专利名称:农杆菌介导的大型番茄的转化方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中对植物进行基因转化的方法，特别是涉及对番茄进行基因转化的方法，尤其是涉及一种用农杆菌介导的对大型番茄进行基因转化的方法。
背景技术：
1983年世界首例转基因植物培育成功，1985年Horch创造了农杆菌转化中的叶盘法，自此以后分别建立了农杆菌介导法、病毒介导法、PEG介导法、电击穿孔法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及35个科的50多个物种，共120多种植物。经过多年的实践和优胜劣汰，多数转化方法已被逐步放弃，形成了以农杆菌介导法和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数85％左右。双子叶植物是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌Ti质粒介导法，已经建立了多种双子叶植物的基因转移体系，并将一些优良的外源基因转入双子叶植物，育成了转基因品种。
番茄是一种典型的双子叶植物，其独特的风味、丰富的营养、鲜艳的色彩和特殊的医用价值吸引着越来越多的消费者。因此，利用生物工程技术对加工番茄进行改良，以获得优质番茄品种的研究工作方兴未艾。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、稳定、简便的利用农杆菌介导对大型番茄进行基因转化的方法。该方法很好地克服了以往大型种植番茄转化中容易出现的外植体易褐化，生芽率低，生根难以及移土成活率低等缺点，具有较高的转化效率。
本发明的技术方案是一种农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于是将番茄外植体与含有Ti质粒载体的农杆菌共培养，所述Ti质粒载体携带一个或多个外源基因，将质粒载体上的外源基因转入到受体基因组中，经植株转化再生得到转基因植株。
本发明的有益效果是本发明以子叶作为外植体，通过农杆菌介导的方法进行番茄转化，适用于各种大型番茄，具有较高的转化效率。该方法很好地克服了以往大型种植番茄转化中容易出现的外植体易褐化，生芽率低，生根难以及移土成活率低等缺点，为以大型番茄为材料的分子生物学研究和利用基因工程技术进行优质新品种培育提供了有力的工具。利用以上建立的农杆菌转化番茄的方法，已经将LeCOP1LIKE基因的反义RNA表达载体导入大型加工番茄UC82B之中，通过PCR检测获得多株整合进外源基因的转基因番茄株系。
图1为质粒pLC图；图2为转基因植株；图3为转基因植株的检测。
具体实施方式
本发明方法一般包括以下内容该方法是将番茄外植体与含有Ti质粒载体的农杆菌共培养，所述題Ti质粒载体携带一个或多个外源基因，将质粒载体上的外源基因转入到受体基因组中。
所述外植体来自萌发7-8天的大型番茄幼苗的子叶。所述大型番茄为各种加工番茄。所述加工番茄可以为UC82B。
所述农杆菌为LBA4404菌株或GV3101菌株。
为了使转化效果更高，所述农杆菌在转化前用含有200μM乙酰丁香酮(AS)的MS培养基进行重悬。
所述农杆菌感染液的浓度以OD600值为0.6-0.8时较好。
所述农杆菌侵染番茄外植体的时间以10分钟为宜。
共培养过程是，所述番茄外植体与农杆菌在28℃黑暗条件培养24小时，之后在24℃光下培养24小时。
所述共培养培养基是加入200μg/ml肌醇、200μM乙酰丁香酮(AS)、0.8μg/ml吲哚乙酸(IAA)、0.8μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的MS培养基。
本发明在转化和再生过程中，所述共培养结束后的选择培养基为含有200μg/ml肌醇、1.5μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1μg/ml吲哚乙酸、500μg/ml羧苄青霉素、3*10-2μg/mg VB1的MS培养基；分化的再生芽在含有200μg/ml肌醇、0.1μg/ml吲哚乙酸、200μg/ml羧苄青霉素的MS培养基上生根。
下面结合具体的实施例对本发明方法作进一步说明实施例1.外植体的获得取品系编号为UC82B的野生番茄的种子进行消毒，70％的乙醇浸泡90秒，用无菌水冲洗3-4次，再用10％安替福民浸泡12分钟，用无菌水冲洗7-8次，之后将种子转移到1/2MS培养基上生长。待子叶完全展开切下番茄幼苗的子叶，置于共培养培养基(MS培养基含200μg/ml肌醇、200μM乙酰丁香酮(AS)、0.8μg/ml吲哚乙酸(IAA)、0.8μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA))，24度光照培养24小时。
2.表达载体的构建利用常规基因工程方法从番茄中克隆了LeCOP1LIKE基因的部分cDNA片段，并利用其非保守域构建反义RNA表达载体-pLC。该表达载体以pBI121为基本载体，LeCOP1LIKE基因反义片断受CaMV 35S启动子驱动。该质粒T-DNA上还含有NOS启动子调控的NPTII基因(如图1)。
3.农杆菌的培养接种已转入pLC质粒的土壤农杆菌LBA4404单菌落于10ml含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的液体YEP培养基中。28℃快速振荡培养24小时；然后取其中1ml转到含相同抗生素的20ml液体YEP培养基中，28℃快速振荡培养24小时。
4.共培养待农杆菌长到OD600在0.6至0.8之间时，将农杆菌4000rpm离心5分钟，并用含有200μM乙酰丁香酮(AS)的液体MS培养基重悬农杆菌，使最后的OD600值达到0.7左右。
将上面提到的切下来的子叶放在此稀释好的农杆菌菌液中，侵染10分钟。将外植体转移到先前的共培养基上，共培养两天，第一天28℃暗培养，第二天在24℃光培养。
5.外植体的选择与植株再生将外植体转到选择培养基，即MS培养基中含有200μg/ml肌醇、1.5μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1μg/ml吲哚乙酸、3*10-2μg/mg VB1以及用于转化筛选的抗生素卡那霉素50μg/ml。24度16小时光照培养。
当再生芽3cm高时，将它们转至生根培养基，即MS培养基含200μg/ml肌醇、0.1μg/ml吲哚乙酸、200μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素。
6.将经过练苗培养后的的幼苗移栽到温室，得到转基因植株(图2)。
在上述实施例中，可以将外源功能基因整合到到番茄染色体上。本发明的发明人利用常规方法设计针对检测外源基因的引物，用PCR的方法扩增到了LeCOP1LIKE基因的反义片断(图3)图中LC-A，LC-C，LC-E为转基因植株，WT，野生型，P，质粒正对照，N，负对照。
权利要求
1.一种农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于是将大型番茄外植体与含有Ti质粒载体的农杆菌共培养，所述Ti质粒载体携带一个或多个外源基因，将质粒载体上的外源基因转入到受体基因组中，经植株转化再生得到转基因植株。
2.根据权利要求
1所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的外植体来自萌发7-8天的大型番茄幼苗的子叶；所说的大型番茄指加工番茄。
3.根据权利要求
1或2所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的农杆菌为LBA4404菌株或GV3101菌株。
4.根据权利要求
3所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的农杆菌在转化前用含有200μM乙酰丁香酮(AS)的MS培养基进行重悬。
5.根据权利要求
1或4所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的农杆菌感染液的浓度OD600值为0.6-0.8；农杆菌侵染番茄外植体的时间为10分钟。
6.根据权利要求
1所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的共培养过程是番茄外植体与农杆菌在28℃黑暗条件培养24小时，之后在24℃光下培养24小时。
7.根据权利要求
1或6所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的共培养培养基是加入以下成分的MS培养基200μg/ml肌醇、200μM乙酰丁香酮(AS)、0.8μg/ml吲哚乙酸(IAA)、0.8μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)。
8.根据权利要求
1所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的在转化过程中，所述共培养结束后的选择培养基为加入200μg/ml肌醇、1.5μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1μg/ml吲哚乙酸、500μg/ml羧苄青霉素、3*10-2μg/mg VB1的MS培养基。
9.根据权利要求
1或8所述的农杆菌介导的大型番茄的转化方法，其特征在于所说的再生过程中，分化的再生芽在含有200μg/ml肌醇、0.1μg/ml吲哚乙酸、200μg/ml羧苄青霉素的MS培养基上生根。
专利摘要
本发明涉及一种用农杆菌介导的对大型番茄进行基因转化的方法。该发明以子叶作为外植体，通过农杆菌介导的方法进行番茄转化，适用于各种大型番茄，具有较高的转化效率。该方法很好地克服了以往大型番茄转化中容易出现的外植体易褐化，生芽率低，生根难以及移土成活率低等缺点，为以大型番茄为材料的分子生物学研究和利用基因工程技术进行优质新品种培育提供了有力的工具。
文档编号A01H4/00GK1995359SQ200610130675
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月29日
发明者王宁宁, 崔孟祥 申请人:南开大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan