抗传染性法氏囊病病毒vp4蛋白单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗传染性法氏囊病病毒vp4蛋白单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为抗传染性法氏囊病病毒VP4蛋白 单克隆抗体。
技术背景传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)是传染性法氏囊病(IBD)的病 原，主要侵害3-6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，破坏表面带有sIgM的B淋巴细胞，并引 起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡，导致以淋巴细胞衰竭、坏死为主要特征的免疫缺 陷性和免疫抑制性疾病。该病发病率高，病程短，除疾病自身可造成机体损伤外，还可导致 多种疫苗免疫失败，严重危害养禽业的健康发展。IBDV属双RNA病毒科(S!VmmWA^)禽双 RNA病毒属04础/maw'n^),无囊膜，具有单层衣壳，呈20面体立体对称，病毒基因组由双 链双节段RNA组成，大节段A全长3259个核苷酸，含有两个部分重叠的开放阅读框架(ORF)， 大ORF全长共3036个核苷酸，按NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的顺序编码分子量为110 kDa 的多聚前体蛋白(VP2/4/3)，并剪切加工成为VP2蛋白前体(pVP2)、 VP3和VP4蛋白，pVP2 进一步加工成为成熟的VP2蛋白和4条多肽(pep46、 pep7a、 pep7b和pepll);小ORF全长共 435_447个核苷酸，编码VP5非结构蛋白。小节段B全长2827个核苷酸，只有一个ORF编 码VP1蛋白。VP4由243个氨基酸组成，分子量约为28kDa,属于丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白活性， 主要作用是对多聚前体蛋白VP2/4/3进行自我水解，使之水解成为pVP2、 VP3和VP4三种 病毒蛋白，其中pVP2-VP4VP4-VP3确切剪切位点分别定位于L512A丄A513和 M755AiA756。此外，VP4还能激活VP1的合成，与病毒在感染细胞后形成的微管状结构有关，有可能也参与了病毒组装，但不诱导凋亡。由于IBDV病毒粒子不存在VP4蛋白，无法 获得自然状态下的VP4病毒蛋白，严重制约VP4蛋白特性和功能的研究，利用VP4重组蛋 白制备特异性单克隆抗体可为VP4研究提供必要的试剂和技术手段，对探讨VP4蛋白在IBDV 病毒粒子形成及其致病方面的作用具有重要意义。 发明内容本发明的目的是提供抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体。本发明的单克隆抗体是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得
的，能特异识别IBDV感染细胞病毒蛋白的单克隆抗体。IBDVVP4重组蛋白是将IBDVVP4 基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M 尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表达蛋白。 该单克隆抗体的具体制备方法如下1 、根据IBDV VP4基因cDNA序列设计一对引物，通过PCR扩增得到全长VP4基因。 将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达IBDV VP4蛋白；裂解表达菌体，分离包涵体，用8M尿素溶液溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析 纯化，获得IBDVVP4重组蛋白。2、 用IBDV VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞 融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛 选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤 细胞注入经降殖烷致敏的BALB/c小鼠诱生腹水，对获得抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体特性 进行鉴定。3、 以ELISA测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价，间接免疫荧光鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性，用单克隆抗体亚型测定试剂盒鉴 定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚类。本发明的优点是(1)本发明提供的IBDVVP4重组蛋白制备方法简单，纯度高；(2)本 发明提供抗IBDVVP4蛋白的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；(3)抗IBDVVP4蛋白单 克隆抗体可用于VP4蛋白的特性和功能研究。


图1为IBDV VP4重组表达质粒pET28a-VP4的鉴定图，图中1是阴性对照，2是质粒 pET28a-VP4的PCR产物，3是100 bp DNA ladder。图2为IBDV VP4表达蛋白的SDS-PAGE鉴定图，图中1是蛋白质Marker, 2是 BL21(DE3)/pET-28a诱导表达菌体，3是BL21(DE3)/pET28a-VP4诱导表达菌体。图3为抗VP4蛋白单克隆抗体的IFA鉴定图，图中A和B分别是单克隆抗体6A4与IBDV NB株感染及正常鸡胚成纤维细胞(CEF)的反应结果，C和D分别是单克隆抗体6H8与IBDV NB株感染及正常CEF的反应结果，E和F分别是单克隆抗体4C3与IBDVNB株感染及正常 CEF的反应结果。
具体实施方式
1、 IBDV VP4重组蛋白的制备根据IBDV NB株A节段核苷酸序列设计引物，PCR
扩增IBDV VP4基因，将其克隆于原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG 诱导表达IBDV VP4蛋白；收集表达菌体，冻融3次后，离心分离包涵体，用8M尿素溶液 溶解表达蛋白，经镍螯合亲和层析纯化，获得IBDVVP4重组蛋白。2、 抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体的制备用等量弗氏佐剂乳化纯化的VP4重组蛋白， 免疫6-8周龄BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合， 用HAT培养基进行选择性培养；以纯化的VP4重组蛋白和IBDV感染CEF裂解物为检测抗 原，用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法 克隆化，获得稳定分泌抗VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以降殖烷致敏BALB/c小鼠 后，将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水，获得抗IBDVVP4蛋白单克隆抗体。3、 抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的特性鉴定以纯化VP4重组蛋白为检测抗原用间接 ELISA方法测定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价；以间接免疫荧光鉴定抗IBDV VP4 蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性和特异性；用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亚型测定试剂盒鉴定抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体重链和轻链的Ig亚型。实施例1 IBDV VP4重组表达质粒的构建根据IBDV NB株A节段核苷酸序列(EF517528.1)设计合成特异性引物，上游引物 5，-CGTCGTCCATGGCCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3，(下划线为iVcoI位点)，下游引物 5'-CGTCGTCTCGAGCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3,((下划线为Jftol位点)。以PCR 从IBDV A节段质粒中扩增IBDV VP4基因，引入TVcoI/^zoI酶切位点，PCR产物经Wcol/^zol 双酶酶切消化后，连接到原核表达载体pET-28a的iVcoI/J^oI位点间，转化大肠杆菌Topl0, 提取转化细菌的质粒，以PCR鉴定重组表达质粒(图1)，经序列测定验证，获得IBDV VP4 重组表达质粒pET28a-VP4。实施例2 IBDV VP4重组蛋白的表达与纯化以氯化钙法将重组表达质粒pET28a-VP4转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆接种 LB液体培养基(含50昭/mL Kan), 37 °C 250 r/min振荡培养过夜，次日按1:100的比例接种 于含lOmL新鲜LB培养基lOOmL锥形瓶中，37 °C 300 r/min振荡培养，当0D6(X)=0.6时， 加入终浓度为lmMIPTG诱导表达2h, 4°C 12000 r/min离心30 sec，收集菌体，冻融三次， 4°C 12000 r/min离心10 min， SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀，分析IBDV VP4蛋白 的表达情况(图2)。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀，振荡至溶液澄清，4°C 12000 r/min离心 10min，弃沉淀，上清转移至镍离子亲和层析柱中，振荡lh，使带有His标签的VP4表达蛋 白与镍离子鳌合，先后用2倍柱床体积pH=8.0的8 M尿素溶液，3倍柱床体积pH=6.3的8 M
尿素，3倍柱床体积pH=5.9的8M尿素和5倍柱床体积pH=4.5的8M尿素洗脱柱床，收集洗 脱液lml/管；用SDS-PAGE分析洗脱液，获得高纯度的VP4重组蛋白。 实施例3小鼠免疫分别将纯化的IBDVVP4重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合，充分乳化，制备VP4免疫 抗原，免疫6-8周龄BALB/c纯系小鼠10只。首免以弗氏完全佐剂免疫抗原，背部皮下、 皮内多点注射，每只100pg(0.2mL);间隔20天，用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次 免疫，腹腔注射，每只100pg(0.2mL);间隔20天，用不加佐剂的VP4免疫抗原进行三免， 肌肉注射，每只100pg(0.2mL);免疫15天后，尾静脉采血，以VP4重组蛋白为检测抗原， 用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平，免疫小鼠抗体滴度达到1:4000以上，表 明小鼠获得良好免疫效果。实施例3杂交瘤细胞株的建立1、 细胞融合细胞融合前3天，进行超强免疫，以不加佐剂的VP4重组蛋白尾静脉注射小鼠，每只 50吗(0.1mL)。免疫小鼠经眼眶放血，收集血清，拉颈致死后，无菌取小鼠脾脏，分离脾 细胞，经台盼兰染色计数，按5:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2xlO》混合，在PEG4000作 用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置5XC02 37'C进行选 择性培养，5天后半量换液，IO天后改为HT培养基。待细胞克隆长至1/5-1/2培养孔时， 吸取细胞培养上清检测分泌抗体。2、 杂交瘤细胞筛选分别用纯化的VP4重组蛋白和IBDV感染CEF裂解物作为检测抗原，对杂交瘤细胞培 养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测，筛选阳性杂交瘤细胞。用0.05M碳酸盐包被 缓冲液(pH9.6)稀释纯化的VP4重组蛋白或IBDV感染CEF裂解物，加入酶标板，100 ^L/ 孔，37。C包被1 h后转入4。C包被过夜；用含0.05%吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次， 加5%脱脂奶粉37"封闭lh，每孔加入杂交瘤细胞培养上清100 ^L， 37。C孵育2h; PBST 洗3次，加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体，37。C孵育1 h， PBST洗4次，加入显色底物OPD-H202，避光反应10min后，用2 M H2S04终止反应，用 酶标仪读取OD49o值，以与阴性OD柳值的比值大于2.1判为阳性。VP4重组蛋白和IBDV 感染细胞两种抗原检测均呈阳性的杂交瘤细胞孔为阳性克隆。3、 有限稀释法克隆化用HT培养基制备阳性杂交瘤细胞悬液，取样进行台盼兰染色和计数；以HT培养基将
杂交瘤细胞稀释至20个/mL和10个/mL，将稀释细胞悬液分别加入96孔培养板，每孔O.l mL，细胞含量分别为2个/孔和l个/ L，置5y。C02 37'C培养，5-7天观察细胞克隆生长情 况，选取单克隆生长孔细胞上清，以ELISA检测分泌抗体；对阳性克隆进行连续5次克隆， 使其抗体分泌阳性率达95%以上，扩大培养，冻存细胞，获得稳定分泌抗VP4蛋白单克隆 抗体的杂交瘤细胞株。其中的3株分别为4C3、 6A4和6H8。 实施例4抗VP4蛋白单克隆抗体的制备用降植烷腹腔注射成年雌性BALB/c小鼠，0.2mL/只，致敏1周后，腹腔注射杂交瘤细 胞悬液5xl0Mx107， 7-10天后采集小鼠腹水，12000 g离心3 min，收集上清，-70匸冻存， 获得单克隆抗体4C3、 6A4和6H8腹水6.5-8 mL。实施例5抗VP4蛋白单克隆抗体的腹水效价测定用PBS缓冲液1000倍稀释抗VP4蛋白单克隆抗体腹水，经倍比稀释后，分别加入VP4 重组蛋白(2 ng/mL)包被的酶标板，100 pL/孔，37。C孵育2h; PBST洗涤3次，加入1:5000 稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，37。C孵育1 h， PBST洗涤后，加入显色底物OPD-H202， 避光反应10min，用2MH2S04终止反应，用酶标仪读取OD柳值，以与阴性OD柳值的比 值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度为抗VP4蛋白单克隆抗体腹水效价。结果测得 单克隆抗体4C3、 6A4和6H8腹水的ELISA效价分别为6.4x105、 2.6><106和5.2><106。实施例6抗VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性与特异性鉴定以间接免疫荧光测定抗VP4蛋白单克隆抗体与IBDV病毒蛋白的反应性与特异性。鸡胚 成纤维细胞经IBDV感染24h， PBS漂洗两次；加入甲醛丙酮=1 : 1的固定液，100pL/孑L， 固定l h;弃固定液，通风干燥；分别加入单克隆抗体4C3、 6A4t和6H8的细胞培养上清， 100pL/孔，37。C孵育lh; PBS洗涤3次，加入1:100稀释的FITC标记羊抗小鼠IgG抗体， 37。C孵育30min; PBS洗涤后，每孔加入PBS lOOpL，荧光显微镜观察并照相。结果单克隆 抗体4C3、 6A4和6H8均特异识别IBDV感染CEF的病毒蛋白(图3)。实施例7抗VP4蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定利用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亚型测定试剂盒测定抗IBDV VP4蛋白单克 隆抗体Ig亚型。结果显示，单克隆抗体4C3、 6A4和6H8的重链均为IgGl，轻链为k。
序列表上游引物5'-CGTCGT￡￡^I^CCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3，(下划线为TVcoI位点)；下游引物5，-CGTCGT￡I￡OASCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3，(下划线为Wol位点)。
权利要求
1、 一种抗传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP4蛋白单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体 是用纯化的IBDV VP4重组蛋白为抗原，通过杂交瘤细胞方法获得的，特异识别IBDV 感染细胞中的VP4病毒蛋白的单克隆抗体。
2、 如权利要求1所述一种抗传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP4蛋白单克隆抗体，其特征在 于IBDV VP4重组蛋白是将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达，分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得的表 达蛋白。
全文摘要
本发明抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4蛋白单克隆抗体属于生物技术领域，涉及基因工程。将IBDV VP4基因克隆于原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达；分离包涵体，用8M尿素溶解，经镍螯合亲和层析纯化获得VP4重组蛋白。用VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以HAT培养基选择性培养后，以VP4重组蛋白和IBDV感染细胞进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化，获得分泌抗IBDV VP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中4C3、6A4和6H8腹水的ELISA效价分别为6.4×10⁵、2.6×10⁶和5.2×10⁶，均能特异识别IBDV感染细胞的病毒蛋白，其Ig亚型重链为IgG1，轻链为κ。
文档编号C07K16/08GK101121748SQ20071007013
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月20日 优先权日2007年7月20日
发明者周继勇, 王永志, 郭军庆 申请人:浙江大学