SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库的制作方法

专利名称：SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库的制作方法
技术领域：
本发明涉及SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库。
背景技术：
SARS是由冠状病毒的一个新的变种引起的严重传染性疾病，其传播快、病情严重、病死率高，已成为新世纪严重危害人类健康的瘟疫。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列。利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA的扩增。因此，抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率。所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA称为测试方(tester)，把参考cDNA称为驱动方(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。接头为双链DNA片段，且5’-端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，两个接头含有可识别的序列。接下来进行两次杂交。第一次杂交在每个测试方里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试方cDNA与驱动方cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。第二次杂交，将进行过首次杂交的两组样品不经变性而直接混合，只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA可以重新结合为新的杂交体分子，这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2，加入新鲜变性的驱动方进行第二轮消减杂交，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端，这样差异表达的测试序列-杂交体分子5’-和3’-端就有了进行巢式PCR所需的不同的退火位点。最后，进行两次PCR反应，第一次PCR只有两端连接有不同接头的双链cDNA片段才得以指数扩增，而其他形式如一端有接头，而另一端无接头的只能线性扩增，没有引物结合点的不能扩增，还有两端为同一接头的形成袢状而无法获得指数扩增。利用巢式引物进行第二次PCR，富集差异表达的基因片段。PCR产物可以被直接插入T载体，或者利用接头1上的NotI/SmaI/XmaI位点和接头2上的EagI位点进行定向克隆，或者接头与cDNA连接处的RsaI位点平端克隆。然后利用测序和杂交分析来分析差异表达的序列，或者用PCR产物作探针来筛选DNA文库。
发明创造内容本发明的目的是提供SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库。
本发明所提供的SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列组成。
序列表中序列1至序列89的cDNA序列对应的克隆号为s1至s89。
本发明的cDNA文库共包括89个cDNA克隆，以文库中的克隆序列为基础，与美国国家生物技术信息中心GenBank等数据库中人类基因进行比较和分析，初步筛选出60个与SARS康复者SARS冠状病毒抗体产生相关和可用于SARS患者治疗的克隆，这些克隆为SARS康复者机体免疫机理和康复机理的研究和对SARS患者的治疗研究提供了分子依据；对于保存SARS康复者与健康人淋巴细胞中差异表达的基因以及筛选SARS冠状病毒特异性抗体相关基因奠定了基础。同时对研究SARS康复者SARS冠状病毒抗体发生机理和筛选抑制SARS冠状病毒的药物以及预防SARS病毒感染的疫苗具有重要意义。


图1为部分重组质粒的PCR扩增和鉴定图谱图2a为TMSB4基因在SARS康复者和健康者中的表达差异图谱图2b为HBB基因在SARS康复者和健康者中的表达差异图谱图3a为10例IgG抗体阳性的SARS康复者样本中持家基因G3PDH的表达图谱图3b为10例IgG抗体阴性的健康者样本中持家基因G3PDH的表达图谱图4为B2M基因在康复者和健康者中的表达差异图5为HBB在SARS康复者中的多态性具体实施方式
实施例1、SARS康复者与健康人血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库的建立10例SARS康复者经SARS康复患者复诊诊室抽取静脉血检测，其SARS冠状病毒特异性抗体IgG皆为强阳性；10例健康血液标本来自北京血站的献血者，经检测SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性。上述实验者的静脉血，经淋巴细胞分离后提取细胞总RNA。以10例SARS康复者的RNA为实验方(Tester)，10例健康献血者的RNA为驱动方(Driver)进行差异表达基因的筛选和差减文库的构建。具体过程如下1、细胞总RNA的提取分离实验者血液中的淋巴细胞，采用Trizol(Gibicol)试剂分别提取各个实验者淋巴细胞的总RNA。
2、抑制消减杂交(SSH)将10例SARS康复者淋巴细胞的RNA混合在一起为Tester，10例健康者淋巴细胞的RNA混合在一起为Driver进行差减杂交。具体操作按SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit和Clontech PCR-SelectTMcDNA Subtractive Kit说明书进行。
3、差减cDNA文库的构建(T/A克隆法)从第二次巢式PCR扩增后的差减基因产物中取出3μl，与1μl pGEM-T载体连接，4℃过夜。从连接体系中取4μl转化受体菌DH5α，接种于X-gal/IPTG Amp琼脂平板上培养，挑取白色克隆在5ml LB培养基中37℃振摇培养过夜，加15％甘油，液氮速冻，-70℃保种。
4、文库的鉴定和筛选(测序和PCR法)测序鉴定挑取消减文库中的89个克隆，对插入的cDNA片段从质粒载体的T7端进行单向测序，结果得到具有序列表中序列1至序列89的核苷酸序列的s1至s89的89个cDNA序列。
PCR鉴定与筛选用与接头有互补序列的内引物巢式引物1R和2R(巢式引物序列1R5`-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3`，巢式引物序列2R5`-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3`)对质粒进行扩增，取5μl步骤3中的白色克隆菌液于5ml MS液体培养基过夜培养后，再取1μl培养液直接作模板，然后依次加入10×PCR buffer 2.5μl，巢式引物1R和2R各1.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)，50×dNTP 0.5μl，H2O 18.5μl，于94℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 1.5min，30个循环扩增，进行PCR鉴定。同时以pGEM-T载体两端的一对通用引物T7/SP6引物扩增89个克隆的外源插入片段，进行PCR筛选(除引物为T7和SP6外，PCR的反应体系和循环程序同上)。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。因为只有插入片段才连有接头，所以在电泳图谱上可见扩增产物者为阳性克隆，而无扩增产物者为空载质粒。结果表明差异表达的基因已成功的克隆到TA载体中。所有克隆都得到了特异扩增片段，外源插入片段的大小大部分介于500-1000bp之间，平均大小在750bp左右，与SSH设计预期的插入片段大小吻合(图1)。图1中，1、2、3为T7/SP6引物扩增部分质粒，4为2000bp DNA marker，5、7、8为巢式引物1R和2R扩增重组质粒，6为巢式引物1R和2R扩增空载体质粒。
经过上述步骤，获得SARS康复者血液淋巴细胞差异表达的基因文库1个，文库中共有89个克隆。
实施例2、SARS冠状病毒抗体相关克隆的鉴定一、生物信息学分析参考国际互联网上相关的数据库对实施例1的文库中克隆的序列进行相应的比较和分析，包括同源性比较、EST拼接、功能域预测等相应的生物信息学分析，并推测未知基因的可能功能。
利用DNA序列生物信息学分析的网站、数据库和软件进行分析1、互联网站和数据库a.National Center for Biotechnology Information(NCBI)http//www.ncbi.nlm.nih.govb.European Bioinformatics Institute(EBI)http//www.ebi.ac.uk2、生物信息学公共数据库a.Genebank data basehttp//www.nici.nlm.nih.gov/Web/Genebankb.表达序列标签数据库(dbEST)http//www.nici.nlm.nih.gov/dbESTc.BodyMap(Anatcmical Expression Database of human genes)http//cookie.imcb.osaka-u.ac.jp/bodymap3、生物信息学分析软件a.与公其数据库作DNA序列同源性比较软件http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/b.与EST数据库(dbEST)作序列同源性比较软件Blastn2.0.124、与公共数据库(Genebank nonredundant database)作DNA序列同源性比较对于所测定的序列与公共数据库Genebank nonredundant database用Blastn软件作DNA序列同源性比较。通过Internet互联网进入http//www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast？Jform＝1，按照说明填写Sbmit sheet，选择合适参数(表1)，实现在线DNA序列同源性比较。
表1.与Genebank作DNA序列同源性比较的参数设置

Expect值有0.0001、0.01、1、10、100、1000五种选择，值越小，比较结果越严格，假阳性率越低，给出的同源基因越少。选择1时，一般都有同源序列给出，比较也较严格。
同源序列配对情况图示能十分直观地显示序列之间同源情况，粗线条表示同源范围，颜色表示同源程度。
Descriptions指给出的同源序列的名称，共有0、10、50、100、250、500六种选择，由于最关心的是最同源的序列，所以选择50。
Alignments指具体的序列配对情况，共有0、10、50、100、250、500六种选择。
5、所测EST序列的分类和组成类型分析按照序列与公共数据库同源性比较结果给出的Score值，结合EST的长度将所测定的EST序列分成3类已知序列(同源性＞90％)、同源序列(同源性40％-90％)和未知新序列(同源性＜40％)。在此基础之上，对已知编码序列依据功能和定位进行分类。
核酸序列的检索联网至http//www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez/query.fcgi？db＝Nucleotide进行检索，输入需要检索的内容，点击Search键开始查询。
核酸序列同源性分析查询该序列是否是已知序列及与已知序列同源性的高低。采用NCBI的Blast软件对GenBank中的非冗余数据库(non-redundant database，nr)(网址为httn.//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行查询。该数据库是对Genbank、EMBL和DDBJ中去除所有相同核酸序列进行后整合所得到的最为全面的已知基因的数据库，其中还包括了部分基因组的序列。
按照上述方法将89个克隆的测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行了比较，79个克隆的测序结果成功的进行了比对4个cDNA克隆未查到同源序列，占已测序克隆的5.06％；其它75个克隆共代表了11个不同的已知基因，其中52个克隆代表同一个基因。表明SARS康复者体内的确存在丰度较高的差异表达基因。75个克隆对应的已知序列的名称如下(1)克隆s1编码胸腺素3(thymosin-like 3，TMSB4X)(2)克隆s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89编码β-球蛋白链(beta globin chain，HBB)(3)Clone s21，s35，s36编码人β-2-微球蛋白(Homo sapiensbeta-2-microglobulin，B2M)(4)Clone s6，s72编码核糖体蛋白L7a((ribosomal protein L7a)(5)Clone s7编码人CUB和Sushi多功能区3(Homo sapiens CUB and Sushi multipledomains 3，CSMD3)(6)Clone s12，s23，s49，s53，s66编码183线粒体基因组(183 mitochondrion)
(7)Clone s19编码单模AslA线粒体全基因组(haplotype AslA mitochondrion，complete genome)(8)Clone s24，s25，s30，s33编码人α基因序列(Homo sapiens alpha gene sequence)(9)clone s38编码核糖体蛋白S4(ribosomal protein S4，X-linked)(10)clone s65，s67，s71编码人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Homo sapiensglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPD)(11)clone s79编码人236线粒体基因(Homo sapiens isolate 236 mitochondrion)经过对上述75个克隆对应的已知基因的pubmed的检索分析，初步筛选出与SARS冠状病毒抗体相关的克隆s1，s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89，s22，s41，s43，s21，s35，s36。
二、利用RT-PCR对测序后的差异表达的基因序列进行鉴定，具体过程如下1、设计并合成差异表达蛋白TMSB4X(克隆s1)、HBB(克隆s2，s3，s5，s8，s9，s10，s11，s13，s14，s15，s16，s17，s18，s20，s22，s26，s27，s28，s29，s39，s40，s42，s44，s45，s46，s47，s51，s52，s54，s55，s57，s58，s59，s60，s62，s64，s68，s69，s70，s73，s74，s76，s77，s78，s81，s82，s83，s84，s85，s86，s87，s88，s89)、B2M(克隆s21，s35，s36)基因的引物；TMSB4X基因的引物序列为5’GAG AAG CAA GCA GGC GAA TC 3’，5’CCC CAC TTC TTCCTT CAC CA 3’Tm＝56℃PCR扩增13个循环。
HBB基因的引物序列为5’GCA GGC TGC TGG TGG TCT AC 3’，5’GCA CAC AGA CCA GCACGT TG 3’Tm＝57℃ PCR扩增13个循环。
B2M基因的引物序列为5’GAG TAT GCC TGC CGT GTG AA 3’，5’TGC CAG CCC TCC TAGAGC TA 3’Tm＝56℃ PCR扩增13个循环。
实施例1提取的10例SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复者和10例IgG抗体阴性的健康者的血液淋巴细胞RNA，经SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit将上述两组RNA合成的cDNA作为模板，扩增鉴定TMSB4X、HBB、B2M基因在上述SARS康复者和健康人血液淋巴细胞中的表达差异，用持家基因G3PDH作为对照；PCR反应参数为94℃ 2分，94℃ 30秒、退火温度30秒、65℃ 60秒，13个循环。扩增完毕，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，分析基因表达的差异性。结果如图2a、图2b、图3a、图3b、图4和图5所示，图2a和图2b表明TMSB4X、HBB基因在康复者和健康人淋巴细胞中都检测到表达，但在SARS康复者淋巴细胞中的表达量更高；图4表明B2M基因在SARS康复者淋巴细胞中有表达，但表达的丰度不是太高，在凝胶电泳图上看不出B2M基因在健康人淋巴细胞中有表达；图5表明HBB基因在SARS康复者淋巴细胞中有3个大小不同的转录本，而在健康者中只有其中的一个转录本。图2a和图2b中，1，3，5，7为SARS康复者；2，4，6，8为健康者。图4中，1，3，5为SARS康复者；2，4，6为健康者。图5中，1，2，3为SARS康复者；4，5，6为健康者。
序列表<160>89<210>1<211>442<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttataaactt tttatttgca tattaaaaaa60attgtgcatt ccaataatta aaatcatttg aacaaaaaaa aaaatggcac tctgattaaa120ctgcattaca gcctgcagga caccttgggc cagcttggtt ttactctaaa tttcactgtc180gtcccacccc acttcttcca ccccacttct tccttcacca acgtgcaagt tctttccttc240cctgccagcc agatagatag acagatggga aaggcaggcg cggccttcgt tgtcagtagt300tctttgatgt gaaaggggca gcacagtcat ttaaacttga tccaacctct ttgcatctta360caaagttaaa cagctaaaag aagtaaaata agaaggcaat gcttgtggaa tgtacctgcc420cgggcgggcg ctcgaatcac ta 442<210>2<211>423<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>2cgccatcgca tgctcccggc cgccatggcc gcgggatttc gagcggccgc ccgggcaggt 60acgcggggac atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacaccat 120ggtgcacctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca aggtgaacgt 180ggatgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gctgctggtg gtctaccctt ggacccagag 240gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct gttatgggca accctaaggt 300gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc ctttagtgat ggcctggctc acctggacaa 360cctcaagggc acctttgcca cactgagtga gctgcactgt gacaagctgc acgtggatcc 420tga 423<210>3<211>424<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)
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权利要求
1.SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的cDNA文库在筛选SARS冠状病毒特异性抗体相关基因中的应用。
3.权利要求1所述的cDNA文库在筛选治疗SARS药物中的应用。
4.权利要求1所述的cDNA文库在筛选预防SARS病毒感染的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库。本发明所提供的SARS康复者血液淋巴细胞中差异表达基因的cDNA文库，由序列表中的序列1至序列89的核苷酸序列组成。本发明的cDNA文库可用于研究SARS康复者机体免疫机理和康复机理以及SARS康复者SARS冠状病毒抗体发生机理，也可用于筛选抑制SARS冠状病毒的药物以及预防SARS病毒感染的疫苗。
文档编号A61K39/215GK1727486SQ20041007106
公开日2006年2月1日 申请日期2004年7月28日 优先权日2004年7月28日
发明者范保星, 刘又宁, 朱茂祥, 解立新, 孙敬芬, 陈良安, 佘丹阳, 田庆 申请人:中国人民解放军总医院