专利名称:一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法
技术领域：
本发明涉及一种表达基因的克隆，尤其是涉及一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法。
背景技术：
许多年以来，分离差异表达基因的方法仅限于差异筛选cDNA文库，直到1992年mRNA差异显示技术(Liang P，Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of thepolymerase chain reaction.Science，1992，257967-971)，第一次实现了同时很灵敏地检测到真核细胞中大部分的转录本。近些年来，在分离和克隆差异表达基因的功能基因组学研究中，国内外学者又发展了多种分析方法，如代表性差异分析、抑制消减杂交(Diatchenko L，Lau Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA method for generating differentiallyregulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，936025-6030)和基因芯片技术等等。实践证明，这些方法的应用，取得了很多的成就，克隆了一系列的差异表达基因，均各具独特优点，但同时也具有其自身的缺陷，如有的假阳性高、有的产生的基因片段短、有的技术复杂成本高等(李斐雪，王雁玲.差异表达基因的高通量筛选方法.细胞生物学杂志，2004，26339-343；周延凯，周建林，聂东宋.筛选差异表达基因方法的新进展.生物技术通报，2004，15(6)620-622；李文雍，陈清轩.筛选差异表达基因的方法进展.阜阳师范学院学报，2004，21(1)1-6；徐德全，熊远著.差异表达基因克隆技术的研究进展.中国畜牧兽医，2004，31(3)31-34；谢伟伟，王凭青，杨青川等.植物差异表达基因克隆技术及研究进展.重庆大学学报，2005，28(12)96-100；肖朝庭，储明星，傅衍.几种基因差异表达筛选技术在动物发育与繁殖中的最新进展.中国畜牧兽医，2006，33(4)34-38)此外，引物退火时能否与其靶序列特异结合，是PCR能否成功扩增的关键因素之一，因此优化引物的结构是非常重要的。退火温度的高低决定引物是否能与其互补链完全结合，还是有一个或多个碱基错配，因此通过调整退火温度就可以增加引物与模板结合的特异性。许多研究者提出了各种办法来提高引物退火的特异性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段环状序列，以增加PCR扩增的特异性和杂交的稳定性(Brownie J，Shawcross S，TheakerJ，et al.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucleic Acids Res，1997，253235-3241；Saiki R K，Walsh P S，Levenson C H，et al.Genetic analysis of amplified DNA withimmobilized sequence-specific oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA，1989，866230-6234；Ailenberg M，Silverman M.Controlled hot start and improved specificity in carryingout PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers(TULIPS).BioTechniques，2000，291018-1024)，但这些方法并不能消除初始反应的非特异性杂交。
发明内容本发明的目的在于针对上述方法所存在的不足，提供一种具有重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长等特点的，特别有利于在非模式生物中克隆的快速特异扩增差异表达基因长片段的方法。
本发明的具体步骤为1)逆转录合成cDNA第一条链以总RNA或mRNA为模板，dT-RSL为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链；2)PCR扩增第一条cDNA链经稀释后，与dT-RSL引物和RSL随机引物混合于PCR管中退火，进行一个PCR循环反应，合成第二条cDNA链，随后将PCR反应体系中的dT-RSL和RSL随机引物分别与cDNA第二条链特异结合，经PCR循环，扩增出特异的DNA片段；3)结果检测取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物；4)采用普通方法割胶纯化差异表达基因片段，与T质粒载体连接，转入感受态细胞，对基因片段的序列进行测定和分析。
在步骤1所述的逆转录合成cDNA第一条链中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反应体系1～3μg总RNA(或0.1～0.3μgmRNA)，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀；70℃孵育2min，再在冰上冷却2min；往管中加入如下反应体系5×RTbuffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆转录酶(或其它逆转录酶)1μL，混合均匀；42℃孵育90min，再在94℃变性2min；合成的cDNA第一条链用无DNA酶双蒸水稀释10倍，置于-20℃备用。
在步骤2所述的PCR扩增中，是在PCR管中加入20μL如下反应体系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL随机引物1μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加无DNA酶双蒸水至总体积20μL，混合均匀；PCR扩增循环参数为94℃ 5min，50℃ 3～5min，72℃ 1～2min，1个循环；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40个循环；72℃，5min。
在步骤3中，所述的扩增产物取5uL，上样缓冲液取1μL。
本发明具有重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长等优点，特别有利于在非模式生物中的快速特异扩增差异表达基因长片段。
具体实施方式实施例1dT-RSL引物序列为5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTT TTT TTT TTT TTTTTT TTTT-3’RSL3随机引物序列为5’AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTI III ICC GGA GGATG-3’分别从对照组和副溶血弧菌诱导4h、1天和2天的大黄鱼肝脏中提取总RNA，每一时相各取1μg RNA等量混合后分为对照组和实验组总RNA。
1.逆转录合成cDNA第一条链1)分别在两个0.5mL的PCR管中，加入如下反应体系3μg总RNA(对照组或实验组)，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀。
2)70℃孵育2min，再在冰上冷却2min。
3)往两个管中分别加入如下反应体系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆转录酶(或其它逆转录酶)1μL，混合均匀。
4)42℃孵育90min，再在94℃变性2min。
5)合成的对照组和实验组的cDNA第一条链分别用无DNA酶双蒸水稀释10倍，置于-20℃备用。
2.PCR扩增及其结果的检测1)分别在两个0.5mL的PCR管中，加入20μL如下反应体系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL3随机引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1μL，cDNA(对照组或实验组)1μL，加无DNA酶双蒸水至总体积20μL，混合均匀。
2)PCR扩增循环参数为94℃ 5min，50℃ 3min，72℃ 2min，1个循环；94℃ 40s，65℃40s，72℃40s，35个循环；72℃，5min。
3)分别取对照组或实验组5uL扩增产物溶解于1μL上样缓冲液中，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳30min，电压5V/cm，凝胶中加入0.5ug/ml溴化乙锭。在紫外灯下观察经过电泳后的凝胶，在1350bp左右处对照组有一条比实验组亮的条带。
3.割胶纯化基因片段使用QIAEX胶回收试剂盒，具体步骤如下1)用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外灯下将所要的DNA目的片段用无菌刀片割下来，称重。
2)以3∶1的比例加入Buffer QX1。
3)先将QIAEX II用振荡器振荡30s，再往样品中加入30μL，混匀。
4)50℃水浴10min，以使琼脂糖溶解，每隔2min拿出振荡5s。
5)10000g离心1min，小心移出上清液。
6)用500μL的Buffer QX1洗涤。
7)再用Buffer PE洗涤两次。
8)将沉淀晾干10min。
9)加入20μLddH2O，振荡使其溶解。在室温下放置5min。
10)10000g离心1min，小心将上清液移到新管中。
4.与质粒载体连接往管中加入以下反应体系按1∶5的比例加入PMD18-T质粒和纯化好的基因片段，加ddH2O至5μL，再加入5μL ligation mix(TaKaRa)。混匀反应体系，在16℃下连接反应1h。
5.感受态细胞的转化及筛选将已转入基因的质粒10μL加到200μL感受态大肠杆菌DH5α中，冰上放置30min。42℃热激1min，冰上再放置2min。加入900μL LB液体培养基，37℃振荡(300r/min)1h。将40μL2％X-gal和14μL10％IPTG均匀涂布在含Amp(60μg/mL)LB培养基表面，再在培养基表面均匀涂布100μL细菌培养液，37℃培养过夜。挑具有白斑的单克隆于5mL LB(含60μg/mL Amp)液体培养基中扩大培养。
6.提取并检测质粒用V-gene质粒提取试剂盒提取，具体步骤如下1)取2mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。
2)用0.25mL已加入RNaseA1的S1溶液悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
3)加0.25mLS2溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不应超过5min。
4)加入0.4mL 4℃预冷的S3溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置2min。12000g离心5min。
5)吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2mL离心管中)，3600rpm离心1min。
6)将制备管置回离心管，加0.5mL W1溶液，3600rpm离心1min，弃滤液。
7)将制备管置回离心管，加0.7mL W2溶液，3600rpm离心1min，以同样的方法再用0.7mLW2溶液洗涤一次，弃滤液。
8)将制备管移入离心管中，12000g离心1min。
9)将制备管移至新的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加60μL水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱DNA。
10)用紫外分光光度计检测其含量。
7.检测质粒插入片段在PCR管中，加入20μL如下反应体系10×buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM M13正向引物0.5μL，10μM M13反向引物0.5μL，5U/uLTaq DNA聚合酶0.2μL，15.9μL ddH2O，0.5μL模板DNA。
PCR扩增循环参数为95℃，1min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；4℃，5min。用琼脂糖凝胶检测PCR扩增的产物。
8.测序PCR及其纯化用MegaBACE测序试剂盒，反应体系为模板DNA100ng，mix4μL，1ulM13正向引物2μL，加ddH2O至10μL。PCR扩增循环参数为95℃，20s；95℃ 15s，50℃ 20s，60℃ 90s，30个循环；4℃，5min。往PCR产物中加入28.5μL 100％乙醇和NH4Ac的混合物(27.5∶1)颠倒混匀，静置10min，12000g离心15min，弃尽上清液；加入300μL 75％乙醇，12000g离心3min，弃尽上清液；将沉淀晾干5min后加入10μL loading solution。
9.全自动序列测定及分析用MegaBACE500毛细管自动DNA测序系统进行自动测序，获得1个1360bp纤维蛋白原β链基因长片段的抗病候选基因，已有研究表明该基因的表达水平可受病原体感染诱导而提高，可能是参与机体免疫机能的重要基因。
权利要求
1.一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于其步骤为1)逆转录合成cDNA第一条链以总RNA或mRNA为模板，dT-RSL为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链；2)PCR扩增第一条cDNA链经稀释后，与dT-RSL引物和RSL随机引物混合于PCR管中退火，进行一个PCR循环反应，合成第二条cDNA链，随后将PCR反应体系中的dT-RSL和RSL随机引物分别与cDNA第二条链特异结合，经PCR循环，扩增出特异的DNA片段；3)结果检测取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物；4)采用普通方法割胶纯化差异表达基因片段，与T质粒载体连接，转入感受态细胞，对基因片段的序列进行测定和分析。
2.如权利要求
1所述的一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于在步骤1所述的逆转录合成cDNA第一条链中，是在0.5mL的PCR管中加入如下反应体系1～3μg总RNA或0.1～0.3μg mRNA，10μM dT-RSL2μL，加无RNA酶双蒸水至总体积12μL，混合均匀；70℃孵育2min，再在冰上冷却2min；往管中加入如下反应体系5×RT buffer4μL，10mMdNTP1μL，20mM DTT2μL，200u/uL MMLV逆转录酶或其它逆转录酶1μL，混合均匀；42℃孵育90min，再在94℃变性2min；合成的cDNA第一条链用无DNA酶双蒸水稀释10倍，置于-20℃备用。
3.如权利要求
1所述的一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于在步骤2所述的PCR扩增中，是在PCR管中加入20μL如下反应体系10×PCR buffer2μL，10mMdNTP0.4μL，10μM dT-RSL1μL，10μM RSL随机引物1μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.1～0.2μL，cDNA1～3μL，加无DNA酶双蒸水至总体积20μL，混合均匀；PCR扩增循环参数为94℃5min，50℃3～5min，72℃1～2min，1个循环；94℃40s，65℃40s，72℃40s，35～40个循环；72℃，5min。
4.如权利要求
1所述的一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，其特征在于在步骤3中，所述的扩增产物取5uL，上样缓冲液取1μL。
专利摘要
一种快速特异扩增差异表达基因长片段的方法，涉及一种表达基因的克隆。提供一种重复性高、假阳性低、快速实惠和获得的基因片段较长的快速特异扩增差异表达基因长片段的方法。步骤为以总RNA或mRNA为模板，dT－RSL为引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链；PCR扩增第一条cDNA链经稀释后，与dT－RSL引物和RSL随机引物混合于PCR管中退火，进行一个PCR循环反应，合成第二条cDNA链，随后将PCR反应体系中的dT－RSL和RSL随机引物分别与cDNA第二条链特异结合，经PCR循环，扩增出特异的DNA片段；取扩增产物溶解于上样缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物。
文档编号C12P19/34GK1995390SQ200610135246
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月24日
发明者王艺磊, 张子平, 谢芳靖 申请人:集美大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan