一种抗菌肽基因的制备及表达方法

专利名称：一种抗菌肽基因的制备及表达方法
技术领域：
本发明涉及一种抗菌肽基因及其制备方法。
背景技术：
近年来，抗生素、化药在养殖业中的大量滥用，导致细菌耐药性的不断出现，一些感染性疾病严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。化药在肉食品中的残留为人类健康埋下巨大的隐患。因此，寻找能够代替抗生素、化药的新型生物制剂迫在眉睫。抗菌肽(antimicrobial peptides 或 antibacterial peptides)是一类具有抗菌活性的活性妝类物质，是生物体内天然防御系统的重要组成部分，被称为“第二套防御体系”，具有广谱杀菌、热稳定好、水溶性好、不易产生耐药性等特点。同时，抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及一些包膜病毒都表现出显著的活性，对原虫和肿瘤细胞也具有选择性杀伤作用，但对正常的哺乳动物和昆虫细胞却无明显的毒副作用。现有技术中抗菌肽的获得主要包括天然提取、化学合成或重组表达。由于天然提取和化学合成成本较高，产量低下，因此多采用重组表达的方法获得抗菌肽。现有的可供抗 菌肽进行表达的体系主要包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞/杆状病毒群表达系统以及哺乳动物细胞表达系统四种。最初抗菌肽的表达研究是在大肠杆菌表达系统中进行的，原核表达系统具有成本低、易于操作、遗传背景清楚等特点，同时也具有大量可供选择的表达载体。但是由于原核表达系统不具备类似真核生物的表达调控机制和蛋白翻译后加工修饰的功能，其产物往往会形成包涵体，必须经过变性、复性等一系列处理才能够恢复活性，其后处理相对困难。昆虫细胞/杆状病毒群表达系统具有简便高效的优势，具有翻译后修饰、加工及转移外源蛋白的能力，但是该表达系统中外源蛋白是在极晚期病毒启动子的调控下进行的，外源蛋白有所表达时，病毒已开始凋亡。而哺乳动物细胞表达系统虽然在基因的转录后修饰，蛋白加工、分泌、糖基化等方面具有一定的优势，但是其表达成本过高，不宜进行大规模生产。

发明内容
本发明提供一种与现有技术不同的抗菌肽基因及其制备方法。本发明的抗菌肽基因为猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2，所编码的猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2首先是从哺乳动物体内分离得到的。本发明的抗菌肽基因是一种将猪蛔虫抗菌肽基因Cecropin P2优化处理后的基因Cecropin P2’，其序列为SEQ Ns I,在其序列中；第六个密码子由原来的ctc优化为ctg ;第九、第十二和第十八个密码子由原来的aaa优化为aag。经这一优化处理，可使目标基因在毕赤酵母系统中更好的进行表达。本发明所述的经优化处理后的猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2’基因制备方法是首先以寡核苷酸序列SEQ Na 2和SEQ Na 3互为引物模板进行PCR反应，得到产物1，再将产物I与SEQ Na 4互为引物模板进行PCR反应得到目标基因SEQ Na I。
用本发明所述的本发明所述的经优化处理后的猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2’基因制备酵母载体的方法是将SEQNs I克隆在pMD18-T simple载体上，得到重组质粒pMD18-T-Cecropin P2’_His6，用限制性内切酶EcoR I 和 Not I 双酶切 pMD 18-T-CecropinP2’-His6重组质粒和毕赤酵母表达载体pPIC9K，酶切产物回收后经T4 DNA Ligase连接后转化感受态细胞DH5 a，得到重组表达质粒pPIC9K-Cecropin P2’ _His6，通过Sal I单酶切使重组表达质粒线性化，经琼脂糖凝胶电泳纯化后进行胶回收，冻存备用，再将毕赤酵母GSl 15接种于YPD培养基平板上，进行培养得到沉淀物的GSl 15感受态细胞，将经上步骤处理好的GSl 15感受态细胞80 ill和10iil(20iil)线性化的重组表达质粒pPIC9K-CecropinP2’ -His6混合后，进行电转化处理，电转化处理的参数为I. 5kV、25 U F、200 Q ,5ms,经丽、MD以及抗生素G418筛选鉴定得到转化子Cecropin P2’ _His6_P。用前述方法制备的酵母载体进行诱导表达的方法是将所得到的转化子CecropinP2’ -His6-P接种于25ml BMGY中，28°C条件下200rpm振荡培养至OD6tltl达到2 6，4°C条件下3000rpm离心5min收集菌体，重悬于IOOmlBMMY (缓冲复合甲醇培养基)中，于30°C、200rpm条件下振荡培养96h，每隔24h取样1ml，并补加甲醇至终浓度为1%，取出的样品产 物4°C、3000rpm条件下离心5min，收集上清液，再经再进行分离与纯化处理。本发明的抗菌肽基因可在制备抗菌药物中的应用。本发明具有以下优点I、本发明的抗菌肽取自哺乳动物，预期就用于哺乳动物会有更好的作用与效果。Cecropin P2在2004年已由Pillai A等通过细菌诱导的方式从线虫体内分离出，其成熟肽分子量大约为4. 2kDa，不含有半胱氨酸(cys)，不会形成分子内二硫键，具有与昆虫天蚕素类抗菌肽Cecropins类似的结构，为典型的双亲性结构，具有潜在抗菌作用，但截止目前，有关其表达纯化及功能的研究尚未报道。
2、本发明在国际上首次表达优化纯化了猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2，表达纯化的Cecropin P2具有抑菌活性。3、本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，对猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2’的编码基因进行了密码子优化。本发明的Cecropin P2’的编码基因在异源表达系统中，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响，因此，利用最佳密码子的基因的重新设计能增加蛋白产量，使得蛋白生产更有效和经济。4、本发明构建的融合基因，在3’末端引入有6个组氨酸的编码序列，在3’末端引入的6个组氨酸的编码序列可方便后续蛋白表达后纯化，通过人工引入的镍柱结合标签，由于组氨酸可以特异性的结合镍离子，带有组氨酸标签的重组蛋白可以被镍柱吸附，有利于后期目的蛋白采用镍柱进行分离与纯化，从而达到纯化的目的，在其它领域的蛋白表达纯化过程中，这一技术已被广泛应用。5、本发明所表达的猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2’来自于生物体本身，对生物体的毒性较小或没有，关于这部分内容见具体实施方式
中的第9项。因此用本发明的基因制备的抗菌药物与传统抗生素类药物相比，将是一种更为安全的抗菌药物。6、本发明以巴斯德毕赤酵母表达系统进行表达，操作简单，可以利用发酵罐实现规模话生产，对质量严格控制，获得大量的目标蛋白，更好地发挥其作用。7、本发明以毕赤酵母表达系统进行表达，选用pPIC9K载体进行分泌性表达，与原核表达相比，表达量要高，蛋白能够在真核系统中更好地折叠成天然构象，且以可溶形式存在，其活性要远高于包涵体蛋白。酵母生长速度极快，本发明所采用的PPIC9K载体使用的乙醇氧化酶基因(AOXl)启动子为强诱导型启动子，可有效调控外源基因的高效表达，其表达产量约为细菌、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统产量的10 100倍。参见以下参考文献[I]孔凡红，钟维霞，王洪法，等.生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展[J].中国病原生物学杂志，2009，4 (9) :700 702.[2]王清路，李俏俏，张杰，等.巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用[J].生物技术通报,2006，17 (4) :640 643.[3]Cregg J M, Cereghino J L,Shi J,et al. Recombinant protein expressionin Pichia pastoris[J]. Mol Biotechnol,2000,16(I) :23-52. 8、本发明利用适于小分子蛋白以及肽类物质分离的Tris tricine-SDS_PAGE系统进行检测，成功获得了分子量大小约为5kDa的表达蛋白。9、本发明在Tris tricine-SDS-PAGE过程中，利用三层胶(5%浓缩胶、10%夹层胶、18%浓缩胶)对目标蛋白进行分离检测。其中，利用三层胶对蛋白进行分离检测已在相关领域中有所应用，采用三层胶，是为了让小分子蛋白能够得到更好的分离，夹层胶在分离胶和浓缩胶之间起到缓冲的作用。本发明为了分离分子量约为5kDa的蛋白，对凝胶的配方和各层胶的浓度进行了摸索，最后获得了较好的分离效果，见具体实施部分项目8和附图6。


图I为本发明经重叠聚合酶链式反应获得的Cecropin P2’目标基因的电泳图；图2为本发明的重组表达质粒pPIC9K-Cecr0pin P2’_His6的PCR鉴定核酸电泳图；图3为本发明的重组表达质粒质粒pPIC9K-Cecr0pin P2’_His6的酶切鉴定核酸电泳图；图4为本发明的重组表达质粒质粒pPIC9K-Cecropin P2’ -His6经限制性内切酶Sal I线性化的核酸电泳图；图5为本发明的Cecropin P2’ _His6_P重组酵母转化子PCR鉴定电泳图；图6为本发明的Cecropin P2’ _His6_P酵母表达产物的Tris tricine-SDS-PAGE电泳图；图7表示巴斯德毕赤酵母密码子偏好性；图8为本发明的Cecropin P2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果。
具体实施例方式本发明的具体实施方式
如下本发明所使用的主要材料菌株与载体大肠杆菌感受态细胞JM109、DH5 a、DNA Marker和pMD18_Tsimple载体均购于TaKaRa Biotech公司；毕赤酵母GSl 15菌株(his , mut+),表达载体pPIC9K为本实验保存；大肠杆菌CMCC44102菌株、金黄色葡萄球菌CMCC26003菌株购于中国兽微生物菌
种保藏管理中心。主要试剂与试剂盒蛋白质marker、乙二醇、Tricine、Acryl/BisSolutioruYeastNitrogen Base (YNB)等均购于生工生物工程(上海)有限公司；抗生素G418为Invitrogen公司产品；酵母提取物(Yeast extract)和蛋白胨(Trptone)为OXOID公司产品；琼脂粉(Agar)、琼脂糖、考马斯亮蓝R-250、山梨醇等购于Sigma公司；甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、磷酸、以及丙三醇等购于天津化学试剂有限公司；葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等购自于北京化工厂；甘氨酸为Genearay Biotech公司产品；过硫酸铵购于宝信生物科技有限公司；T4 DNA Ligase, Ex Taq、酶限制性内切酶Not I、EcoR I、Sal I等均购自于TaKaRaBiotech 公司。质粒提取试剂盒、PCR纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒、PMD18-T载体连接试剂盒等均购自于TaKaRa Biotech公司。主要仪器高速冷冻离心机、移液器、PCR仪均购于 德国Eppendorf公司；电子天平为北京赛多斯仪器系统有限公司产品；电热恒温培养箱购于上海精密实验设备公司；DYY-6C电泳仪、水平摇床购于北京六一仪器厂；电热恒温水槽为上海精宏实验设备有限公司产品；核酸电泳槽、蛋白电泳槽均购于北京君意东方电泳设备有限公司；电转仪购于Bio-Rad 公司，3KDa、10KDa、30KDa 规格的超滤管 Amicon-Ultra-15 均购自于 Millipore 公司。具体操作如下I，引物合成本发明根据抗菌肽Cecropin P2’编码基因(Genbank检索序列号为AB186037)以及毕赤酵母表达载体PPIC9K的多克隆位点设计3条寡核苷酸序列。Cl-F(48bp) :5，-GCCGAATTCAGTTGGCTCAGCAAAACCTACAAGAAACTCGAGAACTCA-3’ (5，端引入EcoR I酶切位点)，即SEQ Na 2。C2-R(58bp) :5’ -GTATGGCGATAGCAATGCCTTCTGAGATGCGCTTTTTTGCTGAGTTCTCGAGTTTCTT-3，，即 SEQ Na 3。C3-F(60bp) 5，-ATTGCTATCGCCATACAGGGTGGTCCGCGTCATCATCATCATCATCATTAAGCGGCCGCC(3，端引入Not I酶切位点，方框内为6Xhis标签)，即SEQ Ns 4。其中C2-R为反向互补序列，Cl-F与C2-R序列之间有18bp的核苷酸序列互补配对，C2-R与C3-F序列之间有16bp的核苷酸序列互补配对。Cl-F和C3-F序列上分别带有EcoR I和Not I酶切位点，C3-F序列中还包含his标签的编码序列。2，聚合酶链式反应扩增目标基因(I)目标基因的扩增Cl-F 与 C2-R 互为引物、模板，PCR 反应条件为94°C 5min, (94°C 30s,52°C 30s、72°C 40s)进行30个循环，72 °C lOmin，得到PCR产物I。PCR产物I与C3-F互为引物、模板，PCR 反应条件为94°C 5min, (94°C 30s、51°C 30s,72°C 40s)进行 30 个循环，72°ClOmin，得到PCR产物2即目标基因序列(此序列即SEQNa 1)，如下gcc gaa ttc agt tgg ctg agt aat acc tac aag aat ctc gag aac 45Ala Glu Phe Ger Trp Leu Ger Lys Thr Tyr Lys Lys Leu Glu Asn151015tea gca aat aag cgc ate tea gaa ggc att get ate gcc ata cag 90Ger Gla Lys Lys Arg He Ger Glu Gly He Gla He Gla He Gln16202530
ggt ggt ccg cgt cat cat cat cat cat cat taa gcg gcc gcc132Gly Gly Pro Arg His His His His His His 终止 *** *** ***313540(2)扩增结果3条寡核苷酸片段互为引物进行重叠PCR，得到的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，得到了目的大小的条带，参见图1，大小为132bp。3，重组表达质粒的构建与鉴定(I)重组表达质粒的构建通过T-A克隆，将PCR产物克隆在pMD18-T simple载体上，这一经克隆后的载体 命名为pMD18-T-Cecropin P2’_His6。在本发明的相关实验中对克隆产物利用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pMDl 8-T-Cecropin P2’ _His6重组质粒和毕赤酵母表达载体PPIC9K，酶切产物回收后经T4 DNA Ligase连接后转化感受态细胞DH5 a，筛选到的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。鉴定正确的重组表达质粒名为pPIC9K-Cecropin P2’_His6。(2)鉴定结果重组克隆质粒pPIC9K_Cecropin P2’_His6与毕赤酵母表达载体pPIC9K经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后连接并转化入E. coli DH5a感受态细胞，获得重组的表达质pPIC9K-Cecropin P2’ _His6。以pPIC9K通用引物为扩增引物，对获得的重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在正确位置检测到了目标大小的条带(图2、图3)。阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果经生物信息学软件分析，结果证明目标基因未发生突变并且在载体上的插入位置正确。4.酵母相关试剂的配制10 XD (20% D-葡萄糖)D_葡萄糖200g,充分溶于IOOOml去离子水中，高压灭菌15min，4°C保存备用。IOXYNB YNB 134g，充分溶解于去离子水中之后，定容至1000ml，过滤除菌，4°C
保存备用。10 XM(5%甲醇)甲醇50ml，加入到950ml去离子水中，混匀后过滤除菌,4°C保存备用。10XGY(10%甘油):甘油100ml，加入到900ml去离子水中混匀，压灭菌15min，
4 °C保存备用。500 X B (0. 002%生物素):生物素200mg，加入到IOOOml去离子水中，混匀后过滤
除菌，4 °C保存备用。pH 6. 0磷酸盐缓冲液磷酸氢二钾30. 125g，磷酸二氢钾118. 125g，在去离子水中充分溶解之后，定容至1000ml，利用KOH或磷酸调pH至6.0，高压灭菌，4°C保存备用。Yro培养基蛋白胨20g，酵母提取物10g，充分溶于900ml去离子水，高压灭菌20min，待冷却之后加入100ml 10XD，4°C保存备用。制备YPD平板时，加入15g/L Agar。MD培养基Agar 15g溶于800ml去离子水中，高压灭菌20min,冷却至60°C左右加A 10XYNB 100ml, IOXD 100ml, 500XB 2ml，混匀后倒平板，4°C保存备用。MM培养基Agar 15g溶于800ml去离子水中，高压灭菌20min,冷却至60°C左右加A 10XYNB 100ml, IOXM 100ml, 500XB 2ml，混匀后倒平板，4°C保存备用。
BMGY培养基蛋白胨20g，酵母提取物10g，充分溶于700ml去离子水中，高压灭菌 20min，冷却后加入 10XYNB 100ml,10XGY 100ml, pH 6. 0 磷酸盐缓冲液 100ml，500XB2ml，4 °C保存备用。BMMY培养基蛋白胨20g，酵母提取物10g，充分溶于700ml去离子水中，高压灭菌 20min，冷却后加入 10XYNB 100ml, IOXM 100ml, pH 6. 0 磷酸盐缓冲液 100ml，500XB2ml，4 °C保存备用。5，Cecropin P2’ _pPIC9K_His6 电转化毕赤酵母 GS1155. I线性化通过Sal I单酶切使重组表达质粒线性化，线性化产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，重组表达质粒pPIC9K-Cecropin P2’ -His6已被完全切开(图4)，产物采用TaKaRaBiotech公司DNA凝胶回收试剂盒操作方法对目标片段进行胶回收，冻存于_20°C备用。 5. 2制备GSl 15感受态细胞(I)用划线法接种冻存在_70°C的毕赤酵母GS115菌株于YPD固体培养平板上，28 °C恒温培养2d ；(2)从YPD培养板上挑取单菌落，接种于5mlYPD液体培养基中，28 °C 200rpm振荡培养16 18h ；(3)取Iml过夜培养物接种于IOOml新鲜的YPD液体培养基中，28 °C 200rpm振荡培养至OD值(OD6J达到I. 0 I. 3 ;(4)将步骤3中的培养物于,4°C 3000rpm离心5min,弃上清；(5)将步骤4中的沉淀用IOOml预冷的灭菌水悬浮洗漆，4°C 3000rpm离心5min,
弃上清；(6)将步骤5中的沉淀用50ml预冷的灭菌水悬浮洗漆,4°C 3000rpm离心5min,弃
上清；(7)用4. 5ml冰预冷的IM山梨醇悬浮步骤6中的沉淀,分装到I. 5ml离心管中，4°C 3000rpm 离心 5min,弃上清；(8)用Iml冰预冷的IM山梨醇悬浮步骤7中的沉淀至终体积为I. 5ml，标记为“感受态”。5. 3 电转化(I)将80 ill标记为感受态的GSl 15感受态细胞和10 U I线性化的DNA充分混合后，再将混合液转移入预先冰浴的电转杯中；(2)将电转杯在冰上放置5min ；(3)电击，电击参数为Cuvette Gap :2mm ;电压1. 5kV ;电容25 ii F ;电阻400 Q ;电击时间5ms。(4)电击后立即加入Iml冰预冷的IM山梨醇，将溶液转移到新的灭菌离心管中；(5)将离心管中的溶液分成200 300 ill等分，涂布于预先准备好的MD平板上；(6) 28°C恒温培养MD平板，直至有单克隆产生。6，Mut+转化子与高拷贝转化子的筛选和鉴定(I)转化子的筛选和鉴定将MD平板上长出的单克隆分别转接到MD和MM (Minimal Methanol medium,最小甲醇介质)琼脂板上，28°C恒温培养2d，观察转化子的生长情况。在MD和丽平板上均良好生长的转化子为甲醇利用快速型(Mut+)转化子，在MD平板上长势良好，在丽平板上不长或生长缓慢的转化子为甲醇利用慢速型(Muts)转化子。将筛选得到的Mut+转化子挑单克隆菌落接种至分别含有0. 5、I. 0,2. 0,3. Omg/ml G418的YPD平板上，28°C静置培养，筛选Mut+表型的高拷贝酵母转化子。利用煮沸法制备Mut+转化子的PCR模板，采用pPIC9K通用引物，对筛选到的转化子进行PCR鉴定。(2)鉴定结果将筛选得到的Cecropin P2’-His6_P转化子经过煮沸法进行菌落PCR后，采用1%凝胶电泳对PCR结果进行检测，鉴定出12株Cecropin P2’ _His6_P阳性克隆(图5)。7，诱导表达将PCR鉴定为阳性的转化子接种于25ml BMGY (缓冲复合甘油培养基)中，28°C条 件下200rpm振荡培养至OD6tltl达到2 6,4°C条件下3000rpm离心5min收集菌体,重悬于IOOml BMMY (缓冲复合甲醇培养基)中，于30°C、200rpm条件下振荡培养96h，每隔24h取样1ml，并补加甲醇至终浓度为1%。取出的样品产物4°C、3000rpm条件下离心5min，收集上清液，-20°C冻存待检。8, Tris tricine-SDS-PAGE 检测重组表达的 Cecropin P2’(I)相关溶液的配制5 X Tris-甘氨酸缓冲液称取15. Ig Tris，94g甘氨酸，5. Og SDS，定容至IL0考马斯亮蓝R-250染色液45ml甲醇，45ml水，IOml冰醋酸中溶解0. 25g考马斯亮蓝R-250，室温保存。考马斯亮蓝染色脱色液冰醋酸100ml，乙醇50ml，850ml /K，充分混匀之后室温保存。10%过硫酸铵称取IOg过硫酸铵，加入IOml去离子水后搅拌溶解，贮存于4°C。IOX阳极缓冲液称取48. 44g TrisJPA 160ml去离子水充分溶解后，调pH至8. 9，定容至 200ml。IOXTris-Tricine-SDS buffer (0. IM Tris,0. IM Tricine,0. 1% SDS)。(2)凝胶配方与浓度
_M_分离胶夹层胶浓缩胶
19:1 Acrylamide3.272 ml - -
29:1 Acrylamide- 0.814 ml 0.400 ml
「 n 1.5 M Tris-Hcl-SDS (pH 8.45)3 ml1.334 ml0.992 ml
甘油0.96 ml————
去离子水l_768ml1.852 ml1.888 ml
10%过硫酸铵80 040 ^il40
TEMED10 ^il6^16^1
总体积9 ml4 ml 4 ml(3) Tris tricine-SDS-PAGE 检测重组表达的 Cecropin取_20°C冻存的上清液浓缩后与等体积的2 X上样缓冲液混合，沸水浴7 IOmin后，再经 IOOOOrpm 离心 5min,取上清 15 U I 进行 Tris tricine-SDS-PAGE 电泳[7]。Tristricine-SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为18%，夹层胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。①制胶将电泳玻璃板洗净控干之后，按照操作说明固定在配胶架上。按照说明书先配18%的Tris tricine-SDS-PAGE电泳胶，其中分离胶浓度为18%，夹层胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。依次灌注于两玻璃板之间，待其凝固。②安装小心移去梳子，用去离子水冲洗加样槽几次，放入电泳槽，然后在电泳槽的阴极加入I XTris-Tricine-SDS buffer,阳极加入I X阳极缓冲液。③样品的制备、上样与电泳将表达上清液用超滤管进行50倍浓缩后，加入等量的2 X SDS-PAGE上样缓冲液，使二者混匀，水浴煮沸5 lOmin，待冷却之后，上样5 IOul/孔。加样完毕之后，将电压设置为60V，待溴酚蓝进入夹层胶之后，将电压调为80V，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压调整为120V，继续恒压电泳直至溴酚蓝到达凝胶底层。④染色电泳完毕之后，从电泳槽中小心取出凝胶板，用蒸馏水冲洗之后，用起胶板取出胶片用蒸馏水冲洗，之后将其固定于水平摇动的摇床上，倒入染色液，室温染色3小时。⑤脱色染色结束后，倒掉染色液，用蒸馏水冲洗胶片之后，加入新鲜的脱色液，置于水平摇床上脱色5 8个小时，期间更换脱色液3 4次。待蓝色背景脱净之后，将凝胶置于蒸馏水中终止脱色，观察结果。(4)重组蛋白 Tris tricine-SDS-PAGE 检测结果18% Tris tricine-SDS-PAGE 电泳检测 Cecropin P2’-pPIC9K_His6 表达产物，检测到了单一的目标大小的条带(图6)。9，重组表达蛋白Cecropin P2’的细胞毒实验将纯化后的重组蛋白Cecropin P2用0. 22 滤器过滤后，分别以IOul 120ul不同体积与MDBK细胞(牛肾细胞)、CHO细胞(仓鼠卵巢细胞)以及DC细胞(树突状细胞)共同培养两天后在显微镜下观察。结果显示，该重组白对以上三种细胞的生长与增殖没有明显影响，初步说明该融合蛋白对这三种细胞没有攻击性。10，重组蛋白抑菌活性试验(I)重组蛋白抑菌活性试验本试验采用琼脂糖扩散法对重组表达的抗菌肽Cecropin P2的抑菌活性进行检测(韩晋辉，等，2008)。将处于对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养物各取300 u I与相应的固体培养基25ml在45°C左右混匀，待凝固后，在培养基表面贴直径为5mm左右的灭菌滤纸片，将5iU浓缩后的待测样品表达上清滴加于滤纸片上，以含有PPIC9K空载体的酵母诱导上清为阴性对照，37°C培养12个小时之后进行观察。(2)抑菌试验结果采用琼脂糖扩散法对重组抗菌肽的抑菌活性进行检测，经过12h的37°C恒温培养，结果显示，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌琼脂糖平板上，以滴加重组抗菌肽的滤纸片为、中心，分别有直径约为I. 5cm和3cm的抑菌圈，此结果表明，重组抗菌肽对大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌均具有一定的抑菌活性，参见图8。
权利要求
1.一种抗菌肽基因，其特征在于这种抗菌肽基因为猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2。
2.根据权利要求I所述的抗菌肽基因，其特征在于经优化处理后的基因CecropinP2’包括有SEQ Ns I序列，其中；第六个密码子由原来的ctc优化为ctg;第九、第十二和第十八个密码子由原来的aaa优化为aat。
3.权利要求2所述的抗菌肽基因制备方法，其特征在于首先以寡核苷酸序列SEQNo 2和SEQ Na 3互为引物模板进行PCR反应，得到产物1，再将产物I与SEQ Na 4互为引物模板进行PCR反应得到目标基因SEQ Na I。
4.用权利要求3所述的基因制备酵母载体的方法，其特征在于将SEQN2 I克隆在PMD18-T simple载体上，得到重组质粒pMD18-T_Cecropin P2，-His6,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pMD18-T-Cecropin P2’ -His6重组质粒和毕赤酵母表达载体PPIC9K，酶切产物回收后经T4 DNA Ligase连接后转化感受态细胞DH5 a，得到重组表达质粒pPIC9K-Cecropin P2’ _His6,通过Sal I单酶切使重组表达质粒线性化,经琼脂糖凝胶电泳纯化后进行胶回收，冻存备用，再将毕赤酵母GS115接种于YH)培养基平板上，进行培养得到沉淀物的GS115感受态细胞，将经上步骤处理好的GS115感受态细胞80 ill和10 u I (20 u I)线性化的重组表达质粒pPIC9K-Cecropin P2’ -His6混合后，进行电转化处理，电转化处理的参数为1.5kV、25iiF、200Q、5msJ5MM、MD以及抗生素G418筛选鉴定得到 Cecropin P2’ _His6_P 转化子。
5.权利要求4所制备的酵母载体诱导表达方法，其特征在于将所得到的转化子Cecropin P2’-His6_P接种于25ml BMGY中，28°C条件下200rpm振荡培养至0D_达到2 6，4°C条件下3000rpm离心5min收集菌体，重悬于IOOmlBMMY(缓冲复合甲醇培养基)中，于30°C、200rpm条件下振荡培养96h，每隔24h取样1ml，并补加甲醇至终浓度为1%，取出的样品产物4°C、3000rpm条件下离心5min，收集上清液，再经再进行分离与纯化处理。
6.权利要求5所述的酵母载体诱导表达方法，其特征在于利用5%浓缩胶、10%夹层胶和18%浓缩胶对目标蛋白进行分离检测。
7.权利要求2所述的抗菌肽基因在制备抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种抗菌肽基因及其制备方法。本发明的抗菌肽基因为猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2，所编码的猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2首先是从哺乳动物体内分离得到的。本发明的抗菌肽基因是一种将猪蛔虫抗菌肽基因Cecropin P2优化处理后的基因Cecropin P2’，其序列为SEQ№1，在其序列中；第六个密码子由原来的ctc优化为ctg；第九、第十二和第十八个密码子由原来的aaa优化为aag。经这一优化处理，可使目标基因在毕赤酵母系统中更好的进行表达。
文档编号A61P31/04GK102703457SQ20121015697
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者周继章, 宫晓炜, 曹小安, 费媛媛, 郑福英, 陈启伟 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所