VAPPPEEVE157;SRLGGTGAE*响应的用户肽序列(长度二115个残基)124HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型B—5801选择的记分亚序列长度10选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果—...—......______................排位起始位点亚序列残基列表分值(包舍亚序列的分午估计的分解半衰期)i56ESRI*gGTGAF23IMSGEpGQTSV41055373德'i696ASKGeTLEKI:7442.0008TSVApPPEEV974VFSK1EMGGF0:'10610,4^0'U26ti23(i0.360—395，4636,26^1583FPYEfcDLIEA16"290240.'!33CGFEaTYLEL43;ASAVkEQYPG750.2-00:207QTSVaPPPEE响应的用户肽序列(长度二115个残基)125<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>响应的用户肽序列(长度二115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20选择的HLA分子类型Cw—0301选择的记分亚序列长度10逸择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数106分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果...—.............................排位起始位点i序列残基S表分值(包舍亚序列的分午估计的分解半衰期)44fo細23345.065"3691NGQ1VFSKL4siGGFE"yElKDIjI^5.106iooo_629isoo7.16EVEE"gSGVRI8(55PCIEUlGQIiVi)31i.00064AFEIeINGQli2.000iu531.500ii2831」00i13761-5001w21SGVRiWEYC1.500115371.200iI6'.SONGGFpYEKDL1.20050'1.200iis9311923i扁j208TSVApPPEEV1.1.000响应的用户肽序列(长度二115个残基)127HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>响应的用户肽序列(长度=115个残基)HLA肽基序检索结果用户参数和记分信息为限制结果数而选择的方法确切数字要求的结果数20逸择的HLA分子类型Cw_0702选择的记分亚序列长度9选择的输入序列回复方式Y回复方式编号行用户输入的肽序列长度115计算的亚序列分值数107分值输出表中回报的最高分值亚序列数20记分结果排位起始位点亚序列残基列表'分值(包舍亚序列的分+估计的分解半衰期)l31EPCGFEATY24.000221SGVRIVVEY342477锡0492.咖'657SRLGGTGAF2.400718-EPGSGVRIV2'杨8942掘9S5YE咖IEAI1034GE"EATYLEL厂1.440U381TYXELASAV1.44012701HGQLVFSKLJ3j114811GGF打EKD3j1l.OOS—,1〗56*711.000iI6971SMGETliEKIr0.960176i1GTGAF"EIEI1——.—O.兆O118107jNSRPPCVJX0.^01220.800t120i"JFEATHjELAi0.^S5——:响应的用户肽序列(长度二115个残基)131<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表3HLA肽基序检索结果重要提示Tepitope设计为按Ala评价Cys残基，由于合成和分析的限制，不可能系统地测试包含Cys的肽。所以，只要预测序列包含Cys残基，我们建议您用Ala残基代替Cys进行合成。文件名称C35预测参数定量阈值[%]:3抑制阈值[变化倍数的对数]:抑制残基[数]:1drb1*0301DRB1*0701drb1*0801DRB"llOldrb1*1501drb5*01010--------30----SGVFUWEYCEPCGFSGVRIWEYCEPCGFSGVPJWEYCEPCGFSGVRIWErCEPCGFSGVRIWEYCEPCGFSGVRIWEYCEPCGF(包含一个抑制残基的85*0101的结合框架-ioo倍)定量分析，sgvriwetcepcgf，阈值(％)100908070605030201drb1*0101xkxxxkxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....drb"0102XXXXXXXXXXXXXXXXKXXXXKXXXXXXXXXXXK-...drb1*0301xkxxxxxxxxxxx3qoodc....................DRB1*0401XXXXXXJOOOOOOOOOODOODDOODOODODOODDODCXXDRB1*0402XX....................................DRB1*0404JOaOOOOOOOOCXXXXXXX....................DRB1*0405X3O0CXXXXXXXX3D000aacXXXXJOOC............drbi*cuiojooooaQaoaaaoDoooaaaoDOoooocxxx........xxjooaoooDoaoDOODaaoaDooooaaoQaQQOc-..■drb1*0701xxjdoooqocx............................DRB1*080LXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXKKXX............drb1*0802xxxxxx................................drb1*0804xxxxxxxxxxxxxx........................DRB1*080SXXXXXXXXXXXXXXXXX3OOQOO0OODQQCX........i5rb1*1101xxxxxxxjocc............................drb1*1104xxx30qdqock............................drb1*U06XXXXXXXXXX............................1107XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................t)幼"1305xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................DRB1*:L307X3OOOGQ0CXX............................XXXXXXXXXX............................D幼i+i321jQOQDQoaaaooaooooaacxxxxxxxxxxx........drb1*1501xxxxxxxxxx............................dhb1*1502xxxxxxxxxx............................DRB5*0iQlXXXKXJOQQDQDDODgQQQQOQCXXXXXXXX........文件名称C35预测参数定量阈值[%]:3抑制阈值[变化倍数的对数]:抑制残基[数]:1一lDRB1*0301DRB1*0401DRB"0701DRB1*1101---60-------—70----SRIjGGTGAFEIEI恥QLVFSRLGGTGAE"E工EINGQLVFSRLGGTGAFEIEINGQIjVfSRLGGTGAFEIEINGQIiVTSRliGGTGAFEIEINGQI^FSRLGGTGAFEIEINGQLVTSRLGGTGAFEIEINGQIiVF(包含一个抑制残基的B5的101的结合框架-IOO倍)定量分析，^LG^TG^FEIEINGQLVF，阈值(％)100908070504030201DRB1*0101DRB"0102DRB1*0301DRB"0402DRBl40421DRB"0701DRB"0804DRB1*0806DRB"llOlDKB"1107咖1*1311DRB"1321DRB5*0101XXXXXXXXXKXXXXXXXXXXXX................xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx................xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx...XX3CCXXXXXX............................xxxxxxxxxx............................XX....................................xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx....XXXXXXXXXXJQOQOaaQCKXXXXXXXXXXXXXXJODQOCXXXXXX.....4..........................xxxxxx................................XXXXXXXXXXXXKXXXXXXXXX................xxxxxxx3oaaQoooDaaaoQaoacxx............XXXXXXXXXXXXXKXXXXXXXXXXXX............XX....................................XXXXXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXX........XX....................................XXXXXXKXXXXXXXXXXXXXKXXXXX............XXKXXXXXXXXXXXXXXXXXXX..............,-xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................XXXXXXXXXKXXXXXXXX....................xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx........文件名称C35预测参数定量阈值[%]:3抑制阈值[变化倍数的对数]:抑制残基[数]:1一lDRBl+0301nRBl*O401DRB"O701_drb1*1101drb5*0101-------70--------80—GAFEIEINGQIiVFSKLEWGGFGAFEIEINGQLVFSKIiEHGGFGAFEIEI,IiVFSKLE鹏FGAFEIEINGQLVFSK副GGFGAFEIEINGQLVFSKLEWGGFGAFE工EINGQIiVFSKbENGGF(包含一个抑制残基的85*0101的结合框架-IOO倍)定量分析*GAFEXEINGQLVFSKLENGGF'阈值(％)100908070605040302DRB"OIOIXXXXXXXXXX3DOOCXXXX.................XXXXXXXXXXXXXX.....................drbi*0301xxxxxxxxxxxxxxJooaoooaoaQoaQoaaoocx.drb1*0401XXXXX3QDODCXXXXXX5QQQaaQaaQQaQDQQQQC-DRB1*0402XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX.........1)四1*0404XXXXXXXXXXXXXXKX3DOQOQOaOOC,........DBB"0405XXXXXXXXXX.........................idrb1*0410xxxxxx.............................drb1*0421XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXJOODOODDOOOOKX.DRB1*0701XXXXXXXXXXXXXXXXXX----.............drb1*0801...................................DRB1*0802...................................DRB1*0804XXXXXX.............................XXXXXX...............'..............DRB1*1101XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX.............DRB1*1104XXX3DOOQQKXXXXXXXXXXXXKXXX.........drb1*1106X30DQaOQDDDaQODDaOQOQDOOQOC.........drbi>iio73DOQaoaaaDoaDacxxxxxxxx3aoaaaaDQOQcx.DRB1*1305XXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX.....drbi*1307jaooaQuaaoacxxxxxxx.................DRB1*1311XXXXXXJODOCXXXXXXXXXXXXXXXX.........dfb;l*:l321xxxxjaoaooaaaoDDacxxxxx.............nRBi*isoixxxHaQDoaoaooc.....................DRB1*1502XXXXXXXXXXXXXX.....................鹏5*。101xxxxjOQaooooaoQaaoaaQoaoQcx.........文件名称C35预测参数定量阈值[%]:5抑制阈值[变化倍数的对数]:抑制残基[数]:1—1DRB1*0101drb1*0301DRB1*0401drb1*1101drb5*oio:l-------90--------ioo-FPYEKDLIEAIRRASMGETIiEFPYEKDIiIEMRRASNGETMFPYEKDMEAIRRASNGETIiEFPYEKDIilEMRRASNGETLEFPYEKDI)IEMRRASNGETIjE(包含一个抑制残基的85*0101的结合框架-100倍)定量分析'FPYEKDLIEAIKRASNGETIjE，阈值(％)100908070605040302o!LDEB1*0101XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................okbi*oio2xxxxxxjaaoacxxxxxxxxxxxxKxx............DRB"0301XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................t)EBl*040iXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXKXXXXX............dkb1*0402XXXXXXXX3QODOOaaDCX:....................drbi*0404xxxxxxxjaDODGaoaaoaoQacxxxx............r>RB3_*"04O5xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx............deb1*0410■XXXXXXXXXXXXXJDQDaaaaDQQDQOOaCX........DRB1*0421XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............DRB1*0701XXXXXXXXXX............................DRB"OBOlXXXXXXXXXXXXXXXXXX....................DRB1+0802XXXXXXKXXXXXXXXXXX....................OTB1*0804XXXXXXXXXXXXXKXXXXXXXX................dbbi*080GxxxxxjoaaaoaaooDaaDaaac................D油l禽llOlxxxxxxxxxx............................drb"1104xxxxxxjooaaaaooaacx....................0肪1*1106xxxxxxxxxxxxxxxxxx....................DRB1*1107XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................DRB1*1305XXXXXX................................DRB1*1307XXXXX3DODDCXXXXXXXXXXXX................DRBl*1311XXXXX3QQDDQOOQCXXXX....................drb":l321xxxjaaaaaaaaaaaacxxxxxx................DRB1*1501XXXXXXX3QOCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........DRB1*1502XXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........drb5*0101X^XXXXXXXX05t5t........................改变的肽配基利用特异性人T细胞系鉴定C35的腿CI类抗原免疫显性表位，是其成功用于癌症疫苗的关键。包含在MHC结合残基处氨基酸置换的修饰的C35肽，有可能用于增强免疫功能。上述改变的肽配基或不规则肽甚至在低于原始肽100倍的浓度下，也可成为强的T细胞激动剂(Dressel，A.等,"AutoantigenrecognitionbyhumanCD8TCellclones:enhancedagonistresponseinducedbyalteredp印tideligand,〃/.i/z朋〃/7o丄159:4943-51(1997)。这些改变的肽配基可以具有两种形式增强T细胞受体与肽的接触(必须由实验确定)的修饰以及通过改进锚定残基增强HLA对肽的结合的修饰。表4详细说明了通过引入有利的锚定残基或置换有害残基而增强HLAI类结合的修饰。表4增强HLAI类结合的修饰(除非另有陈述，实例适用于9个氨基酸的肽；对于10聚体，忽略位置5的氨基酸，评价其余的9聚体(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/hla—coefficientviewing_page)。下列修饰是根据现有数据库中的当时数据例举的，决不是包括了与全部潜在HLA分子结合的所有可能的肽改变，无论迄今其是否已知。)HUVA*0101任何一种改变的肽，其2位为S或T任何一种改变的肽，其3位为D或E任何一种改变的肽，其4位为P任何一种改变的肽，其7位为A、F、I、L、M、P、V或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、K、R或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，F,G,H，K,M，N，P，Q，R，W，YP3:E，K，R，WP4:K，RP7:D，E，G，RP9:D，E，PHLAA承0201任何一种改变的肽，其1位为F、I、K、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q或V任何一种改变的肽，其3位为F、L、M、W或Y任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其5位为F任何一种改变的肽，其辅助锚位6为F、I、L、M、V、W或Y任何一种改变的欣，其7位为F或W任何一种改变的肽，其8位为F、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、T或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:D，E，H,PP2:C，F，H，K，N，P，R,S，W,YP3:D，E，K，RP7:D，E，G，RP8:I，VP9D，E，F，G，H，K，N，P，Q,R，S，W，Y歸-A氺0205任何一种改变的肽，其1位为F、I、K、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其锚位2为E、I、L、M、Q或V任4可一种改变的肽，其3位为F、L、M、W或Y任何一种改变的肽，其4位为D或E138任何一种改变的肽，其5位为F、Y任何一种改变的肽，其辅助锚位6为F、I、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其7位为F或W任何一种改变的肽，其8位为F、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、T或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:D，E，PP2:C，D，F，G,H,K，N，P，R，S，W，YP3:D，E，K,RP7:D，E，RP9:D，E，F，G，H,K,N，P,Q，R,S，W,YHLA_A*03任何一种改变的肽，其1位为G或K任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q、T或V任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其4位为E、G或P任何动力种改变的肽，其5位为F、I、P、V、W、Y任何一种改变的肽，其6位为F、I、L、M或V任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、K、L、Q或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换P1:D，E,PP2:D，E，F，G，H，K，N，R，S，W，YP7:G，K，RP9:D，E，G，H，N，P，Q，S，THLA-A氺1101任何一种改变的肽，其1位为G、K或R任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、Q、T、V、Y任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W、Y任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为K或R任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换P1:D，E，PP2:D，E，G，H，K，N，R,S，WP7:K,RP9:C，D,E，G，N，P，Q，S，THLA-A24任何一种改变的肽，其1位为K或R任何一种改变的肽，其锚位2为F或Y任何种改变的肽，其3位为E、I、L、M、N、P、Q或Vat任何一种改变的肽，其4位为D、E或P任何一种改变的肽，其5位为I、L或V任何一种改变的肽，其6位为F任何一种改变的肽，其7位为N或Q任何一种改变的肽，其8位为E或K任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L或M任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，H，K，RP9:D，E，G，H，K，P，Q，RHLAA*3101任何一种改变的肽，其1位为K或R任何一种改变的肽，其锚位2为F、I、L、M、Q、T、V或Y任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V、W或Y140任何一种改变的肽，其6位为F、I、L、M或V任何一种改变的肽，其7位为F、I、L、M、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为K或R任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:D，E，PP2:D,E，G，H，K，N，R，SP7:K，RP9:C，G，N，P，Q，S，THUVA氺3302任何一种改变的肽，其1位为D或E任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、M、S、V或Y任何一种改变的肽，其锚位9为R任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:K，P，RP2:D，E，K，RP9:D,E，F，G，N，P，W，YHLJV-B7任何一种改变的肽，其1位为A任何一种改变的肽，其锚位2为A、P或V任何一种改变的肽，其3位为M或R任何一种改变的肽，其5位为P任何一种改变的肽，其6位为R任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，F，H，K，R，W，YP3:D，E141P9:D，E，F，G，H，K，N，P,Q，R，S,W，YHLA-B8任何一种改变的肽，其1位为D或E任何一种改变的肽，其锚位2为A、C、L或P任何一种改变的肽，其3位为K或R任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其5位为K或R任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:K,P，RP2rD，E，F，G，H，K，Q，R，W，或YP3:D，EP5:D，EP9:D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S,W，YHLA-B8(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为D或E任何一种改变的肽，其锚位2为A、C、L或P任何一种改变的肽，其3位为K或R任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其5位为K或R任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:K，P，RP2:D，E，F，G，H，K，Q，R，W，或YP3:D，EP5:D，EP8:D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R,S,W，YHLA-B14任何一种改变的肽，其1位为D或E任何一种改变的肽，其锚位2为K或R任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、P、V、W、Y任何一种改变的肽，其5位为H或R任何一种改变的肽，其6位为I、L、M、R或V任何一种改变的肽，其7位为T任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，F，W，或YP3:E，RP5:E，W，YP9:D，E,G，H，K，N，P，Q，RHUV-B氺2702任何一种改变的肽，其1位为K或R任何一种改变的肽，其锚位2为E、L、M、N、Q或R任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、W或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:D，E,PP2:D，F，G，H，K，W，或YP7:KP9:D，E，G，K，N，P，Q，R，SHLA-B27本05(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为K或R任何一种改变的肽，其锚位2为E、L、M、N、Q或R任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、K、L、M、R、V或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换P1:D，E，PP2:D，F，G，H，K，W，或YP7:KP9:D,E,G，K，N,P，Q，R，SHLA-B氺3501(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为K或R任何一种改变的肽，其锚位2为A、P或S任何一种改变的肽，其3位为K或R任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其5位为D或E任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，F，H，K，R，W，YP3:D，EP8:D,E,F,G,H，K，P，Q，RHLA-B"701任何一种改变的肽,任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的欣，其锚位2为D或E其5位为I或V其8位为F、L或M其锚位9为F、I、L、M、V或Y其下列位置的有害残基被置换PI:P144P9:D，E，G，H,K，P，Q，RHLA-B本3801任何一种改变的肽，其锚位2为F、H、P、W或Y任何一种改变的肽，其第3位为D或E任何一种改变的肽，其4位为D、E或G任何一种改变的肽，其5位为A、I、L、M或V任何一种改变的肽，其8位为K或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，K，RP3:K，RP9:D，E，G，H，K，P，Q，RHLA-B+3901(8聚体肽)任何一种改变的肽，其锚位2为H或R任何一种改变的肽，其3位为D、E、F、I、L、M、V、W或W任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其6位为I、L、M或V任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，EP3:K，RP6:D，E，K，RP8:D，E，G，H，K，P，Q，RHLA—B本3902任何一种改变的肽，其锚位2为K或Q任何一种改变的肽，其5位为F、I、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、L或M任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:PP2P3:K，RP9:D，E肌A-B40任何一种改变的肽，其1位为A或G任何一种改变的肽，其锚位2为D或E任何一种改变的肽，其3位为A、FI、L、M、V、W或Y任何一种改变的肽，其4位为P任何一种改变的肽，其5位为P任何一种改变的肽，其锚位9为A、L、M或W任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，或YP3:D，E，K，RP9:D，E，G，H，K，N，P，Q，RHLA-B44承03任何一种改变的肽,任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽,任何法种改变的肽,其1位为A、D或S其锚位2为D或E其3位为A、I、L、M或V其4位为F、I或P其5位为A、K或V其6位为A、L、T或V其7位为F、K或T任何一种改变的肽，其8位为K任何一种改变的肽，其锚位9为F、W或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:F，H,I，K,L，M，Q，R,V，W，YP9:D，E,G,H,K,N，P，Q,RHLA-B*5101(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为D、E、F、I、L、M、V或Y任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P任何一种改变的肽，其3位为F、W或Y任何一种改变的肽，其4位为D、E、G、I、K或V任何一种改变的肽，其5位为A、G、S、T或V任何一种改变的肽，其6位为I、K、L、N或Q任何一种改变的肽，其7位为D、K、Q或R任何一种改变的肽，其锚位8为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换Pl:K，P，RP2:D,E，H，KP8:D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA,5102任何一种改变的肽，其1位为F或Y任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、V、W或Y任何一种改变的肽，其4位为E、G、H、K、L、N、Q、R或T任何一种改变的肽，其5位为G、N、Q、T或V任何一种改变的肽，其6位为I、N、Q或T任何一种改变的肽，其7位为E、K、Q或R147任何一种改变的肽，其8位为K、R、T或Y任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D,E，H，K,RP3:D，E，K，RP9:D，E，F,G，H，K,N，P,Q，R，S，W，YHLA-B氺5102(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为F或Y任何一种改变的肽，其锚位2为A、G或P任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、V、W或Y任何一种改变的肽，其4位为E、G、H、K、L、V、W或Y任何一种改变的肽，其5位为G、N、Q、T、V任何一种改变的肽，其6位为I、N或Q任何一种改变的肽，其7位为Q或R任何一种改变的肽，其8位为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，H，K，RP3:D，E，K，RP8:D，E，F,G，H，K，N,P,Q，R，S，W，YHIJVB氺5103任何一种改变的肽，任何一种改变的肽,任何一种改变的肽,任何一种改变的肽,任何一种改变的肽,其1位为D、T或V其锚位2为A、G或P其3位为D、F、L或Y其4位为E、G、L、N、其5位为A、G、M、N、Q、R、T或VQ、R、K或V148任何一种改变的肽，其6位为I、K或T任何一种改变的肽，其7位为M或V任《可一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，H，K，RP9:D，E,F，G，H，K，N，P，Q，R，S,W，YHLAB*5201(8聚体肽)任何--种改变的肽，其1位为I、L、M或V任何--种改变的肽，其锚位2为G、P或Q任何--种改变的肽，其3位为D、F、I、L、P、W或Y任何_-种改变的肽，其4位为A、E、I、K、L、P或V任何--种改变的欣，其5位为A、F、G、I、L、M、T或V任何--种改变的肽，其6位为K、L、N、S或T任何--种改变的肽，其7位为E、K、Q或Y任何一种改变的肽，其锚位8为F、I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:H，K，RP3:RP8:D，E,G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-B柳Ol任何一种改变的肽，其1位为I、K或R任何一种改变的肽，其锚位2为A、S或T任何一种改变的肽，其3位为D任何一种改变的肽，其4位为E、K或P任何一种改变的肽，其5位为F、I、L、M或V任何一种改变的肽,任何一种改变的肽，任何一种改变的肽,任何一种改变的肽,任何一种改变的肽，PI:D，EP2:D，EP9:D,E其6位为F、I、L或V其7位为L、M、N或Y其8位为K、N、R或T其锚位9为F、W或Y其下列位置的有害残基被置换,K，L，M，N，Q，R，V，W，Y，N，P，Q，R，SHLA-B氺60任何一种改变的肽，其锚位2为D或E任何一种改变的肽，其3位为A、I、L、M、S或V任何一种改变的肽，其5位为L、I或V任何一种改变的肽，其7位为I、L、M、V或Y任何一种改变的肽，其8位为K、Q或R任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:F，H，I，K，L，M,Q，R，V，W，YP9:D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHU-B氺61任何一种改变的肽,任何一种改变的肽，任何一种改变的肽,任何一种改变的欣，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，任何一种改变的肽，其1位为G或R其锚位2为D或E其3位为A、FI,其6位为I其7位为Y其锚位9为A、I、L、M、T、V、W或YL、M或V其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:F，H，I,K，L，M，Q，R，V，W，YP9:D，E，F,G,H，K，N,P，Q，R，S，W，YHLA-B納l(8聚体肽)任何一种改变的肽，其1位为G或R任何一种改变的肽，其锚位2为D或E任何一种改变的肽，其3位为A、FI、L、M、T、V、W或Y任何一种改变的肽，其6位为I任何一种改变的肽，其7位为Y任何一种改变的肽，其锚位8为A、I、L、M或V任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:F，H，I，K，L，M，Q，R，V,W,YP8:D，E，F，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B求62任何一种改变的肽，其1位为I任何一种改变的肽，其锚位2为I、L、Q任何一种改变的肽，其3位为G、K、R任何一种改变的肽，其4位为D、E、G或P任何一种改变的肽，其5位为F、G、I、L或V任何氚种改变的肽，其6位为I、L、T、V任何一种改变的肽，其7位为T、V或Y任何一种改变的肽，其锚位9为F、W..Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP2:D，E，F，H，K，N，R，S，W,YP3:D，EP6:D，E,K，RP9:D，E，G，H,K，N，P，Q，R,SHLA-Cw0301任何一种改变的肽，其锚位2为A或R任何一种改变的肽，其3位为F、I、L、M、V或Y任何一种改变的肽，其4位为E、P或R任何一种改变的肽，其5位为N任何一种改变的肽，其6位为F、M或Y任何一种改变的肽，其7位为K、M、R或S任何一种改变的肽，其8位为T任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP3:D，K，RP6:D，E，K，RP9:D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S,HLA-Cw0401任何一种改变的肽，其锚位2为F、P、W或Y任何一种改变的肽，其3位为D或H任何一种改变的肽，其4位为D或E任何一种改变的肽，其5位为A、H、M、R或T任<可一种改变的肽，其6位为I、L、M或V任何一种改变的肽，其7位为A任何一种改变的肽，其8位为H、K或S任何一种改变的肽，其锚位9为F、I、L、M、V或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:P152P2:D,E，H，K，RP9:D，E，G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-Cw0602任何一种改变的肽，其1位为F、I、K或Y任何一种改变的肽，其锚位2为A、P、Q或R任何一种改变的肽，其5位为F、I、K、L或M任何一种改变的肽，其位为I、L或V任何一种改变的肽，其7位为K、N、Q或R任何一种改变的肽，其锚位9为I、L、M、V或Y任何一种改变的肽，其下列位置的有害残基被置换PI:PP9:D,E,G，H，K，N，P，Q，R，S153预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)从CS5氨基酸序列预测人I类MHC结合肽及其可能如何变化以加强结合的例子HLA-A*0101排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)771629392改善的肽的例子改善的肽的例子KLENGGRPYEVEPGSGVRYCEPCGFEAYLELASAVKSGEPGQTSVSTEPGQTSVSTEPGQISYHLA-A*O101(IO聚体肽)166E正INGQLVF216EVEPGSGVRI39YCEPCGFEAT426VYEYCEPCGF552GffiEESRLGG改善的肽的例子GTEPSRLGYHIA-A*0201(9聚体肽')19SVAPPPEEV2104K3TNSRPPC31051TNSRPPCV425IWEYCBPC225.00090.00045.00036.0002.250在P2位是G是有害的22.50在P2位用T置换G5625.00在P9位用Y置换V，P7被增强45.00018細9細9.0002.2501125.000在P2位用T置换I在P9位用Y置换GP5被P增强—2.9822.3911.6421.485154预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)455383改善的肽的例子ffi正SRLGGTF戶YEKDLIEAFVYEKDLIEA1.4281.350在P2位是P是有害的54.000在P2位用V置换PHIA-A24134249改善的肽的例子370438582GFEATYLELQYPGIEIESQYPGIEIELNGQLZFSKLTYLELASAVGFPYEKDLI33.00011.550462.000增强P911.08810細7.500HLA-A24(w聚体肽1M274384469改善的肽的例子528AFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDL正AIINGQLVFSKLIYGQLVFSKLEYCEPCGFEA42.00010細9.0007.392369.6增强p26.600HLA-A3177改善的肽的例子2393101461KLENGGFPYKLENGGFPKYLELASAVKTLEKITNSRGTGAFEIEI36.000180.000增强P920細6.0000.540预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)569改善的肽的例子HLA-A3(10聚体肽1<58258341478改善的肽的例子595HLA-A"lOl139269改善的肽的例子3164101561lvgqlwskilgqlwskeingqlvfskrlggtg細ielasavkeqylgnggfpyekllnggfpyek;rasngetlekylelasavkwgqlwskivgqlwskevepgsgvrtlekttnsrgtgafe正ihia-a*1101(10聚体肽)195rasngetlek238tylelasavk368eingglwsk478lenggfpyek:改善的狀的例子lvnggfpyek5100etlekttnsr0.360在p2位是n是有害的l80.000在p2位用L置换n8.1002.7001.8000.810在p2位是e是有害的"0.000在p2位用L置换e0.4000.4000.120在p2位是n是有害的6.000在p2位用v置换n0.1200.0800.0601.2000.6000.3600.120在p2位是e是有害的4.000在p2位用v置换e0.090157预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-A*31011101216350487改善的肽的例子539TLEKITNSREVEPGSGVRYPGIE正SRKZ)LIEAIRROL正AIRRYLELASAVK2細0.6000.4000.240在P2位是D是有害的n.OOO在P2位用I置换D0.200HLA-A*33021162101350466556EVEPGSGVRTLEKITNSRYPGffi正SRE正INfGQLVESRLGGTOA45.0009細3.0001.5001.500HLArA*3302(10聚体肽')1492100316428568QYPGIE正SRETLEKITNSREVEPGSGVRIEYCEPCGFEAEINGQLVFSK15.0009.0001.5001.5001.500HIA-A68.111629350gVEPGSGVRSVAPPPEEVYPG正正SR卿，12.00010細预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)改善的肽的例子4965101YVGIE正SRASNGETLEKTLEKITNSR400.000增强P29細5扁HIA-A68.1(IO聚体肽).1100216368415改善的肽的例子595ETLEKTTNSREVEPGSGVTRI加GGLVFSKE￡VEPGSGVREWEPGSGRRASNGETLEK300.00018.0009.0009.000在P2位是E是有害的l加0.00在P2位用V置换E3.000HIA-B14194257改善的肽的例子31004105588RRASNGETLSRLGGTGAFSRLGGTGALETLEKITNSITNSRPPCVDLIEAIRRA20.0005細100.000增强P93.3752扁1.350HLA-B14(10聚体肽)1103EKITNSRPPC改善的肽的例子233393418ERITNSRPPLCGFEATYLELIRRASNGETLEPGSGVRIW6.750900.000增强P105.0004細3細预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰88DL正AIRRAS2.250HIA-B4016523335415改善的肽的例子5'67FEIEINGQLGEPGQTSVAFEATYLELAEEVEPGSGVEEVEPGSGLIEINGQLVF訓0040細40細2楊0'120.000增强P916.000HIA-B40(IO聚体肽155253改善的肽的例子365467599ESRLGGTGAffi正SRLGGTIE正SRLGGLFEIEINGQLV正INGQLVFSGETLEKITNS20細16細80.000增强P1016細16.0008細HLA-B60165217改善的肽的例子315447585FE正FNGQLVEPGSGVRIVEPGSGVRLEEVEPGSGVKEQYPG正IYEKDLIEAI387.20017.600352.000增强P916.000仏OOO8.800160预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HIA-B60(IO聚体肽165改善的肽的例子106533317FEffiINGQLVFEEEINGQLLTNSRPPCVILIEIESRLGGTCGFEATYLELVEPGSGVRIV16扁320.000增强P101(5.0008.0008細8細HIA-B61115235改善的肽的例子33465585EEVEPGSGVFEATYLELAFEATYLELVGEPGQTSVAFEIEINGQLYEKDLEEAI80.000楊00160.000增强P922扁16.00016細HLA-B61(10聚体肽165217355487改善的肽的例子553FE正INGQLVVEPGSGVRIVIESRLGGTGAKDLIEAIRRAKELIEAIRRV正IESRLGGT80.00040細20細10細160.000增强P2、P108細161预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HIA-B62177221375431改善的肽的例子588KLENGOFPYSGVRIWEYFSKLENGGFEPCGFEATYEQCGFEATYDLIEAIRRA24.0004細3細2.640在P2位是P是有害的105.6在P2位用Q置换P2.200HIA-B62(10聚体肽141258366456改善的肽的例子520改善的肽的例子HIA-B71107改善的肽的例子245322470581ELASAYKEQYELGGTGAFEIEffiINGQLWE肌GGTGAFEQRLGGTGAFG犯VRIWEYGQGVRIWEYNSRPPCVILNPRPPCVILAVKEQYPGIGVRIWEYCNGQLWSKLGGFPYEKDL40細9.6007.9206.000在P2位是S是有害的480.000在P2位用Q置换S4800在P2位是S是有害的384.000在P2位用Q置换S60.000l加O.OOO增强P26細5.0004.0004.000预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HIA-B7(10聚体肽150231318改善的肽的例子4106580YPGMESRLEPCGFEATYLEPGSGVRIWEPGSGVRTVLTNSRPPCVILNGGFPYEKDL80細80.0006細120.000增强P106細4.000HLA-B8110724531054565100改善的肽的例予NSRPPCVILAVKEQYPGIITNSRPPCVESRLGGTGAETLEKimSETLEKITNL4細1.5000.6000.4000.300在P9位是S是有害的12.000在P9位用L置换SHLA-B8(8聚体肽1832107391改善的肽的例子420518FPYEKDLINSRPPCVIEAIRRASWEAIRRASLGSGVRIWEPGSGVRI6細l細0細32.0000.6000.400在P8位是N是有害的在P9位用L置换N预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HIA-B8(IO聚体肽)5093改善的肽的例子3314104518YPGIEIESRLIRRASNGETLIARASNGETLEPCGFEATYLKITNSRPPCVEPGSGVRIW0.8000.40016.000在P2位用A置换R0.3200.3000.240HLA-B*2702157294改善的肽的例子393427577SRLGGTGAFRRASNGETLRRASNGETFIRRASNGETVEYCEPCGFKLENGGFPY200.000600.000增强P920細15扁9.000HIA-B*2702(10聚体肽)193IRRASNGETL294RRASNGETtE330GEPCGFEATY45SRLGGTGAFEI523VRIWEYCEP60細6細3細2.7002.000在P10位是P是有害的改善的肽的例子VRIWEYCEY200.000在P10位用Y置换P预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)—HLA-B*270S194257393改善的肽的例子427577RRASNGETLSRLGGTGAFIRRASNGETIRRASNGELVEYCEPCGFKLENGGFPYHLA-B*2705(10聚体肽)9394改善的肽的例子378495558IRJRASNGETLRRASNGETL￡RRASNGETLLLENGGFPYEKRASNGETLEKRLGGTGAFEI6000.000200扁2000.000增强P975.00045扁2000.00060.000在P2位是E是有害的6000.000在P2位用L置换E30.00030.00027.000HIA-B*3501131275改善的肽的例子3107442518EPCGFEATYFSKLENGGFFPKLENGGMNSRPPCVILLASAVKEQYEPGSGVRIV40細22.500120.000增强P2、P915.0006.0004.000165预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-BA3邻1(IO聚体肽)131250356420583改善的肽的例子EPCGFEATYLYPG正IESRLESRLGGTGAFGSGVRIWEYFPYEKDL正AFPYEKDL正M30.00020細15細10細6.000120.000增强P10HLA-B*3701165改善的肽的例子247385417535FEIEINGQLFDIEINGQLKEQYPGIEIYEKDLIEAIVEPGSGVRIFEATYLELA15.00060,000增强P210.00010細10.0005扁HLA-B*3701(IO聚体肽)165FEIEINGQLV改善的肽的例子23467818730FDIEINGQLIIEINGQLWSGGFPYEKDLIKDL正AIRRACEPCGFEATY10細200.000增强P2、P105.0005細4細2厕预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-B*3801134改善的肽的例子70388197GFEATYLELGHEATYLELNGQLVFSKLTYLELASAVGGFPYEKDLSNGETLEKI6細卯.000增强P21.5601.0401.0000.720HLA-B*3801(10聚体肽)164AFEIHNGQL改善的肽的例子231366426550AHE正1NGQLEPCGPEATYLEIEINGQLWWEYCEPCGFYPG正IESRL7.800117.000增强P24達3細3.0002.600194改善的肽的例子2343438662RHASNGETLGFEATYLELTYLELASAVEIE3NGQLVSGEPGQTSV15.00090.000增强P29.0004細3.0003細预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-B*4403167改善的肽的例子27216535IEINGQLWffiINGQLVYVEYCEPCGFSGVRIWEYFEEINGQLFEATYLELAHIA-B*4403(IO聚体肽、3053改善的肽的例子367465517CEPCGFEATY正正SRLGGT正IESRLGGYIEINGQLWSFEIEINGQLVVEPGSGVRIV200.000900.000增强P940.00036.00020.00012.000120細30.000900.000增强P1030.00020細18.000HLA-B*5101118259改善的肽的例子32481570EPGSGVRIVLGGTGAFEIIJPGTGAF迈SGEPGQTSVGGFPYEKDLNGQLVFSKL484.000114.400572.000增强P248.40044.00022.000预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-B*5101(10聚体肽)1844改善的肽的例子331481550EPGSGVRIWSAVKEQYPGISPVKEQYPGIEPCGFEATYLGGFPYEKDLIYPGIE正SRL440細220扁440.000增强P2220.000176.00'0157.300HIA-B*5102118281改善的肽的例子35947052EPGSGWIVGGFPYEKDLGPFPYEKDILGGTGAKEINGQLWSKLSGEPGQTSV242.0002200.000增强P2、P996.80048.40024.200HIA-B*5102(IO聚体肽>144SAVKEQYPGI改善的肽的例子23450811831SPVKEQYPGIYPGIEIESRLGGFPYEKDUEPGSGVRIWEPCGFEATYL726細1452.000增强P2400.000400.000220.000121:000预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-B*5103159改善的肽的例子2342187081LGGTGAFEILAFTGAFEISGEPGQTSVEPGSGVRIVNGQLWSKLGGFPYEKDL48.400145.200增强P244細44.0007.2607.200HLA-B"103(io聚体肽)144281318改善的肽的例子460533SAVKEQYPGIGGFPYEKDLIEPGSGVRIWEAGSGVRIWGGTGAFEIEICGFEATYLEL110.00052.80044細110.000增强P244.0007.920HLA-B*5201118267改善的肽的例子359498519WPGSGVRIVLEINGQLVFLQINGQLVILGGTGAFEINGETLEK3TPGSGVRIW75.00022.500450.000增强P2、P911.25011.000IO細预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HIA-B*5201(10聚体肽les)1817改善的肽的例子3814105537EPGSGVRIWVEPGSGVRIVVQPGSGVRIVGGFPYEKDLIITNSRPPCVIATYLELASAV100細45.000450.000增强P233.00015.00012.000H1A-B*5801175改善的肽的例子24231074615105FSKLENGGFFSKLENGGWLASAVKEQYNSRPPCVILGTGAFEIEIITNSRPPCVHLA-B*5801(IO聚体肽)156ESRLGGTGAF220GSGVRIWEY改善的肽的例子4105537GSGVRIWEWMSGEPGQTSVITNSRPPCVIATYLELASAV40.00080.000增强P94.5004.0003.0003，12.000IO細144.000增强P104.0003細3.000预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰期)HLA-Cw*0301165281370457534FEIEINGQLGGFPYEKDLNGQLWSKLSRLGGTGAFGFEATYLEL30細18.00012.00010細10細HLA-Cw*0301(10聚体肽I)144SAVKEQYTGI改善的肽的例子234336981106SAVKEQYPGLCGFEATYLELINGQLWSKLGGFPYEKDLITNSRPPCVIL50.000100.000增强P1045.00012.0003.7503.000HLA-Cw*0401134238382418531改善的肽的例子GFEATYLELTYLELASAVGFPYEKDLIEPGSGVRIVEPCGFEATYEFCGFEATLHIA-O*0401(io聚体肽)164AFEIEINGQL274VFSKLENGGF240.00030.00025.00020.00012.000200.000增强P2、P9200.000IOO遍预测的人I类MHC结合肽的例子-续排位起始位点亚序列分值(估计的解离半衰改善的肽的例子350431518VFSKLENGGLYPGIEIESRLEPCGFEATYLEPGSGVRIW200.000增强pio訓OO訓OO脂OOHLA-O*0602185265321431561YEKDLffiAIFEIEINGQLSGVRIWEYEPCGFEATYGTGAGEIEI6.6006細6細3.3003.000HLA-Cw*0702131221342477549EPCGFEATYSGVRIWEYLASAVKEQYKLENGGFPYQYPGEE正S24.00019.2008細4扁2.880HIA-Cw*0702(io聚体肽)120GSGYRIWEY38.400230CEPCGFEATY16.000341ELASAVKEQY16.000450YPGIEIESRL7.920576SKLENGGFEY4—000表5预测的C35HLA1类表位*HLA限制性元件包含的氨基酸序列A*02019-17SVAPPPEFVA*020110-17VAPPPEEVA*020116-23EVEPGSGVA*020116-25EVEPGSGVRIA*02013"3EATYLELAA*020137-45ATYLELASAA*020137-46—ATYLELASAVA*020139-46YLELASAVA*020144-53SAVKEQYPGIA*020145-53AVKEQYPGIA*020152-59GffiIESRLA*020154-62EIESRLGGTA*020158-67RLGGTGAFEIA*020161-69GTGAFEIEIA*020166-73EffiINGQLA*020166-74Effi婦QLVA*020188-96DL正AIRRAA*020189-96LIEAIRRAA*020192-101AIRRASNGETA*020195-102RASNGETLA*0201104-U3KTTNSRPPCVA*0201105-113ITNSRPPCVA*0201105-114ITNSRPPCVIA*310116-24EVEPGSGVRB*350130-38EPCGFEATYA*30101超基序96-104ASNGETLEK*利用在SYFPEITHI网站(wysiwyg://35/http://134.2.96.221/scriptslhlaserver.dll/EpPredict.htm)发现的规贝'j，并根据Rammensee，H.G.，Bachmann，J.和Stevanovic，S.(Chapman&Hall，NewYork1997)的著作〃MHCLigandsandPeptideMotifs〃进行预测。序列表6预测的C35HLA11类表位*包含的氨基酸1限制性元件SGVRIWEYCEPCGF21-35SRLGGTGAFEIEINGQLVF57-75DRB1*0102DRB1*0301DRJB1*0401DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0801DRB1*0804DRB1*0806DRBl"lOlDRB1*1104DRBl"賜DRB1*1107DRBI*1305DRB1*1307DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101DRBl承OlOlDRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0804DRB1*0806DRBl"lOlDRB1*1104DRB1*1106DRB1承I305DRB1*1321DRJB1*1501176GAFE正INGQLVFSKLENGGF63-83FPYEKDLffiAIRJRASNGETLE83-103DRB1"502DRB5*0101DRB1*0101DRB"0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106DRB1*1107DRB1*1305DRB1*1307DRB1*1311DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0801DRB1*0802DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106DRB1*1107DRB1*1305DRB1*1307DRB1*1311DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101*利用7￡1丁(^￡软件预测11类1^0表位。Sturniolo,T.等人，1999。Generationoftissue—specificandpromiscuousHLAliganddutabasesusingDMmicroarraysandvirtualHLAclassIImatricws。NatureBiotechnology17:555—571。本发明中〃表位〃是指在动物特别是人中具有抗原性或免疫原性、或者能够激发动物、优选人的T淋巴细胞应答的C35多肽片段。本发明优选的实施方案涉及包含表位的C35多肽片段，以及编码该片段的多核苷酸。本发明另一优选的实施方案涉及包含表位的C35多肽片段，以及编码该片段的多核苷酸。本发明特定的优选实施方案中，表位包含表1-6任一个中所列C35片段。本发明又一优选实施方案中，表位由表1-6任一个中所列C35片段组成。抗体能结合的蛋白质分子区域定义为〃抗原性表位〃，相反，〃免疫原性表位〃定义为激发抗体应答的蛋白质的一部分。(例如参见Geysen等，尸rocyVw7.^cad5"cj'.〃5^67:<^^"-^^2(7効，^人因而本发明另一优选实施方案是免疫原性的C35肽片段，当结合MHC分子的肽结合裂隙时，其能够激发T细胞应答。本发明特定的优选实施方案中，免疫原性的C35肽片段包含表l-6任一项中所列的表位。本发明又一优选实施方案中，免疫原性的C35肽片段由表1-6任一项中所列的表位組成。本发明另一实施方案涉及包含所述免疫原性C35肽片段或其编码多核苷酸的药物制剂和疫苗组合物。可利用任何常规方法制备起表位作用的片段。(例如参见Houghten，R.A.，尸roc.做丄5"c,脂82:5131-5135(1985)，美国专利No.4，631，211有进一步描述。)按照能提高MHC结合亲和力的可预测方式，可以在已知的肽锚位改变已知与特定MHC分子结合的肽表位序列。该〃表位增强〃已用于改进许多不同MHCI类或MHCII类结合肽表位的免疫原性(Berzofsky，J.A.等，/層,丄/er,，..757-"(1999);Ahlers，J.D.等，尸潔.yVa〃.爿cad〃.5"./i94:10856-61(1997);Overwijk，等，/U.7脱'2〃-卵(1998);Parkhurst，M.R.等，/迈迈歸丄H朋-必(1996))。因此，本发明的另一实施方案涉及该增强的C35表位，以及编码该增强表位的多核苷酸。本发明的抗原性表位优选包含至少7个、更优选包含至少9个以及最优选包含约15-30个氨基酸的序列。抗原性表位可用于引发特异性结合该表位的抗体，包括单克隆抗体。(例如参见r27so/7爭人，Ce7751797:767-778(1984);5"由J7/Y"e,/6*.爭人，5"cJ'e"ce219:660-666(1983).)类似地，根据本领域公知的方法，免疫原性表位可用于诱导B细胞和T细胞。(参见Sutcliffe爭乂，上文；Wilson爭人，上文；Chow,M.爭入，尸rocy4cad5"c丄〃W82:910—914;以及Bittle，F.J.爭入，/."e".r/ro丄66:2347-2354(1985).)优选的免疫原性表位包括分泌的蛋白质。免疫原性表位可与载体蛋白质(例如白蛋白)一起呈递给动物系统(例如兔或小鼠)，或者如果足够长(至少约25个氨基酸)，则可不需要载体。然而已经证明，仅含9个氨基酸的免疫原性表位，足以引发至少能够结合变性多肽线性表位(例如在Western中印迹)的抗体。此处所用术语〃抗体〃(Ab)或〃单克隆抗体〃(Mab)，是指包括能够特异性结合蛋白质的完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab')2片段)。缺少完整抗体Fc片段的Fab和F(ab')2片段，在循环中清除更快，并且其可能具有的非特异性组织结合比完整抗体更少。(Wahl等，/yVwc丄ifed24:316-325(1983).)因而，这些片段以及Fab或其它免疫球蛋白表达文库的产物，更适于某些应用。此外，本发明的抗体包括嵌合的、单链和人源化的抗体。抗体的诊断和治疗用途本发明进一步涉及与人癌细胞，特别是人乳腺癌和膀胱癌细胞反应的C35抗体、C35抗体片段和抗体缀合物以及单链免疫毒素。表7所列为已经分离并鉴定的适于不同应用的C35特异性单克隆抗体。表7:C35特异性鼠单克隆抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table>ELISA分析细菌合成的C35空白=未测定实施例所用的下列单词或短语具有指定的含义。实施例所用的〃连接〃是指通过任何方式，例如共价结合、非共价结合、离子结合或非离子结合，直接或间接地将一个分子与另一个分子偶联。共价结合包括通过各种接头(例如硫醚接头或疏酯接头)的结合。直接偶联包括一个分子连接目的分子。间接偶联包括一个分子连接于另一个非目的分子，其随后直接或间接与目的分子偶联。实施例所用的〃重組分子〃是指通过基因工程方法制备的分子。实施例所用〃片段〃定义为至少一部分可与目标(即抗原结合区域)结合的免疫球蛋白分子可变区。可以包括免疫球蛋白的某些恒定区。实施例所用〃免疫缀合物〃是指与细胞毒素、放射性试剂、抗肺瘤药或治疗剂化学或生物学连接的任何分子或配基，例如抗体或生长因子。只要能够与目标结合，该抗体或生长因子就可在分子的任何位置连接细胞毒素、放射性试剂、抗肺瘤药或治疗剂。免疫缀合物的例子包括免疫毒素和抗体缀合物。实施例所用〃选择性杀伤〃是指杀伤抗体结合的细胞。实施例所用〃癌〃的例子包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。实施例所用〃免疫毒素〃是指化学或生物学连接细胞毒素或细胞毒性剂的抗体或生长因子。实施例所用〃有效量〃是指杀伤细胞或抑制其增殖的抗体、免疫缀合物、重组分子的量。实施例所用〃竟争性抑制〃是指能够与另一分子的相同目标相结合。对于抗体，竟争性抑制是指抗体能够识别并结合另一抗体所针对的同一抗原结合区。实施例所用〃抗原结合区〃是指本发明中能识别目标或其部分的抗体、重组分子、融合蛋白质或免疫偶联物的一部分。实施例所用〃治疗剂〃是指可用于治疗的任何试剂，包括抗肺瘤药、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性剂。实施例所用〃抗肺瘤药〃是指可用于治疗癌症的任何试剂，包括但不限于细胞毒素及药剂，例如抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素、抗有丝分裂剂、甲基千肼、鞋基脲、天冬酰胺酶、皮质类甾醇、mytotane(0，P，-(DDD))、干扰素和放射性试剂。实施例所用〃细胞毒素或细胞毒性剂〃是指对细胞有害的任何试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、182丝裂霉素、足叶乙戒、tenoposide、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、潘妥卡因、昔罗卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同源物。实施例所用〃放射性同位素〃包括有效破坏肺瘤的任何放射性同位素。例子包括而不限于钴-60和X射线。另外，天然存在的放射性元素，例如铀、镭和钍(其一般为放射性同位素的混合物)，是放射性试剂的合适例子。实施例所用〃给药〃是指对受试者经口服给药、栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药，或者緩释装置植入(例如徵型渗透泵)。实施例所用〃直接〃是指利用偶联标记物的抗体。样品与标记的抗体温育，洗涤除去未结合抗体，然后检验样品。实施例所用〃间接〃是指样品与非缀合抗体温育、洗涤，然后与荧光素缀合的抗体温育。由二抗或〃夹心〃抗体显示一抗的存在。实施例所用〃作用〃是指识别并结合目标。结合可以是非特异性的。优选特异性结合。实施例所用〃治疗〃是指基本上使肿瘤完全退化，以致一段时期，(即〉/二10倍的肿瘤体积倍增时间(TVDD二对照肿瘤大小倍增所需的时间天数))肺瘤仍不可触知的。实施例所用〃胂瘤目标抗体〃是指识别胂瘤(即癌症)细胞上的C35抗原的任何抗体。实施例所用〃抑制增殖〃是指以任何方法干扰细胞生长。实施例所用〃哺乳动物肺瘤细胞〃包括来自动物例如人、羊、猪、鼠、牛的细胞。实施例所用〃药物可接受的载体〃包括与抗体结合时保持抗体的免疫原性并不与受试者免疫系统反应性的任何物质。例子包括而不限于任何标准的药物载体，例如磷酸緩冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水乳剂)，以及各种类型的湿润剂。其它载体可能还包括无菌溶液、片剂(包括糖衣片)和胶嚢。上述载体一般包括赋形剂，例如淀粉、奶、糖、某种粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。上述载体可能还包括调味剂和色素添加剂或其它成分。利用熟知的常规方法配制包含上述载体的组合物。本发明涉及针对癌细胞高度特异的C35抗体。更具体而言，该抗体与多种癌，例如乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌发生反应，而与人正常组织或其它类型胂瘤例如肉瘤或淋巴瘤没有反应性或者反应性有限。此处所用术语〃C35抗体〃包括全部、完整的多克隆和单克隆抗体物质以及嵌合的抗体分子。上述C35抗体包括利用本领域已非常成熟的技术获得的、其中包含抗体的活性抗原结合区(例如Fab、F(ab')2和Fv片段)的其任何片段[例如参见Rousseaux爭人，〃OptimalConditionsForThePreparationofProteolyticFragmentsFromMonoclonalIgGofDifferentRatIgGSubclasses",yf/e^Aocfe^T迈o丄"i7U-"(AcademicPress佛W。本发明的C35抗体还包括融合蛋白质。本发明还包括本发明C35抗体的抗独特型抗体。可利用C35抗体和/或其片段作为免疫原制备这些抗独特型抗体，并用于为诊断而进行的检测胂瘤的体液应答和治疗应用，例如疫苗，以诱导病人的抗肿瘤反应[例如参见Nepom等人，〃Anti-IdiotypicAntibodiesAndTheInductionOfSpecificTumorImmunity",Ca/zcejrMetastasis",，(796W。此外，本发明包括能够结合与C35抗体相同的抗原决定簇、并在该位点与该抗体竟争结合的抗体。这包括具有与C35抗体相同的抗原特异性、但来源物种、同型、结合亲和力或生物学功能(例如细胞毒性)不同的抗体。例如，可以利用本领域已知的重组类别-转换(class-switching)和融合技术，构建具有C35抗体抗原结合区的本发明抗体的类别、同型及其它变体[例如参见Thammana等人，〃I咖unoglobulinHeavyChainClassSwitchFromIgMtoIgGInAHybridoma"，/./迈迈w20丄，U:《WSpira等人，〃TheIdentificationOfMonoclonalClassSwitchVariantsBySubselectionAndELISAAssay〃，J./迈卵"o丄^7卵"ZNeuberger等人,"RecombinantAntibodiesPossessingNovelEffectorFunctions",614-608(1984);以及0i等人，〃ChimericAntibodies〃，j^z'otecA/2!》f/e514(3):214-21(1986)]。因此，具有与C35特异性抗体相同结合特异性的其它嵌合抗体或其它重组抗体(例如融合蛋白质，其中抗体与另一蛋白质例如淋巴因子或肿瘤抑制生长因子结合)，都属于本发明范围之内。如此处所述可利用本领域已知的基因工程技术制备重组免疫毒素，方法是在DNA水平将C35抗体的抗原结合区与治疗剂或细胞毒性剂融合，并制备嵌合蛋白质形式的细胞毒性分子。治疗剂的例子包括而不限于抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素、抗生素和抗有丝分裂剂。抗代谢物包括氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-辟u代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧咬氮烯咪胺(decarbazine)。烷化剂包括氮芥、thio印a笨丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯双胺粕(cis-dichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)顺賴(cisplatin)。蒽环霉素包括柔红霉素(原来的道诺霉素)和阿霉素(此处也指亚德里亚霉素)。其它例子包括米托蒽醌和比生群。抗生素包括放线菌素(dactinomycin，原来的放线菌素actinomycin)、博莱霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)。抗有丝分裂剂包括长春新碱和长春花碱(通常称为长春花生物碱)。其它细胞毒剂包括甲基苄肼、羟基脲、天冬跣胺酶、皮质类甾醇、mytotane(0，P，-(DDD))、干扰素。另外的细胞毒剂例子包括而不限于蓖麻素、阿霉素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、足叶乙戒、tenoposide、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮，1-脱氢睾酮和糖皮质激素。本发明显然包括上述治疗剂和细胞毒剂的类似物和同系物。例如185化疗药物氨基蝶呤有一个相关的改进类似物，即氨甲蝶呤。另外，阿霉素的改进类似物是铁-螯合物。还有，1-甲基亚硝脲的改进类似物是环己亚硝脲。另外，长春花碱的改进类似物是长春新碱。另外，氮芥的改进类似物是环磷酰胺。重组免疫毒素，特别是单链免疫毒素，与药物/抗体缀合物相比，优点在于比这些缀合物更易于制备，并得到均一的分子群体，即由相同氨基酸残基组成的单一的肽。克隆和表达编码与C35单链免疫毒素相应的氨基酸序列的DNA序列的技术，例如寡核苷酸合成、PCR、转化细胞、构建载体、表达系统等，在本领域已非常成熟，大多数专业人员熟悉用于特定条件和方法的标准原料[例如参见Sambrook等人，eds.，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)]。以下包括本发明免疫缀合物的优选实施方案。本发明包括本领域已知的其它实施方案。本发明并不局限于这些特异性免疫缀合物，还包括含有本发明抗体和/或抗体片段的其它免疫缀合物。缀合物包含至少一种药物分子，其通过本发明的接头连接与目的耙细胞群体反应的靶向作用的配基分子。配基分子可以是免疫活性蛋白质(例如抗体或其片段)、非免疫活性蛋白质或肽配基(例如蛙皮素)、或识别细胞相关受体(如凝集素或类固醇分子)的结合配基。另外，由于本发明的缀合物可用于修饰给定的生物反应，不能认为药物部分局限于经典化疗药物。例如，药物部分可能是具有目的生物学活性的蛋白质或多肽。该蛋白质可包括，例如毒素如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、a-干扰素、p-干扰素、神经生长因子、血小板源性生长因子、组织纤溶酶原激活物；或者生物反应调节物如淋巴因子、白细胞介素-1(〃IL-1〃)、白细胞介素-2(〃IL-2〃)、白细胞介素-6(〃IL-6〃)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(〃GM-CSF〃)，粒细胞集落刺激因子(〃G-CSF〃〕或其它生长因子。本发明所用的优选的药物是细胞毒药物，特别是用于癌治疗的细胞毒药物。这些药物通常包括烷化剂、抗增殖剂、微管蛋白结合剂等。优选的细胞毒剂类别包括，例如蒽环霉素家族药物、长春花属药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒核苷、蝶啶家族药物、diynenes和鬼臼毒素。这些类别中特别有用的药物包括，例如阿霉素、洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲喋呤、二氯氨甲喋呤、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或者鬼臼毒素衍生物如足叶乙甙或磷酸足叶乙甙、笨丙氨酸氮芥、长春花碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。如上所述，本领域技术人员可以对目的化合物进行化学f^饰，以便使化合物的反应更为方便，以制备本发明的偶联物。如上所述，本领域技术人员应当理解本发明还包括识别抗原的免疫球蛋白片段的应用。该免疫球蛋白片段可包括，例如Fab'、F(ab')2、F[v]或Fab片段、或者可识别抗原的其它免疫球蛋白片段。可以利用例如蛋白水解酶消化(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、还原性烷基化作用或者重组技术制备该免疫球蛋白片段。制备该免疫球蛋白片段的材料和方法为本领域技术人员所熟知。一般参见Parham，J.Immunology,131，2895(1983);Lamoyi等人,J.ImmunologicalMethods,56，235(1983);Parham，id.，53，133(1982);以及Matthew等人，id.，50，239(1982)。免疫球蛋白可以是如本领域所知的术语〃嵌合抗体〃。免疫球蛋白还可能是〃双功能〃或〃杂合〃抗体，即抗体的一个臂具有一个抗原性位点(例如肿瘤相关抗原)的特异性，而另一个臂识别不同的目标，例如半抗原，本身即是或者结合有对携带抗原的肿瘤细胞具有杀伤作用的药物。另外，双功能抗体可以是每个臂对将要治疗或者生物学修饰的细胞的胂瘤相关抗原不同表位具有特异性的抗体。无论如何，杂合抗体具有双重特异性，优选地，具有针对所选半抗原的一个或多个结合位点，或者针对目标抗原(例如与肿瘤、感染性生物体或其它疾病相关的抗原)的一个或多个结合位点。例如欧洲专利文献EPA0105360描述了生物学双功能抗体，供本187领域技术人员参考。该杂合或双功能抗体可如所述，通过生物学细胞融合技术或化学方法(特别是交联剂或二硫键形成试剂)得到，并可包含其抗体和/或其片段。例如，1983年10月27日出版的PCT申请W083/03679以及1987年4月8日的已公布的欧洲申请EPA0217577,公开了获得该杂合抗体的方法。特别优选的双功能抗体是从〃多巢〃或〃细胞杂交瘤〃生物学制备的，或者利用交联剂诸如双-(马来酰亚胺)甲醚(〃BMME〃)或本领域技术人员熟悉的其它交联剂合成制备。另外免疫球蛋白可能是单链抗体(〃SCA〃)。其可包含单链Fv片段(〃scFv〃)，其中轻链可变结构域(〃V[L]〃)和重链可变结构域(〃V[H]〃)通过肽桥或二疏键连接。免疫球蛋白还可包含具有抗原结合活性的单独的V[H]结构域(dAbs)。例如参见G.Winter和C.Milstein，A^t〃re349z^^5"(7^^6>//P.Glockshuber等人，5ioc力e范ist2T29.-广7，入-以及E.S.Ward等人，〃at譜組.'5"本发明特别优选使用嵌合单克隆抗体，优选对肿瘤相关抗原具有特异性的嵌合抗体。实施例所用术语〃嵌合抗体〃是指通常利用重组DNA技术制备的、包含来自一种来源或物种的可变区(即结合区)以及至少一部分来自不同来源或物种的恒定区的单克隆抗体。本发明的某些应用，特别是人的治疗，优选包含鼠可变区以及人恒定区的嵌合抗体，因为该抗体易于制备，并可能比完全的鼠单克隆抗体免疫原性更低。该鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段以及编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段的免疫球蛋白基因的表达产物。本发明包含的其它形式的嵌合抗体是原始抗体的类别或亚类已经修饰或改变的抗体。该"嵌合〃抗体也指"类别转换的抗体"。制备嵌合抗体的方法包括本领域当前熟知的常规重组DNA和基因转染技术。例如参见Morrison,S.L等人，Proc.NatlAcad.Sci.，81，6851(1984)。术语〃嵌合抗体〃包含〃人源化抗体〃的概念，即构架或〃互补性〃决定区(〃CDR〃)已被修饰，以包含与亲代免疫球蛋白特异性不同的免疫蛋白的CDR的抗体。优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区，以制备〃人源化抗体〃。例如参见L.Riechmann等人，yVa^/re332,323(1988);M.S.Neuberger等人，淑,268(1985)。特别优选的CDR对应于嵌合和双功能抗体识别上述抗原的代表序列。读者可参考EPA0239400(出版于1987年9月30日)中有关CDR修饰的抗体的教导。本领域技术人员应当承认，可以制备双功能-嵌合抗体，其具有嵌合抗体或人源化抗体的较低免疫原性的优点，以及上述双功能抗体的灵活性，特别是对于治疗的灵活性。例如利用交联剂化学合成和/或上述的重组方法，可以合成该双功能-嵌合抗体。无论如何，本发明不应被理解为局限于通过任何特定的方法制备抗体的范围内，不论是双功能的、嵌合的、双功能-嵌合的、人源化的抗体或抗原识别片段或其衍生物。此外，在本发明范围内包含免疫球蛋白(如上所述)或免疫球蛋白片段，其融合了活性蛋白质，例如Neuberger等人1986年3月13日发表的PCT申请W086/01533中公开的类型的酶。该公开内容于此处引入作为参考。如上所述，〃双功能的〃、〃融合的〃、〃嵌合的〃(包括人源化的)以及〃双功能-嵌合的〃(包括人源化的)抗体构建体，也包括在其各自范围内包含抗原识别片段的构建体。本领域技术人员应当承认，该片段可以利用传统的酶解完整的双功能的、嵌合的、人源化的或嵌合-双功能抗体的方法制备。然而，如果完整的抗体由于所涉及构建物的本性而对降解不敏感，可以利用免疫球蛋白片段为原始材料制备所述构建物；或者，如果利用重组技术，可以使DNA序列本身适于编码目的〃片段〃，其被表达以后，可以在体内或体外通过化学或生物学方法组合，以制备最终所需的完整的免疫球蛋白〃片段〃。因此，在该背景下使用术语〃片段"。此外，如上所述，本发明所用的免疫球蛋白(抗体)或其片段本质上可能是天然的多克隆或单克隆的。然而优选的免疫球蛋白是单克隆抗体。本领域技术人员目前熟知多克隆或单克隆抗体的制备方法，他们当然完全能够制备可用于本发明的有用的免疫球蛋白。例如参见G.189Kohler和C.Milstein，；Vatwe25^..(797"。此外，杂交瘤和/或通过该杂交瘤制备的用于实现本发明的单克隆抗体可公开获得，例如以美国典型培养物保藏中心(〃ATCC〃)10801UniversityBlvd.,Manassas,VA.20110。用于本发明的单克隆抗体特别优选识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体。诊断技术血清学诊断技术包括检测和定量分泌到或？克"到据认为是患癌病人的血清或其它生物学液体中的胂瘤相关抗原。可以利用本领域已知技术，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测体液中的该抗原，其中利用与〃流出〃抗原反应的抗体检测流体样品中存在的抗原[例如参见Uotila等人，〃Two-SiteSandwichELISAWithMonoclonalAntibodiesToHumanAFP〃，/./迈迈w7/20丄^^77G^9"以及Allum等人，前文48-51页]。因此，利用此处公开的C35抗体进行的这些测定，可以用于检测生物学流体中与C35抗体反应的抗原，从而检测病人中的癌。因此根据上文显而易见，本发明的C35抗体可用于涉及抗原抗体反应的大多数试验。这些试验包括而不限于标准的液相和固相RIA技术、ELISA试验、ELISP0T、免疫荧光技术及其它的免疫细胞化学试验[例如参见Sikora等人(eds.)，MonoclonalAntibodies,pp.32-52(BlackwellScientificPublications7術J,本发明也包括进行上述试验的诊断试剂盒。一个实施方案中，诊断试剂盒包含本发明的C35单克隆抗体、其片段、融合蛋白质或嵌合抗体，以及包含C35抗体的特异性结合配偶体和能够产生可检测信号的标记物的缀合物。试剂还可包括辅助试剂，例如緩冲剂和蛋白质稳定剂(例如多糖)。必要时诊断试剂盒可进一步包含信号产生系统的其它组分，包括降低背景干扰的试剂、对照试剂或进行测试的装置或容器。另一实施方案中，诊断试剂盒包含本发明C35抗体和能够产生可检测信号的标记物的缀合物。也可以包含上述的辅助试剂。本发明C35抗体也可用于人癌检测的体内诊断应用。该方法之一涉及通过肿瘤造影技术体内检测肺瘤。根据该方法，用能产生可检测信号的合适造影剂标记C35抗体。可以使用的造影剂的例子包括而不限于，放射性标记例如〈131〉I，<111>In，〈123〉I，〈99m〉Tc，<"^>尸，OH，and〈14〉C，荧光标记例如荧光素和罗丹明，以及化学发光剂例如虫萤光素。可利用本领域已知技术用该试剂标记抗体。例如有关抗体放射标记技术参见Wensel和Meares，RadioimmunoimagingAndRadioimmunothempy，Elsevier,NewYorkf房^[也参见Colcher等人，〃UseOfMonoclonalAntibodiesAsRadiopharmaceuticalsForTheLocalizationOfHumanCarcinomaXenograftsInAthymicMice〃，^yzyi"/7o丄7i7.-6V9i"-7《(7卿j乂就放射性标记抗体而言，给予病人抗体，定位到具有与该抗体反应的抗原的肿瘤，并利用已知技术(诸如利用例如y照相机或发射断层术进行放射性核的扫描)体内检测或〃造影〃[例如参见Bradwell等人，"DevelopmentsInAntibodyImaging",MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin夢乂(Ws.人pp.65"-《5"(AcademicPress7^^乂给予病人在药物可接受的载体(诸如水、盐、Ringer's液、Hank's液或非水载体如不挥发油)中的抗体。载体也可包含增强抗体等渗性和化学稳定性的物质，例如緩沖液或防腐剂。抗体制剂是通过例如静脉内给药，其剂量足以提供足够的Y发射而使肺瘤目标位点可见。在给予抗体和检测之间应有足够时间，使之完成肿瘤目标定位。肺瘤造影的一般讨论参见Allum等人，前文51-55页。C35抗体的治疗应用C35抗体的特性适于许多体内的治疗应用。首先，C35抗体能够单独用于体内耙向和杀伤胂瘤细胞。该抗体还可以与合适的治疗剂联用，治疗人类癌症。例如，该抗体可与标准或常规治疗方法诸如化疗、放疗联用，或者缀合或连接治疗药物或毒素，以及淋巴因子或肿瘤-抑制生长因子，将治疗剂传递到癌位点。将治疗剂与抗体缀合的技术众所周知[例如参见Amon等人，"MonoclonalAntibodiesForI咖unotargetingOfDrugsInCancerTherapy〃，MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等人，〃AntibodiesForDrugDelivery〃，ControlledDrugDelivery(2ndEtL)，Robinson等人(eds.),pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,〃AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview〃，MonoclonalAntibodies，84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985);以及Thorpe等人,〃ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.，62:119-58(1982)]。另外，C35抗体可结合高能辐射，例如放射性同位素如〈131〉1,其定位于肺瘤位点时引起数个细胞直径的杀伤[例如参见Order,"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(AcademicPress1985)]。根据另一实施方案，C35抗体可缀合另一抗体，形成治疗肿瘤细胞的抗体杂缀合体(如Segal在美国专利编号4，676，980中所述)。本发明C35抗体的其它治疗应用还包括，例如通过重组DNA技术缀合或连接能将前体药物转变为细胞毒药物的酶，以及该抗体-酶缀合物与前体药物结合，在肺瘤位点将前体药物转变为细胞毒药物的用途[例如参见Senter等人，〃Anti-T體orEffectsOfAntibody-alkalinePhosphatase",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4842—46(1988);192"EnhancementoftheinvitroandinvivoAntitumorActivitesofPhosphoiylatedMitocycinCandEtoposideDerivativesbyMonoclonalAntibody—AlkalinePhosphataseConjugates",CancerResearch49:5789-5792(1989);以及Senter，"ActivationofProdrugsbyAntibody—EnzymeConjugates:ANewApproachtoCancerTherapy,〃FASEB14:188-193(1990)]。C35抗体的另一治疗应用还包括，在补体存在下或作为抗体-药物或抗体-毒素偶联物的一部分，从癌症病人的骨髓中除去肿瘤细胞的应用。依据这种方法，自体骨髓可通过该抗体处理而离体净化，然后骨髓被回输给病人[例如参见Ramsay等人，〃BoneMarrowPurgingUsingMonoclonalAntibodies",J.Clin.Immunol.,8(2):81-88(1988)]。此外，前述本发明嵌合C35、重组免疫毒素及其它重组构建体，其包含C35单克隆抗体的抗原结合区特异性，如前所述，可用于治疗。例如本发明的单链免疫毒素，可用来治疗人体内的癌。类似地，至少包含C35抗体的抗原结合区(其至少与具有抗肺瘤活性的另一蛋白质(例如淋巴因子或制瘤素)的功能活性部分连接)的融合蛋白质，可用于治疗人体内的癌。此外，本领域已知的重组技术可用于构建双特异性抗体，其中该抗体的一种结合特异性是C35的结合特异性，而另一种结合特异性是除C35以外分子的结合特异性。最后，C35抗体的抗独特型抗体可用于主动肺瘤免疫和肺瘤治疗[例如参见Hellstrom等人,〃ImmunologicalApproachesToTumorTherapy:MonoclonalAntibodies,TumorVaccines,AndAnti—Idiotypes〃，CovalentlyModifiedAntigensAndAntibodiesInDiagnosisAndTherapy,前文35-41页]。本发明提供了选择性杀伤表达特异性结合C35单克隆抗体或功能等价物的抗原的肺瘤细胞的方法。该方法包含使所述肺瘤细胞与本发明的免疫缀合物(例如免疫毒素)反应。这些肺瘤细胞可来自人类癌症。包含给予患者药物有效量的包含至少一种本发明免疫缀合物(例如免疫毒素)的组合物。根据本发明的实践，患者可能是人、马、猪、牛、鼠、犬、猫和鸟。其它温血动物也包括在本发明内。本发明也提供治疗癌症患者的方法。患者可以是人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊、牛、鸡。癌症可为乳腺癌、膀胱癌、视网膜母细胞瘤、卵巢乳头状嚢腺癌、Wilm's肿瘤或小细胞肺癌，通常其特征为细胞表面具有肿瘤相关抗原的一群细胞。该方法包含给予患者癌症杀伤剂量的与细胞毒剂连接的肺瘤靶向抗体。通常，在允许抗体与其细胞表面目标结合的条件下，将肺瘤耙向抗体与细胞毒剂结合。通过与其目标结合，胂瘤靶向抗体直接或间接导致或促进杀伤所结合的细胞，从而治疗患者。本发明还提供了抑制哺乳动物肺瘤细胞增殖的方法，其包含将哺乳动物肺瘤细胞与足够浓度的本发明的免疫缀合物接触，以抑制哺乳动物肺瘤细il包的增殖。本发明另外提供了抑制人肿瘤细胞生长、治疗患者肿瘤以及治疗患者增殖型疾病的方法。这些方法包含给予患者有效量的本发明组合物。因此显然本发明包含治疗人类癌症的药物组合物、组合和方法。例如，本发明包括用于治疗人类癌症的药物组合物，其中包含药物有效剂量的C35抗体和药物可接受的载体。该组合物可包含未^f參饰的、与治疗剂缀合的(例如药物、毒素、酶或另一抗体)或者重组形式(例如嵌合的C35、嵌合C35的片段、双特异性C35或单链免疫毒素C35)的C35抗体或抗体片段。该组合物另外可包括用于治疗癌症的其它抗体或缀合物(例如抗体混合物)。本发明的抗体、抗体缀合物和免疫毒素组合物可利用常规给药方式给药，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴内给药或直接注射到肿瘤内。优选静脉内给药。本发明的组合物可以是各种剂型，包括而不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、栓剂、聚合微胶嚢或微嚢、脂质体以及可注射或输注的溶液。优选的形式取决于给药方式和治疗应用。本发明的组合物还优选包括本领域已知的常规药物可接受的载体和佐剂，诸如人血清白蛋白、离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、緩冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾以及盐或电解质如硫酸鱼精蛋白。本发明组合物的最有效给药方弍和剂量方案取决于疾病的严重性和病程、病人的健康状态和对治疗的反应，以及治疗医师的判断。因此，组合物的剂量应当针对单个病人确定。然而，本发明组合物的有效剂量可在大约1-2000mg/kg范围内。此处所述分子可以是各种剂型，包括而不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、栓剂、聚合微胶嚢或微嚢、脂质体以及可注射或输注的溶液。优选的形式取决于给药方式和治疗应用。本发明分子的最有效给药方式和剂量方案取决于所治疗肿瘤的部位、癌症的严重性和病程、患者的健康状态和对治疗的反应，以及治疗医师的判断。因此，该分子的剂量应当针对单个患者确定。Freireich，E.J.等人CancerChemother.，Rep.50(4):219-244(1966)描述了基于mg/kg体表面积各种大小和物种的动物与人的剂量相互关系。调整剂量方案可优化肿瘤细胞生长抑制及杀伤反应，例如可以分开剂量并按日给药，或者根据情况按比例降低剂量(例如几个分剂量按日给药，或者根据特定的治疗情况按比例降低)。显然，完成治疗所需的本发明组合物的剂量可以按预定优化进一步降低。依照本发明的实施，该药物载体可以是脂类载体。该脂类载体可以是磷脂。另外，该脂类载体可以是脂肪酸。该脂类载体还可以是去污剂。此处所用去污剂是改变(一般是降低)液体表面张力的任何物质。本发明的一个实施例中，去污剂可以是非离子型去污剂。非离子型去污剂的例子包括而不限于多乙氧基醚(又名Tween80或(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯))、Brij和Triton(例如TritonWR—1339和Triton195A-20)。另外，该去污剂可以是离子型去污剂。离子型去污剂的例子包括而不限于烷基三甲基溴化铵。另外，依照本发明，该脂类载体可以是脂质体。本申请所用〃脂质体〃是包含本发明任何分子或其组合的任何膜结合的嚢。疫苗制剂利用重组DNA方法可大量制备C35表位，并与促进细胞介导免疫应答的佐剂配剂。本发明包括在真核或原核重组表逸载体中表达C35多肽或C35表位(包括细胞毒性或辅助T细胞诱导的表位)；以及与免疫原性和/或抗原性组合物相同的制剂。例如，美国专利申请号08/935，377描述了该组合物，在此全文引入供参考。根据本发明，重组表达的C35表位可以作为亚单位疫苗进行表达、纯化和配制。优选地，编码C35表位的DNA也可构建到病毒载体中，优选痘病毒、腺病毒、疱奢病毒和甲病毒载体，用于疫苗。在这方面可以配制活的、灭活的或杀死的重组病毒疫苗。(i)在原核和真核表达系统中表达C35统。C35表位可以表达为截短的或全长形式，特别是用于组成亚单位疫苗。本发明包含表达编码C35多肽及免疫学等价片段的核苷酸序列。可通过制备编码鉴定表位(在该序列5'和/或3'端截短和/或具有一个或多个内部缺失)的核苷酸序列的类似物、表达该类似物核苷酸序列、以及确定所得片段是否受表位特异性T淋巴细胞免疫识别并诱导细胞介导免疫应答、或受表位特异性B淋巴细胞识别以诱导体液免疫应答，从而鉴定该免疫学等价片段。本发明包括含有任何上述编码序列(可操作性地连接有指导编码196操作性地连接有在宿主细胞中指导编码序列表达的调节元件)的基因工程宿主细胞。此处所用调节元件包括而不限于可驱动并调节表达的可诱导型和非诱导型启动子、增强子、搡作子及本领域技术人员已知的其它元件。可以利用本领域公知的方法，通过重组DNA技术制备C35表位的基因产物或其肽片段。因此，此处描述了通过表达包含表位基因序列的核酸，来制备本发明C35表位基因多肽和肽的方法。本领域技术人员公知的方法可用于构建包含表位基因产物编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。例如参见Sambrook爭人，在MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,以及A画bel等人，1989，前文中所述技术。另外，可以利用例如合成仪，化学合成能够编码糖蛋白表位基因产物序列的RNA。例如参见〃01igo庶leotideSynthesis",1984，GaitM.J.ed.，IRLPress,Oxford所述技术，在此全文引入供参考。本发明也包含编码C35表位基因产物肽片段的核苷酸序列。例如，对应于C35表位胞外结构域的多肽或肽可用作促进分泌的〃可溶性〃蛋白质，特别是用于制备亚单位疫苗。C35表位基因产物或其肽片段(可以与识别商品化的抗体的异源表位相连接)也包括在本发明之内。也可制备耐久的融合蛋白质；即C35表位序列和异源蛋白质序列之间具有裂解位点的融合蛋白质，因此可以将所选的C35与异源部分分开。例如，可以在C35表位蛋白质或肽与异源肽或蛋白质之间制造胶原酶裂解识别的共有序列。通过胶原酶处理，可以从该融合蛋白质中释放表位结构域。本发明的优选实施方案中，可以制备谷胱甘肽-S-转移酶与C35表位的融合蛋白质。本发明用于疫苗制剂，特别是亚单位疫苗制剂的C35表位蛋白质，基本上是纯的或同质的。至少60-75%的样品呈现单一多肽序列时，可认为该蛋白质基本上是纯的或同质的。基本上纯的蛋白质优选包含60-90%、更优选大约95%、最优选99%的蛋白质样品。可用本领域技术人员公知的方法确定蛋白质纯度或同质性，诸如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳、然后在染色凝胶上显现单一的多肽条带。可利用本领域公知的HPLC或其它类似方法，确定更高的分辨率。本发明包含的C35多肽，其一般从表达编码这些蛋白质的重组核苷酸序列的宿主细胞中纯化。利用本领域公知的各种方法完成该蛋白质的纯化。优选实施方案中，本发明的C35表位蛋白质表达为与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白质。利用亲和层析纯化得到的重组融合蛋白质，表位蛋白质结构域与异源部分断裂，得到基本上纯的蛋白质样品。可利用本领域技术人员所知的其它方法；例如参见〃MethodsInEnzymology〃，1990，AcademicPress,Inc.，SanDiego，〃ProteinPurification:PrinciplesandPractice",1982，SpringerVerlag，NewYork中所述技术，在此全文引入供参考。(ii)真核和原核表达载体统。各种宿主-表达载体系统可用于表达本发明的C35表位基因。该宿主-表达系统代表载体，通过它可以制备C35编码序列并进行随后纯化，也代表用C35核苷酸编码序列转化或转染后、可原位呈现本发明C35表位基因产物的细胞。其包括而不限于，用包含C35表位基因产物编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的表达载体转化的微生物如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis));用包含C35表位基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia));用包含C35表位基因产物编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含C35表位基因产物编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)感染或者重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(例如C0S、CH0、BHK、293、3T3)，其中带有包含来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。(iii)宿主细胞本发明包含在动物和昆虫细胞系中表达C35表位。本发明的优选实施方案中，C35表位在昆虫细胞系中杆状病毒载体上表达，以制备非糖基化抗原。本发明的另一优选实施方案中，在稳定转染的哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞系)中表达C35表位，以制备糖基化抗原。这些细胞系重组表达的C35表位可以配制成亚单位疫苗。本发明另外涉及过表达C35基因产物的宿主细胞。该细胞可以是利用任何合适载体瞬时或者稳定转染或转化的宿主细胞，载体中包括编码C35多肽或其片段的多核苷酸序列，以及指导C35基因产物过表达的合适启动子和增强子序列。然而，过表达的细胞也可以是插入(例如通过同源重组)指导内源性C35基因过表达的异源启动子或增强子的产物。术语〃过表达〃是指其它条件都相同时，表达水平高于给定细胞特征性的基础表达水平。可以选择调节插入序列表达、或以所需特定方式修饰和加工C35基因产物的宿主细胞抹。蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如分裂)对该蛋白质的功能可能很重要。不同的宿主细胞具有特征的和特定的蛋白质及基因产物翻译后加工和修饰的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以保证所表达的外源蛋白的正确修饰。为此，可以利用具有可适当加工始转录、对C35基因产物糖基化、磚酸化和异戊二烯化的细胞器的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括而不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和W138细胞系。为长期、高产量制备重组蛋白质，优选稳定型表达。例如，可以制备稳定表达C35目标表位的细胞系。除了利用包含病毒复制起点的表达载体，可以利用合适的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA以及选择标志转化宿主细胞。引入外源DNA后，可使改造的细胞在丰富培养基中生长l-2天，然后转到选择性培养基。重组质粒的选择标志提供选择抗性，使细胞将质粒稳定整合到染色体中，形成基因座，随后被克隆并扩增到细胞系中。此方法可方便地用于制备细胞系。此方法可方便地用于制备表达C35表位基因产物的细胞系。该细胞系可特别用于筛选和评价影响C35表位基因产物内源活性的化合物。可以利用多种选择系统，包括而不限于单纯疱奢病毒胸苷激酶(Wigler爭乂，"7乙6W7J7:i^入次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，7，，尸潔.淑丄y4cad5"ci.,4&^Z^人以及腺噤呤磷酸核糖转移酶"o盯爭入，7P《"^";67"基因，其可以分别用于tkf、hgprt—或aprt—细胞。还可以利用抗代谢物抗性为基础选择以下基因提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler爭人，7卿尸潔.淑丄爿cad5""',編〃:驚乙.0'Hare夢人，796%〃a〃./4cad5"cj'.〃SJ7"J5^",提供霉酚酸抗性的gpt(Mulligan&Berg，，7,尸roc.淑丄y4cad5"c,脂7"6V^7力,'炎供^差潜茅"-47"在遂^neo(Colberre-Garapin夢入，7967,/.A'o丄,以及提供潮霉素抗性的hygro(Santerre爭人，，《复'""。另外，利用特异性针对所表达的融合蛋白质的抗体，可以很容易纯化任何融合蛋白质。例如，Janknecht等人描述的系统允许迅速纯化人细胞系中表达的未变性融合蛋白质(Janknecht夢人，799/,尸roc.〃at丄^cad5"c义〃6^6，6V6^ZSS^76"入该系统中，将目的基因亚克隆到牛痘重组质粒，使该基因的开放阅读框架可翻译地与包含6个组氨酸残基的氨基端标记融合。将经重组痘苗病毒感染的细胞的提取物，上样到^2+*氮川乙酸-琼脂糖柱上，用包含咪唑的緩冲液选择性洗脱组氨酸-标记的蛋白质。(iv)重组病毒疫苗中C35表位的表达本发明的另一实施方案中，能够制备表达C35表位的活重组病毒疫苗或灭活重组病毒疫苗。优选活疫苗，因为其在宿主中扩增导致与自然感染种类和大小相似的剌激延长，因而提供大量、持久的免疫力。可以利用在细胞培养或鸡胚尿嚢中繁殖病毒、并随后纯化的常规方法进行重组活病毒疫苗制剂的制备。在这方面，多种基因工程病毒可以表达C35表位。对于疫苗来说，其可能需要具有减毒特性的重组病毒。当前供人使用的是耐冷、热敏或减毒的活病毒疫苗。在用于转染的模板中引入合适的突变(例如缺失)，可提供具有减毒特性的新病毒。例如，与温度敏感性或寒冷适应性有关的特定的多重错义突变，能够制成缺失突变和/或多重突变，其可引入各个病毒基因中。这些突变体应该比包含单一点突变的冷敏或温度敏感突变体更稳定，回复频率应该非常低。另外，可构建具有〃自杀〃特性的重组病毒。此病毒在宿主中只经历一轮或几轮复制。为了本发明目的，具有以下特征的任何病毒可用于本发明(a)表现减毒表型或可改造为表现减毒表型特征；(b)表现对哺乳动物特别是对人的趋向性，或者可改造为表现这种趋向性；以及(c)可以改造为表达本发明的C35表位。牛痘病毒载体可用于本发明，因为大的DNA片段很容易被克隆到其基因组中并且重组减毒牛痘变体已有描述(Meyer爭乂，1991,J."朋.「/ro丄72:1031-1038)。正粘病毒，包括流感；副粘病毒，包括呼吸道合胞病毒和仙台病毒；以及弹状病毒可以改造为表达可产生减毒表型的突变("参见美国专利SerialNo.5，578，473，1996年11月26日颁发)。这些病毒基因组也可改造为表达外源核苷酸序列，例如本发明的C35表位(参见美国专利SerialNo.5，166，057,1992年11月24日颁发，在此全文引入以供参考)。可以应用反向遗传学技术操作负链或正链RNA病毒基因组，以引入可产生减毒表型的突变，例如在流感病毒、单纯疱渗病毒、巨细胞病毒和EB病毒、新培斯病毒以及脊髓灰质炎病毒中所示(参见Palese爭乂，1996，〃a〃.ZcaoC6"c/.〃W93:11354-11358)。这些技术也可用于引入外源DNA(即C35表位)，以制备用作本发明疫苗的重组病毒载体。例如参见美国专利申请号08/935,377，在此全文引入以供参考。此外，可以改造减毒腺病毒和逆转录病毒，以表达C35表位。因此，可以改造多种病毒，以设计本发明的疫苗，然而，通过而不受限于实施例，此处描述了表达C35表位、用作疫苗的重组减毒牛痘载体。一个实施方案中，重组修饰的牛痘变体、修饰的安卡拉病毒(ModifiedVirusAnkara,MVA)用于疫苗制剂。此修饰的病毒已经在鸟类细胞中传代500次，不能在哺乳动物细胞中进行完整的感染周期。(Meyer爭入，7997,,"e".7么'76^71038)。用作疫苗时，重组病毒经历单个复制周期，并诱导足够水平的免疫应答，而不在人类宿主中继续生存并导致疾病。缺少一种或多种牛痘病毒必需基因的重组病毒不能进行连续的复制循环。通过与缺少病毒复制所需特定基因的牛痘载体共转染永久表达该基因的细胞系，可以制备该缺陷病毒。缺少必需基因的病毒将在这些细胞系中复制，但给与人类宿主时，将不能完成一轮复制。该制剂可在此无效循环中转录和翻译足量的基因，以诱导免疫应答。另外，可以将大量毒抹给药，因此这些制剂可作为灭活(死)病毒、疫苗。对于灭活疫苗，优选表达异源C35基因产物作为病毒组分，因此C35基因产物与病毒颗粒有关。该制剂的优点在于其包含天然蛋白质，无需用福尔马林或者其它用于制备死病毒疫苗的试剂处理，进行灭活。本发明另一实施方案中，利用常规方法〃杀死〃重组病毒，制备灭活疫苗制剂。灭活疫苗是〃死的〃是指其感染性已被破坏。理想地是破坏病毒的感染性，而不影响免疫原性。为了制备灭活疫苗，重组病毒可在细胞培养物或者鸡胚尿嚢中生长，区带超速离心法纯化，甲醛或者p-丙内酯灭活，并混合。获得的疫苗通常肌内接种。为了增强免疫应答，灭活病毒可与合适的佐剂组合使用。佐剂可包括而不限于矿物凝胶，例如氬氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子；肽；寡核苷酸、油乳剂；以及具有潜在用途的人类佐剂，例如BCG和短小棒状杆菌^b2T"e力acteri〃迈parr〃迈人(v)治疗和/或接种方法本发明的C35表位可以大量制备，因此制备和纯化的抗原可用作疫苗制剂。C35表位可配制成亚单位疫苗制剂，或者可制备到病毒载体中并配制成疫苗制剂。另外，编码C35表位的DNA可作为疫苗制剂直接给药。一旦给予患者的〃棵〃质粒DNA侵入细胞、表达、加工成肽片段，其中一些可与MHC分子联合存在于所侵入细胞的表面，并诱导细胞免疫应答，以致T淋巴细胞会攻击展示C35表位的细胞。C35表位也可用于诊断，例如检测或者测量患者体液样品中表达C35的肿瘤的存在或者由表达C35的肺瘤诱导的抗体或T细胞的存在，并因而诊断癌症和肺瘤和/或监测患者在接种之后的细胞免疫应答。本发明的重组病毒可用于治疗带有肿瘤的哺乳动物，包括人类，以产生针对胂瘤细胞的免疫应答。产生足够并合适的免疫应答，导致体内肺瘤退化。这种〃疫苗〃能够单独使用或者与其它用于肿瘤治疗方法(包括而不限于化疗、放疗、手术、骨髓移植等)联合使用。例如，可用手术或放射技术缩小肺块，然后给予本发明的疫苗制剂，以确保退化并防止剩余胂瘤团块发展或在体内微转移。另外，〃疫苗〃给药可先于手术、放疗或化疗。另外，本发明的重组病毒可用于免疫或〃接种〃没有肿瘤的个体，以防止肿瘤生成。随着遗传检验的出现，现在有可能预测个体对某些癌症的诱因。因此，这种个体可以利用表达C35抗原的重组牛痘病毒进行免疫。可以通过监测试验动物免疫后的免疫应答，或者利用本领域已知的任何免疫测定方法，确定C35表位疫苗制剂的致免疫力。产生细胞介导和/或体液免疫应答可作为免疫应答的指征。试验动物可包括小鼠、仓鼠、犬、猫、猴、兔、黑猩猩等，以及最后人类受试者。合适的该疫苗制剂包括可注射的液体溶液或者悬浮液；也可制备成适合注射前溶解、悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以乳化，或将多肽包在脂质体中。活性的免疫原性成分常常与药物可接受的、并与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如水、盐、葡203萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗制剂还可包括小量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH緩冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。有效佐剂的例子包括而不限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1，-2，-二棕榈跣-锡-甘油-3-hyd丽yphosphoryloxy)-乙胺、GM-CSF、QS-21(研究性物，ProgeniesPharmaceuticals,Inc.)、DET0X(研究性药物，RibsPharmaceuticals)、BCG以及CpG丰富的寡核苷酸。通过测定诱导针对C35表位的细胞免疫应答，可确定佐剂的有效性。本发明的疫苗可以是多价或单价的。多价疫苗由指导一种以上的抗原表达的重组病毒制成。优选的多价疫苗包含细胞毒T细胞以及辅助T细胞的多个表位。如果需要，组合物还可以包含小量的湿润剂或乳化剂、或pH緩沖剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、缓释制剂、或粉末。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。通常，这些成分分别或以混合成单元剂型提供，例如装在标明活性剂数量的密闭容器(诸如安瓿或小袋(sachette))中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物。组合物经注射给药时，可提供一安瓿无菌稀释剂，以在给药之前混合成分。特定的实施方案中，一个容器中提供冻干的本发明C35表位；另一个容器包含稀释剂，其由50%甘油、0.25%笨酚和防腐剂(例如O.005%亮绿)的水溶液组成。可以利用标准方法使用纯化的C35抗原作为疫苗制剂。例如，应将纯化的C35表位调整为合适浓度、与任何合适的疫苗佐剂组合、并包装以供使用。合适的佐剂可包括而不限于矿物凝胶，例如氬氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、多聚醇；聚阴离子；肽；油乳剂；204明矾和MDP。免疫原也可掺入到脂质体、或与多醣和/或其它聚合物缀合，供疫苗制剂之用。重组抗原是半抗原(即具有抗原性，可以选择性与相关的抗体反应，但没有免疫原性，不能引起免疫应答的分子)的情况下，半抗原可与载体或免疫原性分子共价结合；例如，大蛋白质诸如血清白蛋白，可以赋与之结合的半抗原免疫原性。半抗原-载体可配成疫苗。很多方法可能用来将上述疫苗制剂引入病人。包括而不限于口腔的、皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、透皮的、硬膜外的、肺的、胃的、肠的、直肠的、阴道的或尿道的途径。治疗方法使用本发明的重组活牛痘疫苗时，可优选的通过牛痘病毒的天然感染途径引入该制剂，即通过粘膜或表面，例如口的、鼻的、胃的、肠的、直肠的、阴道的或尿道的途径，或者通过皮肤。为了诱导CTL应答，可通过口或鼻的粘膜给药途径。另外，可利用肌内或腹腔内给药途径。人类患者给药优选剂量106-107PFU(噬斑形成单位)的耐冷重组牛痘病毒。制剂中所用疫苗制剂的准确剂量还取决于给药途径和患者的性质，并应根据专业人员的判断以及按标准临床技术的每个患者状况来决定。有效的免疫量是足以对给予疫苗制剂的宿主中抗原产生免疫应答的量。需要后续或加强剂量时，可以选择修饰的牛痘病毒例如MVA作为亲代病毒，用于产生重组体。另外，其它病毒例如腺病毒、金丝雀痘病毒或亚基制剂可用于加强免疫。可以利用联合免疫方案，例如利用本发明重组牛痘病毒疫苗进行免疫并用重组腺病毒疫苗加强，实现免疫和/或癌症的免疫治疗。在这样的实施方案中，初次免疫并用表达相同表位的不同病毒加强免疫以后，诱导强的继发的CD8+T细胞应答(有关该免疫和加强的方法参见，例如M眼ta爭乂，CellularImmunol.7".A^107)。例如，患者首先用本发明的包含表达表位(例如选择的肿瘤相关抗原或其片段)的重组牛痘病毒疫苗制剂初次免疫。然后，例如21天以后，利用包含表达相同表位的牛痘以外的重组病毒对患者205加强免疫。这种初次免疫继之加强免疫，诱导强的继发的T细胞应答。这种初级并加强免疫方案将优选用于治疗患有表达肿瘤相关抗原(例如C35)的胂瘤、转移瘤或成瘤性生长的患者。另一实施方案中，重组牛痘病毒可用作经灭活的肺瘤细胞、包含C35抗原或其表位的亚单位疫苗、或其它重组病毒疫苗(例如腺病毒、金丝雀痘病毒或MVA)初级免疫后的加强免疫。另一实施方案中，编码C35表位或其片段的重组牛痘病毒可用于过继性免疫疗法，以活化与患者具有组织相容性并对C35抗原特异的T淋巴细胞(有关过继性免疫疗法参见，例如Rosenberg，美国专利No.4，690，915,1987年9月1日颁发；Zarling等人，美国专利号5,081,029，1992年1月14日颁发)。可以从患者或组织相容性供者中分离这种T淋巴细胞。通过接触本发明的重组牛痘病毒体外活化该T淋巴细胞。活化的T淋巴细胞扩增并接种给患者，以传递针对C35抗原表位的T细胞免疫。本发明也提供包含一种或多种容器的药物包装或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的疫苗制剂成分。该容器带有按管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通知，其反映该机构批准用于人的生产、使用或销售。癌症诊断和预后有两种类型基因影响肿瘤发展。一类基因是通过DNA水平改变(例如突变)直接作用而影响癌症表型，例如BRCA1、BRCA2和p53。另一类基因通过调节表达水平而影响表型。乳腺癌的发展以及继发的恶性发展与多种两类基因的改变有关。鉴定恶性乳腺中基因表达的量变化，如果特征充分，可得到新的分子标志，其可用于人类乳腺癌的诊断和治疗。本发明者已经鉴定了一个新的乳癌标志C35，其在原发性浸润的乳腺导管癌细胞中差异表达。正常乳腺上皮细胞中C35的低水平表达提示C35过表达表明乳腺癌恶性发展。有可能在某些其它组织类型，包括膀胱和肺的胂瘤中，C35也可能过表达。本发明者已经证明，具有癌症的哺乳动物中的某些组织，与相应的〃标准〃哺乳动物(没有癌症的相同物种哺乳动物)相比，C35蛋白质及其编码mRNA的表达水平显著增强。另外，认为与没有癌症的相同物种哺乳动物的血清相比，可以在生有癌症的哺乳动物的某些体液(例如血清、血浆、尿和脊髓液)中检测到水平提高的C35蛋白质、或特异性针对其的抗体或淋巴细胞。因此，本发明提供可用于肝瘤诊断的诊断方法，其中包括测定哺乳动物细胞或体液中编码C35蛋白质的基因的表达水平，并将该基因表达水平与标准C35基因表达水平相比较，基因表达水平超过标准则预示某些肺瘤。另外，可以确定血液或其它体液中C35蛋白质或C35多肽特异性的抗体或淋巴细胞的表达水平，与C35特异性的抗体或淋巴细胞的表达标准相比较。如果已经按常规方法进行肿瘤诊断，本发明可用于预后指示，相对于基因表达水平低的患者，显示C35基因表达增强的患者临床结果更差。通过〃测定编码C35蛋白质的基因的表达水平〃，意在直接(例如确定或评价绝对的蛋白质或mRNA水平)或相对(例如与另一份生物样品的C35蛋白质或mRNA水平相比)、定性或定量测定或评价一份生物样品中C35蛋白质或其编码C35蛋白质的mRNA的水平。优选地，测定或者评价一份生物样品的C35蛋白质水平或mRNA水平，并与标准的C35蛋白质水平或mRNA水平相比较，该标准取自从没有癌症的个体获得的另一份生物样品。本领域应当理解，一旦标准的C35蛋白质或mRNA水平已知，其可以重复用作比较标准。〃生物样品〃是指从包含C35蛋白质或mRNA的个体、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样品。生物样品包括含有分泌的成熟C35蛋白质的哺乳动物体液(例如血清、血浆、尿、滑液和脊液)，以及可能含有前体或成熟形式C35的卵巢、前列腺、心脏、胎盘、胰腺、肝、207脾、肺、乳腺、膀胱和脐带组织。本发明可用于检测哺乳动物的癌症。本发明特别用于诊断哺乳动物中下列类型的癌症乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、骨癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和脾癌。优选哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。特别优选人。禾寸用Chomczynski和Sacchi，Anal.iW0c力ejf/7.756—(7967^所述的疏氰酸胍-酚-氯仿一步法可提取生物样品的细胞总RNA。然后利用任何合适方法测定编码C35蛋白质mRNA的水平。其中包括Northern印迹分析(Harada爭人，M;加U726r9^",67核酸酶图谱(Fujita夢入，Ce〃4义'357-^67G^9"人聚合酶链式反应(PCR)、反转录结合聚合酶链式反应(RT-PCR)(Makino爭人，rec力/^》ue么-295-加7以及反转录结合连接酶链式反应(RT-LCR)。可利用基于抗体的技术测定生物样品的C35蛋白质水平。例如，可以利用经典的免疫组化方法研究C35蛋白质在组织中的表达(Jalkanen，V"爭入，/-Ce7/.^'o丄7。7..^;^-9《5"96^入Jalkanen，M.爭入，/.6W丄肠丄<歸("7卵7"。可用于检测C35蛋白质表达的基于抗体的其它方法包括免疫测定技术，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT和放射免疫测定(RIA)。合适的标记为本领域已知，并包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶，以及放射性同位素，例如碘(12511211)，碳("C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)，和锝(99raTc)，荧光标记例如荧光素和罗丹明，以及生物素。根据本领域已知方法，在通过抗原呈递细胞呈递的C35活化以后，可以在多种增殖和淋巴因子分泌测定中检测C35特异性的T细胞。结合可溶性MHC分子的C35肽表位的四聚体复合物，可以用于直接染色和计数细胞群体中的C35特异性T细胞(Lee，尸.尸.爭人，〃atz/reVe心cj7e5".W77-"5在此全文引入以供参考)。除了测定生物样品中的分泌蛋白质水平，还可以利用造影体内检测蛋白质。蛋白质体内造影的抗体标记或标志包括那些可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的标记或标志。X射线照相术的合适标记包括放射性同位素(例如钡或铯)，其发射可检测的射线，而不明显对患者有害。NMR和ESR的合适标志包括具有可检测的特征自旋的标志，例如氘，其可通过标记有关杂交瘤的营养物，而掺入到抗体。将利用可检测的合适造影成分(例如放射性同位素1311，112In，"mTc)、不透射线物质或核磁共振可检测物质标记蛋白质特异性抗体或抗体片段，导入(例如非肠道、皮下或腹膜内)哺乳动物中。本领域应当理解，患者大小及使用的成像系统将决定产生诊断造影所需造影成分的量。就放射性同位素成分而言，人类患者注射的放射性量正常为大约5-20毫居99mTc。然后该标记的抗体或抗体片段优先积累在包含特定蛋白质的细胞部位。体内肿瘤造影描述见S.W.Burchiel爭人，〃ImmunopharmacokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments.〃(7^迈ori历a^"i"/7f7"力eAWi"oc力e历ica7"ete"io/7ofCkncer第13章,5"LBurchiel和B.A.Rhodes,eds.,MassonPublishingInc.(1982).)融合蛋白质任何C35多肽可用于产生融合蛋白质。例如，融合另一种蛋白质的C35多肽可用作抗原性标记。针对C35多肽的抗体通过与C35结合，可用于间接检测另一种蛋白质。此外，由于分泌型蛋白质以通行信号为基础耙向细胞部位，C35多肽一旦与其它蛋白质融合，可用作乾向分子。可与C35多肽融合的结构域，其例子不但包括异源信号序列，还包括其它异源功能区。不一定需要直接融合，可以通过接头序列实现。某些优选实施方案中，可构建包括另外的N端和/或C端氨基酸残基的C35融合多肽。特别是此处公开的任何N-端或C-端缺失的C35多肽，可以通过N-端包含另外的氨基酸残基而制备C35融合多肽。此外，C35融合多肽可包括将另外的N端和/或C端氨基酸残基，与含有上述任何组合的N端和C端缺失的C35多肽融合。此外，可以改造融合蛋白质，以改善C35多肽的特性。例如，另外的氨基酸区域，特别是带电荷的氨基酸，可以添加到C35多肽的N端，以改善在从宿主细胞中纯化、或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。C35多肽也可添加肽成分以协助纯化。在C35多肽目的制剂之前，除去这些区域。添加肽成分以便于多肽处理，是本领域熟悉的常规技术。此外，C35多肽，包括片段和特定表位，能与免疫球蛋白(IgG)恒定结构域的一部分结合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白质促进纯化，并且体内半衰期增加。一个报告的例子描述了由人CD4多肽的前两个结构域以及哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白质。(EPA394,827;Tra匿cker爭人，淑〃jre(1988).)具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白质，与单体的分泌型蛋白质或单独的蛋白质片段相比，在结合并中和其它分子方面也更为有效。(Fountoulakis爭人，/^'oc力e历.270:3958—3964(1995).)类似地，EP-A-0464533(加拿大副本2045869)公开了包含免疫球蛋白分子恒定区各部分连同另一种人类蛋白质或其部分的融合蛋白质。多数情况下，融合蛋白质的Fc部分有利于治疗和诊断，因此可以导致，例如改善的药物动力学特性。(EP-A0232262.)另外，在融合蛋白质表达、检测和纯化后，可能希望缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白质用作免疫的抗原，Fc部分可能妨碍治疗和诊断。例如在药物研究中，已将人蛋白质如hlL-5，与Fc部分融合，目的是进行高通量篩选分析，以鉴定hlL-5的拮抗剂。(参见D.Bennett爭人，/.ifo7ecw7aryec柳i"o/78:52-58(1995);K.Johanson爭人，/胁丄C力e迈.270:9459-9471(1995).)此外，可将C35多肽融合标志序列，例如协助C35纯化的肽。优选的实施方案中，标志氨基酸序列是6个组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.,P，EtonAve騰，Chats爾th，CA，，")提供的标记，其中许多是商品化的。例如Gentz等人尸roc.^cadSci.M5"力6^,6^7-"^^(7^^>所述的便于纯化融合蛋白质的六聚组氨酸。用210于纯化的另一肽标记，〃HA〃标签，对应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位。(Wilson爭人，3:;7《7〃^^人J因此，利用C35多核苷酸或C35多肽，能够制备上述任何融合体。载体、宿主细胞和蛋白质制备本发明也涉及包含C35多核苷酸的载体、宿主细胞和通过重组技术制备C35多肽。载体可以是，例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制活性的或复制缺陷的。后者情况下，通常病毒繁殖只发生在互补的宿主细胞中。C35多核苷酸可与包含选择标志的栽体相连，以在宿主中繁殖。质粒载体一般在沉淀(例如磷酸钙沉淀)或具有带电脂类的复合物中导入。如果载体是病毒，其可能利用合适的包装细胞系体外包装，然后转导到宿主细胞。C35多核苷酸插入片段应该可搡作地连接合适的启动子，例如噬菌体kPL启动子、E.colilac、tip、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子，仅举几个例子。其它合适的启动子为熟练技术人员所知。表达构建体另外包含转录起始、终止位点，以及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的转录物编码部分优选包括开头的翻译起始密码子，以及在所翻译多肽末端适当位置的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。如上表明，表达载体优选包括至少一个选择标志。这种标志包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于E.coli和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨,青霉素抗性基因。合适宿主的典型例子包括而不限于细菌细胞，例如E.coli、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞例如CHO、C0S、293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件为本领域已知。载体之中优选供细菌使用载体，包括p服-4(及其变体)；来自QIAGEN，Inc.的pQE70，pQE60和pQE-9;来自StratageneCloningSystems,Inc.的pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、p隨6a、pNH18A、pNH46A;以及来自PharmaciaBiotech,Inc.的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS。其中优选的真核载体是来自Stratagene的pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG;以及来自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体为熟练技术人员所易见。优选载体为痘病毒载体，特别是例如美国专利申请No.08/935，377所述的痘苗病毒载体，在此全文引入以供参考。可利用磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂类介导转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，将构建体导入宿主细胞。许多标准实验手册描述了这些方法，例如Davis等人BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。利用众所周知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析，从重组细胞培养物中回收并纯化C35多肽。最优选高效液相层析(〃HPLC〃)用于纯化。C35多肽还可以回收自天然来源的纯化产物，包括体液、组织和细胞，不论是直接分离的还是培养的；化学合成方法的产物；以及利用重组技术从原核或真核宿主(包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)制备的产物。C35多肽根据重组制备方法所用的宿主，可以是糖基化或非糖基化。此外，C35多肽也可包括最初修饰的甲硫氨酸残基，有时是宿主介导加工的结果。因此，本领域公知，所有真核细胞中，翻译起始密码子编码的N端甲硫氨酸一般在翻译后从任何蛋白质中高效去除。而大多数原核生物也高效去除大部分蛋白质的N端甲硫氨酸，有些蛋白质原核去除过程的效率低，这取决于共价连接于N端甲硫氨酸的氨基酸的性质。除了包含具有此处所述载体构建体的宿主细胞，本发明还包含原发、继发以及永生的脊推动物特别是哺乳动物来源的宿主细胞，其已经改造以缺失或置换内源性遗传物质(例如C35编码序列)，和/或包括与实施本发明的C35多核苷酸可搡作性连接的遗传物质(例如异源多核苷酸序列)，以及活化、改变和/或扩增内源性C35多核苷酸的遗传物质。例如，可用本领域已知的技术通过同源重组可操作地连接异源控制区(例如启动子和/或增强子)和内源性C35多核苷酸序列(参见例如美国专利No,5,641，670，1997年6月24日颁发；国际公开No.WO96/29411,1996年9月26日公布；国际公开No.WO94/12650,1994年8月4日公布；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989);以及Zijlstra等人，Nature342:435438(1989)，每个公开内容全文引入以供参考。)。经一般描述本ic明，并通过参考下列提供的实施例，将更容易理解本发明，下列实施例是用来说明而不是限制本发明。实施例实施例l人乳腺癌中C35的差异表达本发明人已经筌定了代表C35基因的全长cDNA,其在人乳腺癌和膀胱癌中差异表达(图l)。利用poly-ARNA消减杂交，最初从来自同一原发和浸润的乳腺导管癌病人的胂瘤和正常乳腺上皮细胞系分离到348bpC35DNA片段。(Band,V.爭入，C雄er肚5。.-"5"7-"57(^P^人利用根据该序列及重叠的EST序列(登录号W57569)设计的引物，从SKBR3乳腺肿瘤细胞系(ATCCHTB-19)扩增和克隆包括全长C35编码序列的cDNA。除348bp编码序列之外，该C35cDNA包括167bp3'非翻译区。图2A比较了来源于正常乳腺上皮细胞、大约一年后从同一患者分离的两抹原发乳腺肿瘤结节以及两抹转移性肺肺瘤结节细胞系中的poly-ARNA的C35克隆表达水平，证明了C35序列的差异表达(Band,V.爭乂，Ca/cer/Pes.5。；7义57-Q^^"。定量分析表明，与正常乳腺上皮细胞相比，该序列在肺瘤细胞的表达水平高10倍以上。图2BNorthern杂交结果证明图中其它正常组织中表达水平低。即使正常组织poly-ARNA上样量三倍于胂瘤细胞系，并同等曝光15小时，仍几乎没有检测到C35同源性RNA表达。只是在曝光延长96小时以后，在正常的脾和肾组织中检测到低水平表达的某些同源序列。图2C所示来自不同患者的三个原发浸润的乳腺导管癌和正常乳腺上皮细胞样品poly-ARNA的C35同源序列的表达分析。与正常乳腺上皮细胞相比，三个原发乳腺肺瘤中的两个的C35同源性序列过表达45和25倍。本发明人先前分析了在几个独立来源的鼠肝瘤中表达、而在正常小鼠组织中降低水平表达的免疫保护性肿瘤抗原。(参见2000年3月28曰申请的美国专利，题为"MethodsofProducingaLibraryandMethodsofDirectlySelectingCellsExpressingInsertsofInterest:此处全文引入以供参考)。在这种情况下，肺瘤和正常組织表达水平之间9倍的差异与诱导免疫保护性肿瘤特异应答有关。如上所述，某些人类乳腺癌的C35表达水平相对于正常组织超过9倍，提示在这些个体中C35也可能对乳腺癌是免疫保护性的。实施例2C35特异性CTL细胞溶解C35阳性的乳腺肿瘤细胞尽管如同C35—样，某种基因产物可能在肿瘤细胞中过表达，但是只有在来源于该基因产物的肽能够被加工并与肿瘤细胞MHC分子联合被呈递时，其才在免疫学上相关。可以想象，对于任何给定的基因产物，可能在细胞降解过程中没有产生符合与肿瘤表达的MHC分子相结合的条件的肽，或者即使产生这种肽，转运缺陷或其它肿瘤肽对MHC分子的竟争会阻止呈递该特定基因产物的任何肽。即使相关肿瘤肽被加工并与肿瘤细胞的人类MHC联合被呈递，但是，在任何情况下，必须确定所有组成成分中是否充分展示与这些肽反应的人类T细胞，或者是否也许由于其它非同源性正常组织表达相同或相关抗原而使T细胞耐受。因214此对于这两方面原因，有必要证实MHC限制性的人肿瘤抗原特异性T细胞能够由C35诱导，而且其确实与人肺瘤细胞交叉反应。利用重组C35或自身抗原呈递细胞呈递的重组C35肽体外刺激人T细胞应答，能够获得这方面的相关信息。评价对重组基因产物的T细胞应答的主要技术问题在于，针对表达载体的强免疫应答可能阻断或隐藏重组体特异性的应答。对于可能需要多轮体外刺激的初级应答，这尤其是个问题。为使载体特异性应答减到最低程度，有可能利用由同一基因产物不同病毒载体重组体感染的抗原呈递细胞交替刺激。合适的载体包括逆转录病毒、腺病毒和痘病毒。利用Fico11-Paque纯化人PBMC，经唾液酸苷酶处理的羊红细胞玫瑰花结试验分离单核细胞(红细胞玫瑰花结阴性，ER)和T淋巴细胞(ER+)。ER—组分在含rhGM-CSF(IOOOU/ml)和rhlL-4(1000U/ml)的新鲜培养基中培养7天(每隔一天补加细胞因子)，产生树突状细胞。第7天，未成熟的树突状细胞用表达人C35的逆转录病毒于聚凝胺(1ug/ml)存在下转导6小时。洗涤细胞，在12.5%单核细胞条件培养基、1000U/mlrhGM-CSF和IOOOrhU/mlIL-4以及1%自体血清存在下，于成熟条件下温育4天。此时，树突状细胞与自体T淋巴细胞(冷冻保存的ER+组分)按1个DC:50个T细胞比例温育14天。存活T细胞用经照射的自体EBV-BB细胞(在细胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)存在下，用表达人C35的牛痘重组体按感染复数为1感染过夜(16小时)再刺激。细胞在IL-2和IL-7(10ng/ral)存在下，用携带C35的逆转录病毒感染的自体EBV-B细胞，另外再刺激两次。总共4次刺激后，利用5000个靼细胞/孔、测定4小时"Cr释放分析测定细胞毒活性。下表8所示结果证明，C35剌激的T细胞的特异性细胞毒活性针对C35表达水平相对提高的21NT乳腺肿瘤细胞，而不针对与未转化正常上皮细胞一样〗氐水平表达C35的MDA-MB-231肺瘤细胞。表8C35特异性CTL细胞溶解C35阳性的乳腺肿瘤细胞把细胞自体EBV-BMDA-MB-231C35低(lx)21NTC35高(12x)K562HLA单倍型(效应子A2，All;B8，B35)A2,All;B8，B35A2;B8A26,A31;B35，B38E:T20:110:1(特异性裂解％)2322211100实施例3乳腺癌细胞膜上的C35表达为了确定C35多肽产物是否于肿瘤细胞表面表达，制备了C35特异性的抗血清。用编码人C35逆转录病毒转导的同系Linel小鼠肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠。两次或多次免疫小鼠后，取血。利用免疫血清，通过流式细胞术检测C35蛋白质在三种乳腺肿瘤细胞系(代表Northern印迹中C35转录物的高(21NT)、中(SKBR3)和低(MDA-MB-231)表达水平)表面的表达(参见图4)。1x105乳腺肿瘤细胞用3.5ulC35特异性抗血清或放血前BALB/c对照血清染色。温育30分钟后，细胞用染色緩冲液(PAB)洗涤两次，与FITC-山羊抗小鼠IgG(lug/样品)温育30分钟。洗涤样品，用EPICSElite流式细胞仪分析。图4所示结果表明，特异性免疫血清识别的细胞膜C35抗原表达水平，在肿瘤细胞系21NT中较高(图A),胂瘤细胞系SKBR3中中等(图B)，肿瘤细胞系MDA-MB-231中检测不到(图C)。抗体与C35转录物表达水平提高的肺瘤细胞膜的高反应性提示，C35特异性抗体可作为该基因产物过表达的大量乳腺癌的有效免疫治疗剂(参见图2和3)。216实施例4失调的编码共有鼠肿瘤排斥抗原的核糖体蛋白质L3基因本发明人已经开发了抗原研究的新技术，其可以从构建在痘病毒中的cDNA文库中选择编码CTL表位的基因。本发明人已经利用该技术确定了一个共有的鼠肿瘤抗原，其由核糖体蛋白质L3基因的另一等位基因编码。在正常组织(包括胸腺)中，该免疫原性L3基因表达水平显著，虽然有所降低。用该免疫原性L3cDNA的牛痘重组体免疫接种，诱导了抗肺瘤攻击的保护性免疫。令人特别感兴趣的是，看家基因的失调等位基因能作为免疫保护性抗原，并且胸腺表达不妨碍上调的肿瘤产物的免疫原性。这些结果强调，对自身蛋白质的耐受不是绝对的，而必须根据表达水平来确定的。所述核糖体蛋白质可代表一类肿瘤共有抗原，它们起源于自身蛋白质的表达失调，但不影响正常组织的免疫耐受。这种抗原可能适于重要器官癌症的免疫治疗。方法利用PerfectRNATotalRNAIsolationKit(5Prime3Prime,Inc.，Boulder,CO)分离BCA39胂瘤细胞的总RNA。利用Dyrmbeads(Dynal，UkeSuccess,NY)从总RNA中分离PolyA+mRNA。利用GreatLengthsc腿SynthesisKit(Clontech，PaloAlto,CA)将2ugpolyA+mRNA转变为双链cDNA。然后将该双链cDNA插入牛痘病毒载体v7.5/tk。用照射过(6，500cGy)的2X106BCA34细胞腹膜内免疫Balb/cByJ(JacksonLabs)小鼠。两周以后，小鼠皮下注射照射的2X1(^BCA34细胞，加强免疫。第二次免疫一周以后，收集脾细胞，分成12份，在12孔板中与照射(10，000cGy)的、经丝裂霉素C处理的BCA34细胞(6X105/孔)培养。每周一次利用Lympholyte-M(AccurateChemical,Westbury，NY)纯化存活的T细胞，在12孔板中培养(1.5X1()6T细胞/孔)。每孔还加入照射过(5000cGy)的4X106Balb/c脾细胞，连同照射过的、经丝裂霉素C处理的6X105BCA34细胞。将编码充分鉴定的、结合H-2Kb为免疫显性的卵清蛋白257-264肽(SIINFEKL)的特定牛痘重组体，用非重组病毒稀释，使其最初由O.2%、0.01%或0.00196的总病毒pfu组成。用该病毒混合物按m.o.i.=1(大约5xl()S细胞/孔)感染贴壁的单层MC57G细胞(H-2b)。感染12小时以后，加入卵清蛋白肽特异性CTL(通过用免疫显性的SIINFEKL肽体外重复刺激已接触卵清蛋白抗原的脾T细胞得到)。温育期间，特异性细胞毒性T细胞以被重组颗粒(表达卵清蛋白肽)感染的贴壁细胞为目标，进行细胞溶解事件，使其从单细胞层上释放。与CTL温育后，温和洗涤单细胞层，分别收集漂浮细胞和剩余的贴壁细胞。测定从各个细胞群体提取的病毒的滴度，确定重组(BRdU抗性)病毒pfu的频率。然后将从漂浮细胞提取的病毒用于与新鲜的贴壁MC57G细胞和卵清蛋白肽特异性CTL一起，注入另一富集周期。可以观察到富集以后的VVova超过病毒总数的10%，如果后续周期的m.o.i.从l减少到O.1,可以加速重组病毒的进一步富集。利用牛痘BCA39cDNA文库按moi二l.0感染12孔板中长满的BCN单层细胞。感染12小时后，单细胞层用培养基洗涤3次，每孔加入250jil体积的2.5X106CTL。T细胞和靼细胞37。C温育4小时。温育后收集上清，用250nl培养基温和洗涤单细胞层3次。通过冷冻/融化释放病毒，利用BSC1细胞噬斑分析确定滴度。在12孔板的一个孔中，选择的病毒群体(接受特异性T细胞的培养物中的漂浮细胞)用BSC1细胞扩增2天。然后收集病毒，测定滴度。此病毒原液经历另外三个富集周期。在下一个周期之前，选择的病毒群体不进行扩增。将第四轮富集周期的病毒分成40份混合物，每份混合物5个pfu。在96孔板中用BSC1细胞扩增每份混合物，每孔l份混合物。4天后收集病毒(P1),用于在96孔板中按moi二5感染BCN单细胞层，每孔l份混合物。用vNotl/tk按moi二5感染BCN单细胞层，作为对照(Merschlinsky等人，Virology190:522(1992))。感染5小时后，每孔加入2X1()4洗过的CTL。218每孔终体积225ji1。细胞37。C温育18小时。然后离心沉淀细胞，收集150jil上清液，ELISA检测IFNg。40份5个pfu的混合物中，27份阳性，能够刺激CTL。Poisson分析提示，特定重组体的富集超过20%。从5份阳性混合物中挑选各个克隆，如上所述进行分析。在6孔板中，用v7.5/tk、vF5.8或vH2.16按moi二l.0感染B/C.N单细胞层。感染14小时后，收集细胞和对照靶细胞B/C.N、BCA34和BCA39。乾细胞用100uCi^Cr(D叩ont，Boston,MA)37。C标记l小时，在96孑L圆底板中每孔加入104细胞，一式四份。肿瘤特异性CTL按指定比例加入乾细胞中。细胞37。C温育4小时。收集上清液，测定"Cr释放量。将靼细胞与培养基单独温育，得到自发释放量。将靶细胞与5%TritonX100温育，测定最大释放量。特异性溶解百分比计算公式为特异性溶解％=((实验释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量))X100。在每种情况下，上述公式使用四个孔的平均值。利用dT引物牙pSuperscriptIIReverseTranscriptase(BRL，Gaithersburg，MD)，将2ug总RNA转变为cDNA。以cDNA为模板，利用L3特异性引物L3.Fl.S(CGGCGAGATGTCTCACAGGA)和L3.Fl.AS(ACCCCACCATCTGCACAAAG)、以及KlentaqDNAPolymeraseMix(Clontech),在终体积20ul进行PCR。反应条件包括开始的变性步骤94。C3分钟，然后94。C30秒、60°C30秒、68°C2分钟，30个循环。PCR产物包含L3位点3-1252的区域。PCR产物利用Centricon100柱(Amicon，Beverly,MA)纯化，用Sau3AI消化，3%琼脂糖/溴化乙锭凝胶分离。成年雌性Balb/cByJ小鼠(每组两只小鼠)皮下注射5X106pfu的vH2.16或v7.5/tk进行免疫。免疫7天后，收集脾细胞，在12孔板中与lpM肽L348-56(154)—同培养。7天后，利用Lympholyte-M纯化存活的T细胞，在12孔板每孔中加入1X106丁细胞、1iuM肽以及4X106照射(5000cGy)的Balb/c脾细胞。成年雌性Balb/cByJ小鼠皮下注射10X106pfu的vH2.16、vPKIa、v7.5/tk或磷酸盐緩冲盐溶液，进行免疫。21天后进行继发免疫。免疫21天(只进行初级免疫)或14天后，皮下注射2X105BCA34细胞产生肺瘤激发小鼠。结果和讨论几种自身蛋白质能够被免疫T细胞识别为肺瘤抗原的事实推进了开发广泛有效的肿瘤疫苗的前景(VandenEynde爭人，/#ed(1991);M.B.Bloom夢人，/f早U.185:453(1997);VanDerBruggen夢乂，5"cie/7ce254:1643(1991);Gaugler爭人，/-f单(1994);Boel爭乂，Immunity2:167(1995);VanDenEynde爭人，脉182:689(1995);Kawakami爭入，尸潔.淑丄5""..〃.5*.A91:3515(1994);Kawakami爭人，尸潔.淑丄5""..〃.5:A91:6458(1994);Brichard爭人，/.178:489(1993))。这种正常、未突变的基因产物可作为不同个体中某些类型肿瘤的共同靶抗原。目前，用这种共有肿瘤抗原免疫接种后，诱导保护性免疫的临床证据很有限(Marchand爭入，i/^./C雄er(1999);Rosenberg爭人，组.#ed4:321(1998);Overwijk爭入，尸潔.淑丄5b丄96:2982(1999);Brandle夢人，fwr.//迈迈Mo丄28:4010(1998))。此外，完全不清楚对这些自身蛋白质的T细胞应答是代表免疫耐受的意外故障，还是肺瘤细胞中自身蛋白质表达的质变或量变的结果。后一种情况下，能够保持正常组织的耐受性，并且疫苗诱导的对自身蛋白质(其在肺瘤中的表达被系统性改变)的免疫力，甚至可能适用于重要器官的癌症。本发明人已经表明，在鼠多种肿瘤的转化过程中系统性失调的核糖体蛋白质等位基因是一种肿瘤排斥抗原，免疫原性的主要关联是相对于正常组织和胸腺，胂瘤中表达量的变化显著。本发明人先前曾报道，在三个独立衍生的鼠肺瘤细胞系间可诱导交叉保护性免疫(Sahasrabudhe等人，/./迈历歸7o^r757..6，(l"3))。通过体外诱变独立传代培养的B/C.N细胞系(来源于Balb/c胚胎的克隆的、永生化的、贴壁依赖性的、接触抑制的、非致瘤性成纤维细胞系)得到上述肺瘤BCA22、BCA34和BCA39(Collins爭人，W""re299:169(1982);Lin夢人，/M7/ma^(1985))。引人注目的是，用其中任何肿瘤细胞系(B/C.N除外)免疫接种，可提供针对同源胂瘤细胞攻击以及针对异源胂瘤细胞系攻击的保护。用三个肺瘤细胞系中的任何一个免疫以后，能够产生CD8+细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)系及克隆，它们在体外表现特异性针对这三个肿瘤的交叉反应性，而不针对衍生它们的非致瘤性B/C.N细胞。为了从该肺瘤共有抗原的免疫学定义转到分子定义，本发明人开发了新的有效方法，用于鉴定编码CTL靶表位的基因。此方法中，在修饰的痘苗病毒表达载体中构建BCA39胂瘤细胞系的cDNA文库。(Merchlinsky爭人，FYzW響(1997);E.Smith爭入，撰写中)。用该文库的500，OOO个噬斑形成单位(pfu)来感染抗原阴性的B/C.N细胞的单细胞层，感染复数(moi)为l。感染12小时以后，按照标准"Cr释放分析中引起大约50%溶解的效应细胞与靶细胞的比例，将BCA34肿瘤特异性的CTL加入靶细胞单细胞层。使用异源BCA34肺瘤细胞系特异性的CTL,以便于协助鉴定这两抹肿瘤细胞系的共有抗原。因为贴壁是能量依赖性过程，可以预计，经历CTL介导的溶解事件的细胞将从单细胞层上脱落，并能够从上清液中回收。通过从发生细胞介导的淋巴细胞毒性(CML)的漂浮细胞中收获病毒，有可能富集使宿主细胞对溶解敏感的病毒重组体。该方法的基本特征是适于重复。一个富集周期后收获的病毒，能够用于利用新鲜的单细胞层和新鲜的CTL而进行另外的选择周期，直至达到所要求的富集水平。在利用已知重组体的特异性CTL的模拟试验中，可证明在6个选择周期中，特异性重组体能够从最初的O.001%稀释度富集到大约20%(表9)。在此水平上，挑选单个噬斑做进一步性质筌定是简单的事情。表9多周期富集VVova对由野生型vNot1/tk(tk+)掺加指定浓度的VVova(tk-)组成的牛痘混合物进行CML选择(12)富集漂浮细胞中VVova%周期#实验l实验2实验3moi=l00.20.010.00112.10.3nd24.71.1nd39.14.9nd414.317.91.4524.63.3618.6moi二O.1548.839.3%VVova=(有BudR的滴度/没有BudR的滴度)X100nd二没有测定用胂瘤特异性CTL对痘病毒表达文库进行4轮选择。选择的病毒重组体的各个噬斑经扩增，用于感染分离培养的B/C.N细胞。分析这些细胞刺激特异性CTL以分泌干扰素Y(IFN-Y)的能力(图5A),或者分析对肿瘤特异性CTL溶解的致敏性(图5B)。分离10个病毒克隆，都赋予B/C.N刺激肺瘤特异性CTL系分泌IFN-y的能力。全部10个克隆包含相同大小(1，300bp)的插入片段(Smith等人，未发表资料)。序列分析证实，克隆F5.8和H2.16包含相同的全长cDNA。因此看来全部10个克隆都是相同cDNA的重组体。经BCA34免疫产生的总共6个CTL系中的6个表现了对该抗原的特异性。检索GenBank显示，该cDNA与鼠核糖体蛋白质L3基因高度同源。(Peckham爭人，Ce廳a/〃"ere7，e"3:2062(1989))。对完整的H2.16克隆测序显示，与发表的L3基因序列相比，只有一个核苷酸置换，编码的氨基酸改变。该C170T置换引起54位氨基酸由苏氨酸置换为异亮氨酸。F5.8克隆也包含此核苷酸置换。既然CTL识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原，鉴定由这些1类丽(:限制性肺瘤特异性008+T细胞识别的肽表位是有意义的。认为CTL识别的肽中可能包括该改变的氨基酸(Ile54)。只有H2.16前199bp(63个氨基酸)的痘苗病毒克隆重组体(vH2刚)能够使B/C.N对肺瘤特异性CTL的溶解敏感的事实支持了该假说(Smith等人，未发表资料)。计算机筛选肽结合基序提示，此区域内编码的两种表位可与I类MHC分子Kd以高亲和力结合(图12)(Parker爭乂，/.i/柳"/o7og7152:163(1994))。合成这两种肽L345—54(I54)和L348-56(154)，并检测其使B/C.N细胞对肺瘤特异性CTL的溶解敏感的能力。如图7A所示，肽L34856(I54)使B/C.N对溶解敏感，而1^345-54(154)和野生型L348—56(T54)则不然。已经确定IOnML348-56(154)足以使靶细胞对CTL溶解敏感，而IOOmML348-56(T54)则不然(图7B)。这些结果表明，肽L3昏56(154)是肺瘤特异性CTL识别的靶表位。为了分析不同L3基因产物的表达，以寡dT为引物，从肿瘤及衍生肿瘤的B/C.N细胞系的RNA合成cDNA。利用几乎扩增小鼠L3完整mRNA的一对引物，经PCR扩增cDNA第一链。该PCR产物的序列分析表明，B/C.N和BCB13的L3cDNA在170位包含C(与发表序列相同)。BCB13是来源于B/C.N细胞系的肿瘤细胞系，但与BCA肺瘤细胞系不具有免疫学上的交叉保护性(Sahasrabudhe爭人，/i/ff迈w/7cJo^r757..^。2(1993))。具有交叉反应性的肺瘤BCA39、BCA34和BCA22的PCR产物序列分析提示，这些细胞系表达两种不同种类的L3mRNA。一种在170位包含C,而另一种在170位包含T，与H2.16克隆相同。除了这一个碱基替换，所有L3cDNA的序列相同。有两种可能的方式说明肿瘤细胞中新L3RNA的起源。或者这些肿瘤中表达的L3(C170T)基因是野生型基因的体细胞突变体，或者有多种种系的L3等位基因，当肿瘤转化过程中失调时，其中至少一种产生免疫原性产物。我们认为第一种假说不太可能，因为具有交叉反应性的肺瘤BCA39、BCA34和BCA22是独立得到的。如果在所有三个肺瘤中产生相同的突变表位，这太不寻常了。另一方面，BCA39和B/C.N基因组DNA经不同限制性消化的Southern印迹提示，小鼠基因组中存在多拷贝的L3基因(Smith等人，未发表资料)。也有报道大鼠和牛的L3基因是复等位基因(Kuwano夢人，Aj'oc力e迈ica7aW^/op力/s2-ca7feseajrcACb迈膨/7i"ca"o"s(1992);Simonic夢入,Aj'oc力e迈jf'c3et^'o/力j^ica/4cta(1994))。需要进一步分析，以验证假说种系中不同的L3等位基因在肿瘤和正常细胞中受到不同的调节。发表的L3168-171位核苷酸序列是GACC。H2.16在同一区域的序列是GATC(图8A)。这个新的回文序列是许多限制性内切酶(包括Sau3AI)的识別序列。如图8A的限制性图谱所示，Sau3AI消化的L3预期产生200、355、348、289和84bp的片段，而Sau3AI消化的H2.16将产生168bp片段，而不是200bp片段。Sau3AI消化产物的差异证实三个BCA细胞系表达至少两种不同的L3等位基因。全部5个细胞系以及胸腺RNA的L3RT-PCR产物经Sau3AI消化，用琼脂糖凝胶进行分析。如图8B所示，所有3个BCA细胞系都表达两种版本的L3。值得注意的是，当利用大量原材料重复该分析时，从B/C.N、BCB13和正常胸腺cDNA的消化产物中也检测到该168bp片段(Smith等人，未发表资料)。为了提高该分析的敏感性，利用P"末端标记的5，L3特异性引物重复进行PCR。放射性标记的PCR产物用Sau3AI消化，琼脂糖凝胶分离。如图8C所示，B/C.N、BCB13和胸腺包含该168bp片段。定量分析表明，BCA肿瘤的200bp:168bp片段比例为2:1，而B/C.N、BCB13和胸腺中检测的相同片段比例大约为20:1。分析肾脏、心脏和骨骼肌的RNA,也观察到该免疫原性L3等位基因的低水平表达(Smith等人，未发表资料)。这些结果提示，在交叉反应性肿瘤中，与转化过程有关的基因失调导致该种系L3(C170T)等位基因较高水平表达，该改变的L3基因并非通过L3基因(主要表达于正常组织)的体细胞突变产生。本发明人将该新的L3等位基因(C170T)命名为免疫原性L3等位基因(iL3)。尤为引人注意的是，免疫原性L3等位基因也在正常胸腺中表达，尽管水平降低10倍。该表达水平显然不足以耐受对某些肿瘤中表达的失调的iL3水平具有功能性亲和力的全部T细胞。但是尽管B/C.N和BCB13都表达低水平的iL3，它们对肺瘤特异性CTL的溶解并不敏感，该结果提示较高亲和力的T细胞已经被耐受了。这似乎是胸腺中表达肿瘤抗原的首例报道。这些结果强调，对自我蛋白质的耐受不是绝对的，而必须相对于表达水平的量来确定(Targoni爭人，/.Er/.ifed箭.'潘5(7卿入.C.J.Harrington爭乂，i/!7膽"y8:571(7卿"。如果以肿瘤共有抗原的表达为基础开发广泛有效的疫苗，那么关键是证明该抗原是免疫保护性的。已经鉴定了人类肿瘤的大量共有抗原，但迄今为止，利用这些抗原的临床免疫治疗试验都无确定结果，部分原因是最佳接种策略的不确定性(Pardoll，D.M.，A^t.#ed4:525(1998))。在小鼠中能够更彻底地研究免疫治疗策略，几乎没有鉴定到肿瘤共有抗原。因此，确定用iL3重组痘苗病毒免疫是否诱导肿瘤特异性CTL并保护小鼠免于肿瘤的攻击，具有重要意义。(Overwijk爭人，yVat丄^cad5"c丄^/z^P6^(1999);Moss,B.，6bie/2ce252:1662(1991);.Irvine爭人，/-/历迈歸J柳25(-必57(1995);McCabe爭人，C應er/esea/"c力5^..7W(1995);Estin爭人，尸潔.淑丄力cad85:1052(1988);J.Kantor夢人，7,(1992);V.Bronte爭入，淑丄5"d94:3183(1997))。用iL3基因(H2.16)的痘苗病毒重组体免疫Balb/c小鼠，产生的CTL能够体外溶解BCA34和BCA39肺瘤细胞，而不溶解B/C.N(图9A)。用iL3痘苗病毒重组体免疫两次乃至一次的小鼠，能够排斥BCA34肿瘤细胞的攻击(图9B和9C)。用空的病毒载体或者cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂蛋白质(PKIa)的对照牛痘重组体免疫的小鼠不能排斥胂瘤的攻击(01sen,S.R.和Uhler，M.D.，/肠丄C力e迈.266:11158(1991);Mueller爭乂，撰写中)。这些结果证明，iL3自身蛋白质是免疫保护性肿瘤抗原。本发明人基于CTL介导的筛选修饰的痘苗病毒载体的肿瘤cDNA文库(Merchlinsky爭乂，P72Y7ogy238:444(1997);E.Smith等人，撰稿中)，已经开发了鉴定编码CTL表位的基因的新策略。我们已经应用该策略鉴定了失调的看家基因，其编码由三个独立衍生的鼠肿瘤共有的肺瘤排斥抗原。该核糖体蛋白质可代表一大类免疫保护性肿瘤共有抗原，其由于自身蛋白质的表达失调而变得具有免疫原性，但不影响对正常组织的免疫耐受。这种抗原将特别适合于重要器官癌症的免疫治疗。实施例5C35肺瘤抗原的表达和免疫原性与人正常组织的表达相比，在所检测的70%(12/17)人原发乳腺癌和50%(5/10)膀胱癌中，过表达新的C35胂瘤基因的RNA转录物。该全长基因编码功能未知的115个氨基酸的新蛋白质。选择单克隆抗体2C3，利用流式细胞术分析，对表达C35的细胞表面膜染色。此外，体外产生特异性溶解C35+乳腺肿瘤和膀胱肿瘤的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。从正常人类供者体外产生C35特异性CTL的能力提示缺少对该过表达蛋白质的耐受。C35在不同个体的肿瘤中过表达以及诱导体液和细胞免疫应答的能力，使其成为有希望的免疫治疗候选者。材料和方法*1系.'人享L腺癌细胞系BT20、BT474、MCF7、MDA-MB231、SKBR3、T47D(ATCC提供)，在补加10%胎牛血清(Biofluids,Rockville，MD)的RPMI-1640(BioWhitaker，Walkersville，MD)中培养。衍生自正常乳腺上皮细胞的永生细胞系H16N2、两抹转移瘤2卜MT1和21-MT2、两抹原发瘤21-NT和21-PT，全部来源于同一患者，在DFCI培养基中培养(Band,V.和Sager，R.，〃TumorProgressioninBreastCancer"，Afeop7as〃cZ!r3/zs/b27z/at/o/〃〃迈朋6W76Wt〃7-e,75".RhimandA.Dritschiloeds.，TheHumanPressInc.，Totowa，NJ..(1991)，pp.169—78)由Dr.VimlaBand,NewEngland-TuftsMedicalCenter惠供。膀胱肿瘤细胞系卯T11A3衍生自永生的非致瘤细胞系SV-HUC。这些膀胱细胞系由Dr.CatherineReznikoff,UniversityofWisconsinClinicalCancerCenter惠供，在每500加1补加1%FBS、0.025U胰岛素、1ug氢化可的松、5ug转铁蛋白、2.7g葡萄糖、0.1uM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100U青霉素和100ug链霉素的F12培养基中培养。正常增殖的乳腺上皮细胞(MEC)购自Clonetics(BioWhittaker),根据供应商的说明书维持生长。必V力炎承;^Vo2^力e2V7伊遂》浙.大约80%贴壁率时收获细胞系，提取RNA。收获细胞，在QiagenRNAeasykit的QG緩冲液中裂解。按制造商的操作规程提取总RNA，用GITC和酒精沉淀，-80。C保存。组织样品由CooperativeHumanTissueNetwork以速冻样品提供，在裂解緩冲液中匀浆，用于RNAeasy操作。为了Northern印迹，利用Dynal，s(UkeSuccess,NY)0ligo-dT25磁珠从总RNA(30ug总RNA/孑L)提取m亂用3%甲醛的0.8%SeaKemLE(FMCBioproducts)电泳。利用毛细吸印方法于10XSSC过夜，将mRNA印迹到G匿screenPlus(NEN),然后80。C烘烤2小时。按照每个制造商的操作规程，在106cpm/mlQuickhyb液(Stratagene)中用随机引发的32P标记cDNA探针(Prime-It,Stratagene,Lajolla,CA),68。C探测膜。印迹用X光胶片和/或磷光屏曝光过夜。所有印迹上的表达相对看家基因(例如GAPDH或p肌动蛋白)归一化。谅减杀3t:根据每个制造商的操作规程，使用基于Lisitsyn等人(Lisitsyn，N.和Wigler,N.M.，Science259:946-51(1993))首次描述的代表性差异分析方法的PCRSelectcDNASubtractionKit(Clontech，PaloAlto，CA)，产生与正常乳腺细胞系比较在肿瘤中过表达的基因富集的cDNA。简要地，以oligo-dT为引物，从肿瘤和正常细胞经DNase处理的2ug高质量mRNA合成双链cDNA。在短的平端(Rsal消化的)肿瘤序列连接衔接头，其与过量Rsal消化的正常片段杂交。杂交32小时后，以衔接头序列为引物，利用抑制型PCR(Clontech)优先扩增过表达的肿瘤序列。将PCR扩增产物克隆到pT7Blue3(Novagen,Madison，WI)，产生消減文库。克隆在96孔板中LB/氨千青霉素(100ug/ml)中培养，从过夜培养物中PCR扩增插入片段，PCR产物利用BioDot歧管(BioRad，Hercules,CA)在GenescreenPlus上点样。然后复制的点印迹用随机引物标记的肿瘤或正常cDNA或正反向消减杂交的PCR产物进行探测。在胂瘤cDNA和正向消减(肺瘤减正常)中似乎过表达的克隆经Northern印迹(如上所述)分析，以确定差异基因表达。c/W力X岸;^全长差^.'以01igo-dT为引物，利用SMARTcDNASynthesis(ClontechLaboratories)从S薩3细胞系产生双链cDNA，然后用酚氯仿异戊醇抽提。具体地，根据从EST同源物(登录号#W57569)推断的开放阅读框架，合成引物(C35正义5，-GCGATGACGGGGGAGCC，和C35反义5'CCACGGAATCTTCTATTCTTTCT;FisherOligos，TheWoodlands,TX)，扩增C35编码区。PCR产物克隆到pT7Blue3(Novagen)中。爭症*逆脊录病善6^5重逸#.'C35编码序列从文库中按指定方向亚克隆到牛痘转移质粒pVTKO的BamHI/SalI位点。将pVTKO.C35连同Notl和Apal消化的V7.5/TK病毒DNA,转染由禽痘病毒感染的BSC-1细胞，产生重组病毒。如别处所述(美国发明专利申请No.08/935,377;PCT/US98/24029;TCellsSpecificforTargetAntigensandVaccinesBasedTher醒)，这是构建痘苗病毒重组体的有效方法。C35基因也克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，通过与假模标本pVSVg共转染293-GP细胞，产生病毒原液。48小时后收集包含感染性病毒的上清液。發在体的,4:々/^6^为、浙用C35逆转录病毒感染Linel小鼠小细胞肺癌细胞，将103-2x104细胞注射给3只BALB/cByJ小鼠。21天后，眼眶后取血，收集血清，检测与已知C35mRNA表达水平低(MDA-MB-231)或很高(21NT)的人肿瘤细胞的反应性。还收集脾，利用标准的小鼠杂交瘤技术，融合脾细胞和P3骨髓瘤细胞，制备杂交瘤。用ELISA筛选HAT抗性克隆中存在的Ig。高产者经同型化、定量，用于通过流式细胞术筛选C35+和C35-细胞系。包含lugIgG的杂交瘤克隆上清液在PAB中(PBS、1%BSA、0.1%叠氮化物)与106细胞冰浴30分钟，然后用PAB洗3次，与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(SouthernBiotechnology,Birmingham,AU冰浴30分钟。选择重复了免疫血清表面染色(图14)的一个杂交瘤克隆2C3，扩增并纯化抗体(BioExpress，WestLebanon,NY)。人6^5挣茅遂的r勿應屑种y^^:^来源于健康雌性供者(HLAA2，11，B35，44)的外周血，分为红细胞玫瑰花结阳性组分(全部T淋巴细胞源)和阴性组分(单核细胞源)。冷冻保存T淋巴细胞以供后用，而单核细胞于产生树突状细胞(DC)的条件下温育。如Bhardwaj及同事所述(Bender,A.等人，/*/舰磨丄196:121-35(7卿入'Reddy，A.等人，胁oJEngelmayer,J.等人，/.J/鹏w/o7og77^:^^^-(7^99"略加l务改，诱导DC成熟。每隔一天添加hGM-CSF和hlL-4(1000U/ml)。第7天，未贴壁的未成熟DC在GM-CSF和IL-4存在下，与C35逆转录病毒重组体温育6小时。此时，洗掉逆转录病毒上清液，将未成熟的树突状细胞置于另外包含GM-CSF、IL-4和12.5呢单核细胞条件培养基(MCM)的成熟条件下。4天以后，用这些成熟的、表达C35的DC按1DC:50T细胞的比例，刺激自体T细胞14天。制备新鲜的自体DC混合物，再刺激T细胞，但这次DC在MCM中成熟48小时后，用C35痘苗病毒重组体感染。加入细胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)，并保持DC:T细胞比例为1:50。培养12天后，在添加IL-2(20U/ml)和IL-7(10ng/ml)条件下，用C35重组逆转录病毒感染的EBV-B细胞另外刺激T细胞7天。细胞因子全部购自R&DSystems(Minneapolis,MN)。此时，细胞9096以上是CD8+，禾'j用标准"Cr释放分析检测其活性。简要地，106靶细胞与100uCi"Cr温育、洗涤，然后在补加l(^人AB血清(BioWhittaker)的RPMI-1640中与CTL效应细胞温育4小时。CTL活性表示为特异性溶解的百分率，测量为(标记的耙细胞经CTL溶解而释放到上清液的"Cr-自发的释放量)/(最大释放量-自发释放量)。结果.'在人乳腺胂瘤细胞差异表达的C35克隆，其序列不与Genbank中已知的任何基因同源，但鉴定了其同源的EST序列(原型登录号#W57569)。NCICGAP(CancerGenomeAnatomyProject)文库中存在同源的人EST片段，包括脑胂瘤、肺肿瘤和肾脏肿瘤(AftAA954696)、Soares卵巢肿瘤(AftAA285089)和甲状旁腺肿瘤(A#W37432)、子宫内膜肿瘤(AftAA337071)以及结肠癌(AftAA313422)。鉴定了编码115个氨基酸的蛋白质的开放阅读框架(图10A)。从乳腺腺癌细胞系SKBR3的cDNA文库中分离全长基因。对细胞系SKBR3、21MT2-D和H16N2的全长转录物测序证实，在cDNA中没有点突变；C35hi细胞系以及C351。细胞系的转录物100%同源。C35基因定位于人类染色体17ql2(AftAC040933),小鼠染色体ll(A#AC064803)。根据与cDNAEST序列的同源性推断外显子，并进行GRAIL预测。令人感兴趣的是，C35基因位于Her2/neu癌基因的1000bp区域内，以及生长因子受体结合蛋白质7(GRB7)(参与细胞周期活化的酪氨酸激酶，在食道癌中过表达)基因的2000bp区域内(Tanaka,S.爭人，/672.".J譜st.，z脂-27(1998))(图10B)。Her2/neu蛋白质过表达与30%乳腺胂瘤的基因增殖有关，并与临床预后不佳有关(Sla隨，D.J.夢乂，5"cie/ce235:177-82(1987))。C35氨基酸序列中预测的蛋白质基序包括位于氨基酸38-41(TYLE)、76-79(SKLE)和97_100(SNGE)处的酪蛋白激酶II磷酸化位点；位于氨基酸60-65(GGTGAF)处的N-豆蔻酰化位点；以及位于氨基酸94-97(RRAS)的cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点。最后，C35蛋白质在C00H端氨基酸112-115(CVIL)处包含异戊二烯化基序。异戊二烯化，即与疏水性类异戊二烯部分共价连接，是一种翻译后修饰，其可促进膜结合，也似乎介导蛋白质-蛋白质相互作用(Fu，H.-W.和Casey，尸.,/ece/7t尸ro^res51//7〃or迈o/eyesearc力《5￥.'315—43(1999))。已经证明异戊二蹄化为潜在的癌基因Ras家族蛋白质定位以及转化到细胞表面所必需(Jackson,J.H.爭人，尸jtoc.)Vat丄力cad5"c/.〃-5".A87:3042—46(1990);Hancock,J.F.夢人，Ce7757:1167-77(1989))。已经证明异戊二烯化的抑制剂具有抗肺瘤活性，例如减緩肿瘤生长(Garcia，A.M.爭人，/.^'o丄C力e迈.268:18415-18(1993))以及在动物模型中促进排斥反应(Kohl,N.E.等人，yVatweU.1:792-97(1995))。利用NetOGlyc2.0预测了3个0-糖基化位点，位于氨基端或氨基端附近-thr8、ser2和ser9。(^5#录參^翼靡^€#^迎4这.'肺瘤免疫治疗的理想靶抗原应当在许多独立的癌中大量表达，而在正常增殖的重要组织中不表达或表达水平极低。通过Northern印迹分析确认C35的差异表达。在7/10的人胂瘤细胞系中表达的C35水平，比正常的永生乳腺上皮细胞系H16N2水平高10-25倍(图11A)。重要的是，来源于单一患者的原发(21NT、21PT)和转移(21MT1、21MT2)病变的细胞系都表达C35，提示其表达可能与肿瘤转化过程中的早期事件有关。此外，在独立起源的人类乳腺癌细胞系(包括SKBR3、T47D和BT474)中，都有C35的过表达。令人感兴趣的是，在SKBR3、MDAMB231、H16N2以及来源于同一患者的胂瘤中，C35的表达模式与Her2/neu表达相关，这可能与这两个基因的基因组紧密接近以及Her2/neu基因扩增的发生率有关。为研究来源于患者的胂瘤中的C35表达是否是临床相关的，以开发癌症疫苗，从速冻的人组织样品(自CooperativeHumanTissueNetwork(CHTN)获得)提取mRNA。7096原发乳腺肿瘤样品过表达C35转录物(图11B),35%(7/20)该乳腺腺癌过表达水平比正常乳腺高10-70倍。检测的原发膀胱癌样品中，5096也过表达C35(图12),而20%(3/14)原发膀胱癌比正常膀胱表达水平高10倍以上。卵巢(0/7)、前列腺(0/5)或结肠(0/15)癌样品未检测到9倍或更高的C35过表达水平(数据未显示)。^^，^發在沐与6^^f勿應^j.'为了确认C35所编码的基因产物的差异表达，选择针对该肺瘤共有抗原的单克隆抗体。用经人C35逆转录病毒重组体转导的低免疫原性的BALB/cByJ肿瘤细胞系免疫小鼠，制231备杂交瘤。根据对035++的乳腺和膀胱肿瘤细胞系的染色能力，筛选杂交瘤克隆(图13A和13B)。非致瘤性乳腺H16N2和膀胱SV-HUC上皮细胞系与同型对照相比，荧光强度的变化不显著。相反，2C3单克隆抗体特异性染色C35+的乳腺肿瘤SKBR3和21-NT-D,以及膀胱肿瘤ppTllA3。对既不固定也不通透化的细胞进行染色，表明2C3抗体识别细胞表面分子。用C35抗体抑制肺瘤生长抗体是检测癌症诊断标志的有用工具，但其也可能用于治疗应用。人源化的Her2/neu特异性抗体(Herc印tin)已经成功用于治疗某些乳腺癌。Herceptin结合Her2/neu,并下调生长因子受体的信号转导。用C35特异性的2C3抗体进行生长抑制研究。21NT-D乳腺肿瘤和H16N2〃正常〃乳腺细胞系在体外于不同抗体浓度下培养。在72小时进行XTT分析，以评价细胞扩增。结果如图14所示，表明2C3在1ug/ml的低浓度下，抑制21NT肺瘤细胞生长约5096。C35I类表位为HLA-A2限制型自身耐受性的建立是基于自身蛋白质开发疫苗的主要障碍。然而，必须根据定量的表达水平确定耐受性。有可能甚至高亲和力的抗原特异性T细胞是耐受的，而具有低亲和力受体(对低浓度抗原没有功能性亲和力)的T细胞逃避耐受诱导。然而，如果存在与靶抗原过表达有关的、显著提高的亲和力，这些同样的T细胞能够随之变得功能上非常重要。即使它们数量很少，该T细胞能够通过最基本的免疫学操作(疫苗接种)进行扩增。C35是在人正常组织中低基础水平表达的自身蛋白质。因此，必须确定人T细胞是否耐受癌的特征性C35表达水平。排除耐受的唯一方法是证明免疫应答，缺乏临床试验而证明免疫应答的唯一方法是体外刺激。人T细胞和自体树突状细胞来源于正常供者的PBL。利用C35cDNA的逆转录病毒或痘病毒重组体感染的自体树突状细胞交替刺激，致敏T细胞。几个刺激周期后体外回收CTL,分析其裂解C35+肿瘤靶细胞(图15)或者响应抗原诱导的活化而分泌细胞因子(图16)的能力。靶细胞或者内源性表达C35和/或HLA-A2，1,或者经改造(通过C35重组哺乳动物表达载体的标准转染，或通过C35重组痘苗病毒感染)表达这些蛋白质。先前的研究已经证明，利用痘苗病毒表达蛋白质，是将肽靶向MHC-I加工途径的有效方法(Moss，A"5"cie/7ce252:1662-67(1991)。几轮刺激以后，选择混合T细胞系和T细胞克隆，在"Cr释放分析中，它们相对于C351。H16N2正常乳腺上皮细胞系，可差异溶解C35+肿瘤细胞(图15A和B)。HLA-A2限制型C35特异性CTL克隆10G3，有效溶解HLA-A2转染的致瘤细胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表达水平比H16N2高15倍，可用2C3单克隆抗体染色)。HLA-A2+膀胱肺瘤细胞系ppTllA3比衍生它的非致瘤性膀胱细胞系SV-HUC，也是特异性裂解的(图15B)。该数据证明，CTL对表达高水平C35的肺瘤的敏感性，对C351。非致瘤性永生细胞系的溶解最小。重要的是，同样的CTL与原代培养的非永生、非转化的HLA-A2+乳腺上皮细胞MEC(C35表达水平不显著)不反应。支持T细胞识别C35+肿瘤的进一步证据如图16A和B所示。T细胞响应C35+、HLA—A2+刺激物而分泌IFN—y禾口TNF—a。此夕卜，非致瘤'1"生C351。细胞系H16N2.A2不诱导C35特异性T细胞分泌细胞因子。然而，用痘苗病毒C35重组体感染该细胞系，能使其能够活化T细胞。既然T细胞不响应无关蛋白质L3转导的H16N2.A2而分泌IFN-y或TNF-a,表明该应答特异性针对C35蛋白质表达(图16A和B)。几轮刺激以后，选择混合T细胞系和T细胞克隆，在"Cr释放分析中，它们差异溶C35+、HLA-A2+肿瘤细胞。C35特异性CTL不溶解HLA-A2转染的非致瘤性乳腺上皮细胞系H16N2.A2(图15A和B),尽管根据如图llA所示的Northern印迹数据，该细胞系确实低水平表达C35。然而，C35特异性CTL有效溶解HLA-A2转染的致瘤细胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表达水平比H16N2高15倍，可用2C3单克隆抗体染色)。膀胱肿瘤细胞系ppTllA3与衍生它的非致瘤性膀胱细胞系SV-HUC相比，也显示C35+胂瘤特异性的溶解。该数据证明，CTL对表达高水平C35的胂瘤的敏感性，对C35"非致瘤性永生细胞系的裂解最小。重要的是，同样的CTL与原代培养的非永生、非转化的HLA-A2+乳腺上皮细胞MEC(C35表达水平不显著)不反应。支持T细胞识别C35+肿瘤的进一步证据如图16A和B所示。T细胞响应C35+、HLA-A2+刺激物而分泌IFN-y和TNF-a。此外，非致瘤性C35"细胞系H16N2，A2不诱导C35特异性T细胞分泌细胞因子。然而，用痘苗病毒C35重组体感染该细胞系，能使其能够活化T细胞。既然T细胞不响应无关蛋白质L3转导的H16N2.A2而分泌IFN-y或TNF-a,表明该应答特异性针对C35蛋白质表达。C35特异性T细胞从HLA单倍型A2、All、B8、B35的供者产生。膀胱细胞系SV-HUC和卯T11A3来源于单倍型HLA-A2、B18、B44的供者。然而，由于H16N2永生化乳腺上皮细胞系以及21-NT和21-MT乳腺肺瘤细胞系来源于同一个HLA-A2阴性供者，这些细胞系必需用HLA-A2.l转染，以提供所需的MHC限制性元件，以供HLA-A2限制性10G3T细胞克隆识别(图16A和B)。T细胞经表达C35和HLA-A2的乳腺细胞系强刺激而分泌淋巴因子(21-MT2与21-MT2.vvA2比较)。该数据表明，存在至少一个HLA-A2.1确定的C35表位。构建C35编码区的缺失突变体，以筌定编码CTL识别的肽表位的cDNA片段。图15A和B表明，用全长C35或只包含前50个氨基酸的截短的突变体刺激T细胞，分泌几乎等量的IFN-y和TNF-a。讨论C35是在乳腺癌和膀胱癌中过表达的新肺瘤抗原。该基因的特性使其成为有希望用于肿瘤免疫治疗的候选者。它在来源于不同个体的大量肿瘤中表达。在正常的重要组织的表达相对较低，降低了自身免疫应答的风险，并且同样重要的是，这使免疫细胞不大可能已经对该基因产物发生耐受。由于表达C35的树突状细胞体外诱导胂瘤特异性的人自体细胞毒性T淋巴细胞，将C35表征为〃肺瘤抗原〃。C35是新的功能未知的基因产物。然而，我们用单克隆抗体的研究已经使对蛋白质定位有了一定理解。来源于C35免疫小鼠的血清和单克隆抗体都能对表达C35的未固定细胞进行特异性染色。这提示该抗体识别肺瘤表面的膜蛋白质。尽管根据疏水性，该蛋白质序列不符合已知的跨膜基序，但在COOH末端存在的异戊二烯化位点提示该蛋白质插入膜中。异戊二烯化是翻译后的脂类修饰，其产生基本上更具疏水性、更高膜亲和力的蛋白质(Fu，H.—W.和Casey，P.J.，/ece/t尸ro^ressi/欣」r迈o"eyesearc力5^,W5-^(7999"。包含异戊二烯化位点的其它蛋白质包括Ras癌基因家族。RasGTP酶在MAPK信号转导级联中起作用，诱导细胞分裂和增殖。Ras蛋白质通过异戊二烯化锚定到质膜，但该蛋白质保持在膜的细胞质一側。因此，有可能C35也保持在膜的细胞质一側，但可能有足够数量转运到外表面，而被特异性抗体检测到。C35特异性抗体是研究C35蛋白质表达的重要工具，以印证Northern印迹分析，并用于诸如Western印迹和免疫组织化学分析。此外，这些抗体可能具有治疗上的益处，如最近已经证明的Herc印tin(Baselga，J.爭入，/."/仏0腳丄化U(1996);Pegram，M.D.夢人，/.67^2.16:2659—71(1998))，它是肿瘤相关抗原HER2-腦(c-erbB-2)(Schechter，A丄等，淑wre312:513-16(1984))的抗体。Herc印tin的抗胂瘤效应包括结合抑制肿瘤细胞发育的表皮生长因子受体，并激发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Dillman，R.0,，Ca/cer^z'otAera/7《/Pa^/i"o/力3JT2773ce〃".ca7s70(1999)。实施例6诱导特异性针对肿瘤靶抗原的细胞毒性T细胞已经通过用自体肺瘤或由肿瘤裂解物脉冲的自体抗原呈递细胞刺激PBL,体外诱导人肺瘤特异性T细胞(vanDerBruggen，P.夢人，5"c/e/ce254:1643-1647(1991);Yas薩ra，S.夢入，C露er/Pes,，S.爭人，/C雄er57..297-305(1994);Si迈ons，/K等人，Ca歸r/es.57:1537-46(1997);JacobL.等人，/.Ca/7cer71:325-332(1997);Chaux，P.等人，J.Immunol.163:2928-2936(1999))。PBL来源于有意用肺瘤、经修饰以增强其免疫原性的肿瘤、或肺瘤提取物免疫的患者，或者只在自然病程中预先刺激的患者。通过用经体外感染、或者自然病程中接触传染物而体内感染的自体细胞对T细胞进行体外剌激，能够类似得到对传染物具有反应性的T细胞。在此条件或其它条件下选择的、对肿瘤细胞或由病毒、真菌或分枝杆菌感染的细胞特异性的CD4+和CD8+T细胞或抗体，或者对自身免疫性疾病的靶抗原特异性的T细胞或抗体，能够用于本发明的选择和筛选方法，以检测和分离编码这些靶抗原并已摻入典型cDNA文库的cDNA。尽管证明了针对肺瘤和受感染细胞的多种抗原体外成功诱导了人T细胞应答，但不能肯定这代表了体内可被诱导的应答全部组成成分。由于安全考虑限制了人免疫接种实验的可能性，因此需要另外的动物模型以研究对人疾病抗原的免疫应答。开发这种模型的主要障碍是，人正常细胞表达的多数分子在其它物种中具有强烈的免疫原性。因此，必需设计一种方法，能够在另一物种中诱导对人正常抗原的耐受性，以便揭示对任何人疾病特异性抗原的免疫应答。现在认识到，活化抗原特异性T淋巴细胞需要两种信号，其中一种涉及呈递特异性抗原复合物到T细胞抗原受体，另一种是独立的共刺激信号，一般通过抗原呈递细胞表面的B7家族分子与T细胞膜上CD28分子的相互作用而介导。在缺少共刺激信号的情况下传递抗原特异性信号不仅未能诱导T细胞免疫，而且导致T细胞对后续刺激没有反应性。(Lenschow，D.J.爭人，^//7./Per.izz旭w/o7.14:233-258(1996))。其它研究揭示了在抗原呈递细胞上的CD40分子和T细胞上的CD40配基之间的另一对相互作用的关键作用。该相互作用引起B7共刺激分子上调(Roy,M.爭人，/ffl迈w/707.i^.-5^6-^0("/5^5"。体内或体外存在抗CD40配基抗体的情况下，与CD40的相互作用被阻断，B7共刺激物不上调，特异性抗原236复合物的刺激引起T细胞耐受，而非T细胞免疫(Bluestone，J.A.爭人，/zzwzw/7o丄/Per.165:5-12(1998))。使CD40/CD40配基相互作用以及B7/CD28相互作用之一或两者都阻断的各种方法，已经显示可有效诱导移植耐受(Larsen，C.爭人，yVatwre381:434-438(1996);Kirk爭入，yVatwreife心ci/e5.'^^-(1999))。抗CD40配基抗体(抗-CD154)10'C57Bl/6(H-2d)脾细胞腹膜内免疫DBA/2(H-2b)小鼠，并在接种时以及两天后另外注射盐水或O.5mg单克隆抗CD40配基抗体(MRl，抗CD154，Pharmingen09021D)。免疫后第10天，取出这些小鼠的脾细胞，用C57Bl/6或经照射(20Gy)的异源C3H(H-2k)对照脾细胞体外刺激。体外刺激5天后，利用特异性标记靶细胞的"Cr释放分析，按不同效应细胞耙细胞比例，分析C57B1/6和C3H特异性的溶细胞反应，在此情况下，用同源脾细胞裂解物脉冲C3H或C57Bl/6树突状细胞。图17中的结果表明，针对C3H同种抗原对照，在盐水和抗CD154处理的小鼠中都诱导显著的细胞毒性，而对于C57B1/6，只在盐水处理小鼠中诱导细胞毒性反应，而在抗CD154处理的小鼠中没有诱导细胞毒性反应。这表明，当CD40/CD40配基的相互作用被抗CD154阻断时，诱导了针对免疫刺激所用抗原的耐受性。类似于上述的、单独使用抗CD154或者联合使用抗CD154和抗B7或抗CD28的耐受化方法，能够用于在用人肺瘤免疫之前，在小鼠中诱导对人正常异种抗原的耐受性。在一个实施方案中，在来源于相同个体和衍生肿瘤细胞系的组织的正常永生细胞上可表达正常抗原。在另一实施方案中，从同一个体正常和肺瘤组织的细胞裂解物得到正常抗原和肿瘤抗原，每一裂解物脉冲抗原呈递细胞，以在体内和体外呈递给同源小鼠的T细胞。在优选实施方案中，经体外诱变或者癌基因转化从永生的、接触抑制的、贴壁依赖性、非致瘤性细胞系产生肿瘤，因此可获得很匹配的非致瘤性细胞，用于耐受性诱导。另选的耐受化方法是，在用肿瘤免疫之前缺失由正常抗原活化的T细胞。活化的T细胞瞬时表达CD69和CD25,刺激后24-48小时表达最高。在经正常细胞或正常细胞裂解物活化以后，能够利用与基质(例如磁珠)直接或间接偶联的抗CD69和抗CD25抗体缺失表达这些标志的T细胞。然后用肿瘤细胞或胂瘤细胞裂解物在继承性转移后体外或体内免疫剩余的T细胞，将优先引起胂瘤特异性应答。在一个实施方案中，将要耐受人正常细胞或裂解物并继之以肺瘤细胞或裂解物免疫的小鼠，是任何商品化的近交和远交品系。因为鼠的T细胞只限于识别与鼠MHC分子(而不是人细胞表达的MHC)结合的肽抗原，有效的耐受和刺激需要用鼠MHC分子转染人细胞，或者通过鼠抗原呈递细胞重新呈递人的正常和肿瘤抗原。特别优选树突状细胞作为抗原呈递细胞，因为它们在I类和II类MHC途径中都能重新呈递抗原肽(Huang爭人，5We歸264:961-965(1994);Inaba夢乂，/f单腐.176:1702(1992);Inaba夢人，/.U.178:479-488(1993))。在另一实施方案中，禾'J用转双基因(人HLA和人CD8或CD4)的小鼠。HLA转基因允许在小鼠胸腺中选择高亲和力、HLA限制性T细胞所有组成成分。此外需要人CD8或CD4转基因，因为鼠CD8和CD4不与同源的人I类或II类MHC分子有效相互作用。利用非转基因小鼠产生人肿瘤特异性T细胞，将会鉴定到能够与鼠MHC分子结合进行加工的任何人类肿瘤抗原。因为可获得具有不同MHC分子的多个鼠品系，这样可能包含各种各样的抗原。然而，必须利用自身抗原呈递细胞刺激人T细胞，来分别确定这些肿瘤特异性抗原是否也表达能够与人HLA联合加工和呈递的肽。这种肽可能与或不与起初检测到的鼠MHC分子结合的肽重叠，但可来源于同类蛋白质。通过利用HLA转基因小鼠，有可能更直接找到与人MHC相关的抗原肽。然而，不能肯定鼠和人的抗原呈递细胞对肽的加工是相同的。因此，必须证实HLA限制性的人胂瘤抗原特异性T细胞确实也与人肿瘤细胞交叉反应。最后，无论怎样进行联合人HLA的加工和呈递，在任何情况下，必须确定人类T细胞是否与鉴定的抗原反应，或者也许由于其它非同源性正常组织表达相同或相关抗原而是否使T细胞耐受。利答，能够获得这方面的相关信息。理想地，抗原阳性肿瘤的患者，其238与目的胂瘤特异性抗原反应的T细胞的频率提高。如ye//7e;C.等人，5"c/e/2ce2W.'《33-M5(7卯^)所述，为证明诱导的人抗原特异性T细胞能够有效消灭胂瘤，选择的人T细胞可继承性转移到带有人肺瘤异种移植物的SCID小鼠中。然而，临床相关的确切证据将要等待人体临床试验的结果。实施例2描述了体外刺激原发性人T细胞应答的条件，其对CD4+和CD8+应答都适用。所述诱导人肺瘤特异性的人T细胞或抗体应答的策略，同样适用于针对病毒、真菌或分枝杆菌感染的人细胞的靶抗原的T细胞或抗体应答的诱导。实际上，在此情况下，相同的未感染细胞群体可立即提供正常对照群体，用于诱导耐受并确认感染的特异性。转基因小鼠的构建为本领域乂>知，例如#3/7//〃73^jf力2Y7Vj7a6o7"atoryHogan等人,ColdSpringHarborPress,secondedition(1994)中的描述。可以禾'J用LaFace等人，/,JfeJ.182:1315-25(1995)方法，构建人CD8转基因小鼠。将相应的人cDNA插入基于人CD2小基因的载体中，可以构建表达人CD8a和CD8p亚基的新品系转基因小鼠，在转基因小鼠中进行T细胞特异性表达。(Zh丽bekov爭人，/./迈迈脂丄淑力oofe185:133-140(1995))。可利用Chamberlain等人，尸潔.淑丄爿c^/.,85:7690-7694(1988)或Bernhard等人，/#eJ.168:1157—1162(1988)或Vitiello等人，/#ed173:1007—1015(1991)或Barra等人，,/迈顶〃/7o丄150:3681-3689(1993)的方法，构建HLAI类转基因小鼠。通过构建包括2kb上游调节区以及前两个内含子(以前曾用于基因调节)(Kralova等人,1992，EMB0J.11:4591-4600)的H-2Kb盒，进行另外的HLAI类转基因小鼠的构建。从该区去除内源性翻译起始位点，在第三个外显子中引入供HLAcDNA插入的限制性位点，其后是polyA添加位点。通过在此构建体3，端加入另外的3kbH-2Kb基因组序列，在胚胎干细胞中能够以I类基因为目标在H-2kb基因座进行同源重组。好处在于，很可能在已知与鼠I类基因表达相容的指定位置进行转基因表达，并且通过在细胞膜表达H-2Kb,这些小鼠很可能欠缺潜在的竟争作用。据信这样将得到在相同构建体中引入的不同的人HLAI类cDNA的相对可重现性的表达。实施例7构建N端和/或C端缺失突变体下列一般方法可用来克隆N端或C端缺失的C35缺失突变体。通常，两条大约15-25个核苷酸的寡核苷酸引物来源于SEQIDNO:l多核苷酸的5'和3'目的位置。根据目的C35多核苷酸片段确定引物的5'和3'位置。如有必要，5，和3，引物分別添加起始和终止密码子，以表达该多核苷酸片段编码的C35多肽片段。优选的C35多核苷酸片段编码候选的MHCI类和MHCII类结合肽(在本说明书上述〃多核苷酸和多肽片段〃一节中公开的)。5'和3'引物序列也可添加包含限制性位点的另外核香酸，以便于将C35多核苷酸片段克隆到目的载体。利用合适的PCR寡核苷酸引物以及此处所述或本领域已知的条件，从基因组DNA或cDNA克隆扩增C35多核苷酸片段。本发明的C35多核苷酸片段编码的C35多肽片段，可以按与全长多肽相同的一般方式表达和纯化，尽管由于特定片段和全长多肽之间存在化学及物理特性的差异而可能需要做常规的改变。为例证而非限制本发明，编码C35多肽片段的多核苷酸如下扩增并克隆产生5'引物，包含限制性内切酶位点，后接起始密码子，其位于编码MHC结合肽表位(表l-6所列)N端部分的多核苷酸序列的框架内。产生互补3'引物，包含限制性内切酶位点，后接终止密码子，其位于编码C35MHC结合肽表位(表1-6所列)C端部分的多核苷酸序列的框架内。利用识别引物中位点的限制性内切酶，消化扩增的多核苷酸片段以及表达载体。然后将该消化的多核苷酸连接在一起。将C35多核苷酸片段插入到限制性酶切的表达载体中，优选方式为将C35多肽片段编码区置于启动子下游。利用标准方法并如此处实施例所述，将连接混合物转化E.coli感受态细胞。从抗性克隆分离质粒DNA，利用限制性分析、PCR和DNA测序确认克隆的DNA的身份。实施例8C35的蛋白质融合优选地，C35多肽与其它蛋白质融合。这些融合蛋白质可用于多种应用。例如，C35多肽融合His-标记、HA-标记、蛋白质A、IgG结构域、以及麦芽糖结合蛋白可便于纯化。(参见实施例5;也参见EPA394,827;Traunecker夢人，A^"re<^-〃《(1988).)类似地，融合IgG-l、IgG-3以及白蛋白可延长体内半衰期。C35多肽融合核定位信号可靶向蛋白质到特定的亚细胞定位，而共价异二聚体或同二聚体可提高或降低融合蛋白质的活性。融合蛋白质还可以产生具有一种以上功能的嵌合分子。最后，融合蛋白质与非融合蛋白质相比，可提高该融合蛋白质的可溶性和/或稳定性。通过修改以下概述的多肽与IgG分子融合的方法，可产生上述所有类型的融合蛋白质。简要地，利用跨越下述序列的5，和3，端的引物，可PCR扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物也应具有适当的限制性内切酶位点，以便于克隆到表达载体，优选哺乳动物表达载体。例如，如果使用pC4(登录号209646),可将人Fc部分连接到BamHI克隆位点。注意，应该破坏3，BamHI位点。然后，包含人Fc部分的载体再经BamHI限制性酶切，线性化载体，并将按实施例1所述PCR方法分离的C35多核苷酸连接到该BamHI位点。注意，克隆的C35多核苷酸没有终止密码子，否则不能制备融合蛋白质。如果使用天然存在的信号序列制备分泌蛋白质，pC4不需要另外的信号肽。另外，如果不使用天然存在的信号序列，载体可修改为包括异源信号序列。(例如参见WO96/34891.)241人IgGFc区gggatccggagcccaamcttctgacamactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaattcgagggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggactcctgaggtcacatgcgtggtggtggac(^aagg(jac^m(5accc^gaggfcazlgttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc6tcctgcaccaggactggctgamggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccaacccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcaitcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaaggat(seqidno:[84〗)优选的融合产物是，C35肽融合MHC分子的氨基端，其方式是肽自然地占据MHC肽结合槽。Kang，X.等人，CancerRes.57..，-5(1997)已经报道，这种融合蛋白质能够用于对刺激特异性T细胞特别有效的疫苗组合物。实施例9检测生物样品中C35水平异常的方法可以检测生物样品中的C35多肽，并且如果检测到C35水平升高或降低，该多肽是特殊表型的标志。检测方法很多，因此，本领域技术人员应当理解，可以修改以下分析方法，以适合其特殊需要。例如，抗体夹心ELISA用来检测样品中的C35，优选检测生物样品中的C35。用终浓度为O.2-10ug/ml的C35特异性抗体包被微量滴定板的孔。抗体是单克隆或多克隆抗体。将孔封闭，以降低C35与孔的非特异性结合。然后将包被的孔与包含C35的样品室温温育2小时以上。优选应使用连续稀释的样品来验证结果。然后用盐水洗板三次，除去未结合的C35。然后，加入50ul浓度为25-400ng的可识别C35抗原决定簇(其不与结合板上的抗体识别的抗原决定簇重叠)的特异性抗体-碱性磷酸酶缀合物，室温下温育2小时。用去离子水或蒸馏水再洗板三次，除去未结合的缀合物。每孔加入75ul4-甲基伞形酮酰磷酸盐(MUP)或对硝基笨基磷酸盐(NPP)底物溶液，室温下温育l小时。利用微量滴定板读数器测定反应。利用连续稀释的对照样品制备标准曲线，并以C35多肽浓度为X轴(对数刻度)、以荧光或吸光度为Y轴(线性刻度)。利用标准曲线内插计算样品中的C35浓度。实施例IO配制多肽按照符合良好的医疗实践的方式，并考虑患者个体的临床状况(特别是单独用C35多肽治疗的副作用)、输送位置、给药方法、给药时间表及其它为专业人员所知的因素，配制C35组合物并确定剂量。因而根据这些考虑确定此处所用的〃有效量〃。一般主张，每剂非肠道给药C35的药物总有效量介于大约1ug/kg/天-10mg/kg/天的患者体重，尽管如上所述，这也要经过治疗判断。更优选剂量至少O.01mg/kg/天，人用最优选剂量大约O.01-1mg/kg/天。如果连续给药，一般给予C35的剂量速率为大约l-50ug/kg/小时，每天注射l-4次或通过连续的皮下输注，例如利用小泵。也可使用静脉注射袋装溶液。观察到变化需要的治疗时间长短以及治疗后到发生反应的间隔时间似乎取决于预期效果。包含C35的药物组合物经口服、直肠、非肠道、脑池内、阴道内、腹腔内、局部(通过粉末、软膏、凝胶、滴剂或透皮片)、口腔，或者口喷或鼻喷给药。〃药物可接受的载体〃是指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释剂、胶嚢物质或任何类型的辅助制剂。此处所用术语〃非肠道〃是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下以及关节内注射和输注的给药方式。C35也适于通过緩释系统给药。合适的緩释组合物例子包括有形物品形式的半渗透聚合物基质，例如薄膜或微嚢。緩释基质包括聚交酯(美国专利No.3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和L-谷氨酸-y-乙酯的共聚物(Sidman，〃.夢人，^'opo7/2ers22:547-556(1983))，聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(R.Langer爭乂，^'o迈edifeter.75,76"〃(1981)以及R.Langer，C力e迈.rec力.12:98-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer爭人J或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。緩释组合物也包括脂质体包载的C35多肽。包含C35的脂质体按本来已知的方法制备DE3，218，121;Epstein爭人，淑丄爿ca"6""..,82:3688-3692(1985);Hwang夢入，尸roc.淑丄爿c^/.5"c丄目77:4030-4034(1980);EP52，322;EP36，676;EP88，046;EP143,949;EP142，641;曰本专利申请83—118008;美国专利Nos.4，485，045和《5￥《545;以及EP102,324。脂质体通常是小(大约200-800埃)的单层类型，其中脂类内容物是大于约30摩尔百分比的胆固醇，调整选择的比例以优化分泌型多肽的治疗。至于非肠道给药，在一个实施方案中，一般以单位剂量的注射形式(溶液、悬浮液或乳液)，按所要求纯度，与药物可接受的载体(即，在使用的剂量和浓度下对受者无毒，并与该制剂的其它成分相容)混合，配制C35。例如，优选制剂不包括氧化剂及其它已知对多肽有害的化合物。通常，通过将C35与液体载体或精细粉碎的固体载体或两者都均一并紧密地接触而制备制剂。如有必要，该产物然后做成所要求制剂的形状。优选载体是非肠道载体，更优选与受者血液等渗的溶液。该载体的例子包括水、盐水、Ringer，s液和葡萄糖溶液。此处也用非水载体诸如不挥发油和油酸乙酯，以及脂质体。载体适当地包含小量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。该物质在使用的剂量和浓度下对受者无毒，并包括緩沖液例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸，及其它有机酸或其盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(小于大约10个残基)的多肽，例如多聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙棒吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA;糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如聚山梨酸酯、聚羟体或PEG。一般在这种载体中配制C35,浓度大约O.1-100mg/ml，优逸1-10mg/ml，pH大约3-8。应当理解，利用上述的某些赋形剂、载体或稳定剂，将导致形成多肽盐。用来治疗性给药的C35可无菌。利用通过无菌过滤膜(例如O.2微米膜)，可轻易实现无菌。治疗性多肽组合物通常放入具有无菌入口的容器中，例如静脉注射液袋子或带有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。C35多肽通常以水溶液或用于重建的冻干制剂，保存在单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿或小瓶。冻干制剂例如，10ml小瓶中充满5ml无菌过滤的196(w/v)C35多肽水溶液，将获得的混合物冻干。利用注射用抑菌水重建冻干的C35多肽，制备输注液。本发明还提供包含一种或多种容器的药物包装或试剂盒，其中装有一种或多种本发明的药物组合物成分。该容器带有按管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定形式的通知，其反映该机构批准生产、使用或销售，供人类药用。此外，C35可与其它的治疗化合物联合使用。显然，可以不同于上述说明书和实施例中的特别描述而实施本发明。根据上述教导，能够对本发明进行大量修改和变动，因此，在所附权利要求书的范围内，可以不同于其特别描述而实施本发明。在本发明的背景、详述、实施例和序列表中引用的每个文件(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、著作或其它公开物)的所有公开物，在此引入作为参考。显然，可以不同于上述说明书和实施例中的特别描述而实施本发明。根据上述教导，能够对本发明进行大量修改和变动，因此，在所附权利要求书的范围内，可以不同于其特别描述而实施本发明。在本发明的背景、详述、实施例和序列表中引用的每个文件(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、著作或其它公开物)的所有公开物，在此引入作为参考。序列表<110>罗切斯特大学<120>在乳腺癌和膀胱癌中差异表达的基因及编码的多肽<130>1821.004PC01<140><141><150>US60/194,463<151>2000-04-04<160>84<170>PatentlnVer.2.1<210><211><212><213>1354DNA人类(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(7),(354)<400>1gccgcgatgMetageggggagccggggcagacgtecgtagcgccccctcccSerGlyGluProGlyGinThrSerValAlaProProPro48510gaggaggtcgagccgggcagtggggtccgcategtggtggagtactgtGluGluValGluProGlySerGlyValArglieValValGluTyrCys1520253096gaaccctgcggcttcgaggcgacctacctggagctggccagtgetgtgGluProCysGlyPheGluAlaThrTyxLeuGluLeuAlaSerAlaVal354045144aaggagcagtatccgggcategagategagtegcgcetcgggggcacaLysGluGinTyrProGlylieGlulieGluSerAxgLeuGlyGlyThr505560192ggtgcctttgagatagagataaatggacagctggtgttctecaagctg240GlyAlaPheGlulieGlulieAsnGlyGinLeuValPheSerLysLeu657075gagaatgggggctttccctatgagaasgatetcattgaggccatecga288GluAsnGlyGlyPheProTyrGluLysAspLeulieGluAlalieArg8085903g3ftrg95gccAlaS3tggaSlygaa100accetagaaaagateaccascagecgtcctThrLeuGluLyslieThrAsnSerArgPro105110ccctgcgtcatectgtgaProCysVal工leLeu115336354<210>2<211>115<2.12>PRT<213>人类<400>2MetSerGlyGluProGlyGinThr15ValGluProGly20SerGlyValArgCysGlyPhe35GluAlaThrTyrLeu40GinTyr50ProGlylieGlulie55GluPheGlulieGlulieAsnGlyGin6570GlyGlyPheProTyr85Glu!LysAspSerAsnGlyGlu100ThrLeuGluIiysVallieLeu115SerValMaProProProGluGlu1015lieValValGluTyrCysGluPro2530GluLeuAlaSerAlaValLysGlu45SerArglieuGlyGlyThrGlyAla60LeuValPheSerIiysLeuGluAsn7580LeulieGluAlalieArgArgAla9095lieAsnSerArgProProCys105110<210>3<211〉51'8<212>DNA<213>人类<400>3gggccgcgatccgggca_gtgtacctggagcctcgggggcaagaatggggggagaaaccctggactctgggggagctccccttgccctttggsgcgtagccgggtccgcattggccagtgccaggtgctttctttccctatttcctgctcttgcctctttcggtscaaagaggggcsgacgcgtggtggdgtgtgaaggag.gagatagagagttctggggtacctacttsgaggaatagaatccgtsgcgctactgtgaaccagtatccggtcattgaggcgtcctccctgccaaaccttgctccttagcagattccgtcccctcccgacctgcggcttgctggtgttccgtcatcctggtctccctttaagagacactggaggtcgag60cgaggcgacc120cgagtcgcgc180tccaagctgg240gccagtaatg300tgactgcaca360ggtcctgctg420ggcctccact480518<210>4<211>621<212>D肌<213>人类<400>4ggggcccgagtcccgaggagcggcttcgagcgagatcgaggtgttctccsicgaagagccagtcatcctgttggtctccctagcaaagagatggcctigggggtaantccccggrmgccaggtcgagccgggctacctacctcgcgcctcgagctggagaagtaa￡ggagagacttgcacaitggtcctgcncctggcctcgaagganaaacgantgangggcagtggggttggagctggcggggcscsggtgggggcttta3ccctagaaggactctggg€gggsagctccsaitttgcccaaatntccattnarxgccgggaccgcatcgtgcagtgctgtgtgctttgagaccctatgsgaaagatcaccagttcctgctccccctgcctctttgggtac己cagacgtccggtggagtactaaggagcagtaagatctcatacsaigcccgttgttc七ggggggc3actna3tagcgcccccgtg33ccctgatccgggcattggacagctgtgaggccatccctcccttgcgtccaascctttagctctta3g3em3tccgacccnttcca60120180240300360420480540600621<210>5<2U>683<212>DNA<213>人类<400>5gagccggggcagacgtccgtagcgccccctcgcatcgtggtggagtactgtgaaccctgcagtgctgtgaaggagcagtatccgggcatcgcctttgagatagagataaatggacagctgccctatgagaaagatctcattgaggccatcaagatcaccaacagccgtcctccctgcgtctgctctgttctggggtccaaaccttggtctctctgrtcccctacttagctccttagcaaagacaaagaaggaatagaagattccgtggcctcacttctccagccacctcatacccccttccctcttcgnctcggtaatacctgtctgatgcgggcaatgtcagctsttgccagtcccgagrgaggtcgagccgggcagtggggtc60ggcttcgaggcgacctacctggagctggcc120gagatcgagtcgcgcctcgggggcacaggt180gtgttctccaagctggagaatgggggcttt240cgaagagccagtaatggagaaaccctagaa300atcctgtgactgcacaggactctgggttcc360ccctttggtcctgctgggagc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液中具有该活性的蛋白质。23.利用权利要求22的方法制备的产物。24.分离的核酸分子，其包含具有与选自下列的序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸(a)SEQIDNO:l的多核苷酸片段；(b)编码SEQIDN0:2的多肽片段的多核苷酸；(c)编码SEQIDN0:2的多肽结构域的多核苷酸；(d)编码SEQIDN0:2的多肽表位的多核苷酸；(e)编码具有生物学活性的SEQIDN0:2的多肽的多核香酸；(f)作为SEQIDN0:2XXXX幻的变体的多核苷酸；(g)作为SEQIDNO:l的等位基因变体的多核苷酸；(h)编码SEQIDN0:2的物种同系物的多核苷酸；(i)能够在严格条件下与(a)-(h)中指定的任何一种的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格条件下不与具有仅仅A残基或仅仅T残基的核苷酸序列的核酸分子杂交。25.分离的多肽，其包含与选自以下的序列至少95%相同的氨基酸序列(a)SEQIDN0:2的多肽片段；(b)具有生物学活性的SEQIDN0:2的多肽片段；(c)SEQIDN0:2的多肽结构域；(d)SEQIDN0:2的多肽表位；(e)SEQIDNo:2的分泌型的成熟形式；(f)SEQIDNo:2的全长分泌型;(g)SEQIDN0:2的变体；(h)SEQIDN0:2的等位基因变体；或(i)SEQIDN0:2的物种同系物。26.用于个体肿瘤诊断的方法，其包括测定该个体的细胞或体液中编码C35蛋白质的基因的表达水平，并与标准C35基因表逸水平相比较，基因表达水平超过标准则预示恶性肺瘤。27.权利要求26的方法，其中所述肺瘤是人乳腺癌。28.药物组合物，其包含权利要求ll的分离的多肽及药物可接受的载体。29.权利要求28的药物组合物，其另外包含佐剂。30.在宿主中产生免疫应答的方法，其包含给予所述宿主权利要求28或29的药物组合物。31.权利要求30的方法，其中所述宿主是人。32.在宿主中产生特异性抗体和/或T细胞的方法，其包含在所述宿主中引入足够量的病毒载体，以刺激产生特异性抗体和/或T细胞，其中所述病毒载体包含可操作性连接启动子的、能够在所述宿主中表达的编码C35抗原的多核苷酸。33.权利要求32的方法，其中所述宿主是人。34.权利要求33的方法，其中所述抗体和/或T细胞特异性针对人的癌症。35.权利要求32的方法，其中所述病毒载体是痘苗病毒。36.权利要求32的方法，其中所述病毒载体是活的。37.权利要求32的方法，其中所述病毒载体是减毒的。全文摘要本发明涉及在人类癌症中差异表达的新的人基因。更具体而言，本发明涉及编码在人乳腺癌和膀胱癌中过表达的、称为C35的新的人多肽的多核苷酸。本发明还涉及C35多肽及其载体、宿主细胞、C35多肽的抗体，及其重组制备方法。本发明进一步涉及检测癌的诊断方法，包括人乳腺癌。本发明另外涉及C35基因及多肽在免疫原性组合物或疫苗中的组成和应用，以诱导针对表达C35基因的靶细胞(例如肿瘤细胞)抗体或细胞介导的免疫。本发明还涉及鉴定C35活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。蛋白质序列MSGEPGQTSVAPPPEEVEPGSGVRIVVEYCEPCGFEATYLELASAVKEQYPGIEIESRLGGTGAFEIEINGQLVFSKLENGGFPYEKDLIEAIRRASNGETLEKITNSRPPCVIL*文档编号C12Q1/02GK101643732SQ200910007590公开日2010年2月10日申请日期2001年4月4日优先权日2000年4月4日发明者E·E·埃文斯,M·A·博雷罗,M·佐德尔申请人:罗切斯特大学