专利名称：全封闭双循环柱层析纯化灭活病毒疫苗技术的制作方法
发明所属领域本发明属于生物制药领域，涉及全封闭双循环柱层析工艺，其整个纯化过程无暴露工作，保证系统在密闭状态下既完成洗脱和上样交替操作以及洗脱和收集的交替操作，又保证了在待用状态下不会进入气泡，以及保证系统在任意时间或在管道中任何位置都可以排放气泡。以上特点不仅省去了产品需经微孔滤膜除菌步骤，而且还保证最终产物无外源因子污染。
背景技术：
病毒颗粒经细胞培养繁殖出来后，需经灭活、分离纯化等工艺后方能作为疫苗使用。目前的分离纯化方法只是简单的离心、超滤，杂质去除率只能达到98％，且产物最终需经用0.22μm的微孔滤膜过滤技术除菌，单此一项工艺目的的产物的含量将损失20-40％，故如何建立一个先进的纯化技术来提高杂质的去除率以及避免除菌过滤而造成产物损失十分必要。
而且细胞培养病毒疫苗，在生产工艺上存在以下缺陷(1)疫苗不纯，含有细胞碎片，这些碎片是人体的异性蛋白，它会导致人体局部或者全身变态反应。(2)效价低，很难达到WHO(世界卫生组织)所规定的2.5iu(国际单位)/毫升，所以只能以2毫升的含量代之。(3)被注射者疼痛感明显，重者有变态反应。最近生物制品单位亦提出研制高纯度的病毒疫苗，其路线是用超速离心技术，但是由于这种装置价格昂贵；使用寿命短；生产投入比低而未能实现。
发明的技术内容本发明的目的是提供一个全封闭的双循环层析柱工艺。
本发明的另一个目的是提供这个全封闭的双循环层析柱工艺在纯化狂犬病疫苗中的应用。
在本发明中涉及一个全封闭的双循环层析柱工艺，其包括以下部分(1)上样瓶(2)洗脱瓶(3)第一层析柱(4)第二层析柱(5)收集瓶整个纯化过程无暴露工作，保证系统在密闭状态下既完成洗脱和上样交替操作以及洗脱和收集的交替操作，又保证了在待用状态下不会进入气泡，以及保证系统在任意时间或在管道中任何位置都可以排放气泡。以上特点不仅省去了产品需经微孔滤膜除菌步骤，而且还保证最终产物无外源因子污染。
本发明还公开这个工艺在纯化狂犬病疫苗中的应用。
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种病症严重，病死率极高的自然疫源性传染病，目前尚无有效的治疗措施，唯一的控制方法是进行狂犬病疫苗的有效预防接种。目前的免疫接种分两种类型一类为主动免疫，主要是为长期与猫、狗等动物接触的工作人员和部分饲养宠物的家庭成员进行的一种预防措施。另一类为被动免疫，是指人被猫、狗等动物咬伤，抓伤后进行旨在抵御可能发生的狂犬病毒感染的一种免疫接种措施。然而，疫苗的质量即疫苗的免疫性和安全性是预防狂犬病的关键，我国是狂犬病高发区，因此格外重视对狂犬病疫苗的研制，最初的产品是用豚鼠脑生产的，不但副反应严重，而且产量极低，仅有少数人能得到使用。自地鼠肾细胞疫苗于1974年研制成功并批准使用后，狂犬病疫苗成为了一个大众均能使用的药品，产品也经历了一个从淡苗到浓缩苗到纯化苗的发展过程，1999年又开发成功了转瓶工艺的传代细胞纯化苗，目前淡苗和浓缩苗均已被禁止使用，地鼠肾纯化苗约占国内现有市场的三分之二，另外三分之一主要为采用转瓶工艺生产的传代细胞纯化苗，法国巴斯德公司的生物反应器传代细胞纯化苗只占市场的很小部分。
国外的狂犬病疫苗生产和使用情况是两极分化，发达国家全部使用生物反应器传代细胞纯化苗，但这些国家养犬管理规范，因而狂犬病发病率低，疫苗需求量小，而人口众多的亚洲、非洲国家狂犬病发病率高，疫苗需求量大，但使用的绝大部分产品均为低技术的组织或原代细胞疫苗，且研制成功的还只是少部分国家。地鼠肾纯化苗是国内目前预防狂犬病使用的主要疫苗，由于大量养殖地鼠(一只地鼠只能生产一人份的合格狂犬病疫苗)，人力和生产场地需求量大，生产效率低，且产品中残留的动物来源的杂质对人体产生严重的副作用。由于动物个体间的差异，导致产品质量难以控制，批间差异很大。国家药监部门最近颁令，人用疫苗必须使用清洁级动物，使得地鼠肾纯化苗的生产成本大大增加，预计这类产品必将在二三年内被淘汰。现有的转瓶工艺传代细胞纯化苗克服了地鼠肾纯化苗因使用动物生产造成的弊病，但同样存在手工操作，无法规模化生产，生产效率低，生产条件无法控制，产品质量不稳定，批间差异大等问题；进口产品保护作用强，副反应小，因而受到用户喜爱，但由于价格昂贵，使得其不可能成为市场主导产品。
由于现有的生产工艺落后，合格的狂犬病疫苗远远满足不了市场的需求，受利益驱使，大量效力低下的劣质产品充斥国内市场，导致近三年狂犬病发病和死亡人数异常持续上升，国家药监部门有意整顿狂犬病疫苗市场，大力鼓励和支持有条件的生产单位采用先进的生产工艺—生物反应器工艺，生产vero细胞狂犬疫苗逐步淘汰现有产品生产工艺，本发明把无菌LD50达107以上的狂犬病毒细胞培养液，进行去细胞离心处理，将其以1000×g 20分钟离心处理，弃细胞，取上清，得到狂犬病毒液，把其加入到此双循环系统中在密闭状态下置于NT缓冲液(PH7.8)平衡好的SephadexG75柱上，用NT缓冲液洗脱，其流速为1毫升/分，同时上样交替操作，洗脱同时收集得到的洗脱产物。并利用紫外分光光度计对平衡好的SephadeG75柱上洗脱的病毒液进行检测，收集和合并病毒峰。将收集到的狂犬病毒加入1/4000～1/5000甲醛，再放入37℃恒温室内，静止或者旋转24～34小时。最后，可采用INH方法对经灭活的狂犬病毒液进行无菌试验、毒力试验、安全试验和效力试验后即得到狂犬病毒疫苗。
本发明与背景技术相比，具有以下有益效果(1)提高了病毒的纯度，本方法的杂质去除率为99.9％；(2)目的产物回收率高，狂犬病毒的回收率为80％；(3)效价可以超过2.5iu/ml的指标；(4)安全可靠，这是提高了纯度和效价的必然结果。
图1.全封闭双循环系统层析柱系统连接图具体实施例实施例① 弃细胞离心处理将无菌的LD50达到107以上的狂犬病毒细胞培养液合并，以1000×g 20分钟离心处理，弃细胞，取狂犬病毒培养液。
实施例② 配制样品用醋酸调PH值，将所取得的狂犬病毒液用醋酸将其PH值调到6.7，用机械或者人工方法，将调定到上述PH值培养液摇匀，再将之放于4℃的环境中，静止20分钟。再用Tris将其PH值调到7.8。
实施例③ 层析柱的处理用NT缓冲液(PH7.8)平衡好SephadexG75层析柱。
实施例④ 洗脱将上述狂犬病毒溶液上样至用NT(PH7.8)平衡好的全封闭双循环柱层析系统，用NT缓冲液洗脱，其流速为1毫升/分。
实施例⑤ 检测与收集病毒利用紫外分光光度计对平衡好的SephadexG75柱上洗脱的病毒液进行检测，收集并合并病毒峰。
权利要求
1.全封闭双循环柱层析工艺，其特征是一个封闭的双循环系统，其包括以下部分(1)上样瓶(2)洗脱瓶(3)第一层析柱(4)第二层析柱(5)收集瓶
2.权利要求1所述的双循环系统在纯化灭活狂犬病毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种全封闭双循环柱层析工艺，其整个纯化过程无暴露工作，保证系统在密闭状态下既完成洗脱和上样交替操作以及洗脱和收集的交替操作，又保证了在待用状态下不会进入气泡，以及保证系统在任意时间或在管道中任何位置都可以排放气泡。以上特点不仅省去了产品需经微孔滤膜除菌步骤，而且还保证最终产物无外源因子污染。
文档编号C12N7/04GK1614011SQ20031011204
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月6日 优先权日2003年11月6日
发明者何春辉, 乐威 申请人:广州市嘉合生物技术有限公司