一种淀粉基腹膜透析液用艾考糊精的制备方法与流程

本发明涉及淀粉糊精制备的方法，具体是指利用生物技术、膜过滤及柱层析相结合制备淀粉基腹膜透析液的方法。

背景技术：

淀粉基腹膜透析液艾考糊精是艾考糊精腹膜透析液中的主要活性成分。肾透析是一种简单、有效、价廉的方法，适合几乎所有ESRD病人，在我国香港及欧洲等国，80％以上的透析患者选择腹透治疗。艾考糊精(Icodextrin)是由谷物淀粉通过α-1,4和少于10％α-1,6糖苷键连接的水溶性葡萄糖聚合物，重量平均分子量为13000～19000Da，数量平均分子量为5000～6500Da。艾考糊精作为一个胶体渗透剂在长期腹膜透析留置期间完成超滤。在现有的关于艾考糊精腹膜透析液的文献中，只有关于艾考糊精在腹膜透析液中的应用，以及相对于其他渗透剂，这种大分子多糖渗透剂在药物临床上具有的一些优势和目前面临的困难，但是并没有对艾考糊精的制备提供具体的方法。中国发明专利2013104530981中有介绍艾考糊精的酸水解制备方法，但是该方法使用的是乌氏粘度计对重均分子量进行测定，测定方法存在的误差较大，并且没有对数均分子量进行测定，重点在于也没有对α-1,6糖苷键的比例进行调控。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种产率高，品质好，成本相对低的淀粉基腹膜透析液用艾考糊精的制备方法，弥补了目前关于艾考糊精制备工艺的不足。

本发明联合膜过滤与葡聚糖凝胶色谱柱进行分离、提纯，并且采用GPC对重均和数均分子量进行监测，利用¹H-NMR对酶解产物的α-1,6糖苷键含量进行了测定。经过本发明制备方法所得到的艾考糊精分子量分布范围更窄，更集中，且糖苷键的比例也严格符合产品要求，纯度更高。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种淀粉基腹膜透析液用艾考糊精的制备方法，包括如下步骤：

1)将淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成淀粉溶液，并调节pH值至5.8～7.8，置于密闭容器中，在95～99℃下搅拌糊化60～100min后，冷却至70～95℃，加入α-淀粉酶，用量为每克干淀粉加入α-淀粉酶1～8U，酶解1～8min，调节pH值至2.5～3.0，并保持10～15min灭酶活，得到淀粉酶解液；

2)将步骤1)所得的淀粉酶解液在pH值为5.5～6.5，40～60℃条件下加入脱支酶，用量为每克干淀粉加入脱支酶2～10U，搅拌反应30～60min后，加热至90～100℃并保持10～15min；灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

3)将步骤2)中腹膜透析液粗酶解液先用乙醇溶液醇沉，静置，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将分离所得的沉淀物干燥；

4)将步骤3)得到的沉淀物用蒸馏水配成溶液，采用孔径10k-20kD超滤膜超滤后，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到不同组分的酶解液，测其重均和数均分子量，测定α-1,6糖苷键的含量；筛选得到重均分子量为13000～19000Da，数量平均分子量为5000～6500Da，淀粉中α-1,6糖苷键的摩尔比例低于10％的组分；

5)将步骤4)中的最终酶解组分进行干燥，得到腹膜透析液用艾考糊精。

为了更好地实现本发明目的，优选地，步骤1)所述淀粉为玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉中的一种。

优选地，所述脱支酶为普鲁兰酶或异淀粉酶。

优选地，所述α-淀粉酶是耐高温α-淀粉酶。

优选地，步骤1)淀粉溶液的质量百分比浓度为5％～15％。

优选地，步骤3)所述乙醇溶液的体积分数为40～50％。

优选地，步骤3)所述静置是在0-4℃冰箱中静置12～24h。

优选地，步骤4)所述溶液中沉淀物的质量百分比浓度为10～30％。

优选地，步骤5)中的干燥方法为常压干燥、减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

优选地，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定其重均和数均分子量，用¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量。

本发明先使用醇沉和超滤对样品进行粗分离，再使用葡聚糖凝胶色谱柱对样品进行精提纯，这样得到的样品纯度更高。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1)利用淀粉酶和脱支酶对淀粉进行酶解，现有技术已有一定的介绍；如中国发明专利2014102015745公开了淀粉基补铁营养强化剂的制备方法。该方法先将淀粉原料配成淀粉乳，并调节pH，置于密闭容器中在95～99℃下搅拌糊化30～60min；糊化完成后，将糊化液冷却，加入脱支酶，在45～65℃下搅拌反应；调节pH至5.5～7.0，加入α-淀粉酶，在45～110℃下搅拌反应，得直链淀粉溶液。但是现有技术基本是先用脱支酶酶解再用α-淀粉酶酶解，顺序与本发明相反，目的也完全不同。现有技术大多是为了得到直链淀粉；而本发明为了得到艾考糊精，是有一定的支链的淀粉。而且由于数均分子量的范围难以控制，分支度不容易通过酶解得以控制，很难在数均、重均分子量以及α-1,6糖苷键三方面同时满足艾考糊精要求；现有技术尚未发现用酶解的方式制备艾考糊精；中国发明专利2013104530981就是用酸解的方式制备艾考糊精。

2)本发明发现：先使用淀粉酶酶解α-1,4糖苷键，将原淀粉的主链分解成片段，再在脱支酶作用下，通过部分酶解淀粉溶液中的α-1,6糖苷键，将酶解产物中的α-1,6糖苷键比例协同控制在10％以下，关键是要合理控制酶解时间与加酶量以及温度等工艺条件，通过脱支酶酶解α-1,6糖苷键，耐高温α-淀粉酶酶解α-1,4糖苷键，将酶解产物的分支度进行控制，继而控制重均与数均分子量的范围，最后通过筛选两种酶的酶解条件使得重均分子量与数均分子量同时达到标准。淀粉酶与脱支酶共同作用控制糖苷键比例和分散度的艾考糊精的现有技术还未见报道。

3)本发明所得艾考糊精具有特点范围的重均分子量、数均分子量以及α-1,6糖苷键，但本发明联合淀粉酶与脱支酶，且在特定反应条件下控制酶解时间与加酶量分别控制α-1,4糖苷键与α-1,6糖苷键的酶解程度可获得目标产物，尤其是本发明方法得到的符合艾考糊精条件的酶解液产率高，艾考糊精粒度均匀，分子量分布集中。

4)本发明采用生物酶解技术对淀粉原料进行降解，整合醇沉技术、膜过滤技术以及色谱分离技术获得高纯度的淀粉基腹膜透析液艾考糊精，该产品具有低于10％的α-1,6糖苷键，重量平均分子量为13000～19000Da，数量平均分子量为5000～6500Da的性质，完全符合该类产品的国际质量标准。与传统的酸水解法相比，生物酶解的技术使得生产效率大大提高，且具有保护环境的优点。

5)本发明制备的艾考糊精可以用于胶体渗透剂，以艾考糊精为主要活性成分的腹膜透析液可成为终末期肾衰竭患者有效的肾替代治疗方法之一。

附图说明

图1为实施例1中淀粉最终酶解产物的分子量分布图谱。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合附图及实施例对本发明做进一步地说明。本发明有许多成功的实施例，下面列举五个具体的实施例，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

凝胶渗透色谱是测定重均分子量和数均分子量的常用方法，具体测定方法为：称取样品1.5mg，用流动相溶解并稀释制成浓度为3mg/mL的溶液，使用漩涡振荡仪振荡5s，用0.45μm的水相过滤膜过滤后，于常温下静置2-3h，作为样品溶液待测。测定的具体色谱条件为：TSK 5000色谱柱；流动相为超纯水(超声20min后待用)；示差折光检测器温度为45℃；柱温为45℃；流速为1mL/min；进样量为20μL。分别精确称取上述葡聚糖系列标准品溶液于凝胶色谱仪，记录洗脱峰的保留时间，采用GPC软件绘制标准曲线。根据上述绘制的葡聚糖标准曲线计算出样品的分子量，进而分析艾考糊精样品中的分子量分布情况(如图1)。

采用如下方法测定定重均分子量和数均分子量：将得到的酶解淀粉样品取出1mg，加0.5mL氘代DMSO，使样品充分溶解，放入核磁管中进行测定。其中测定温度70℃，扫描次数128次。计算方法如下：

α-1,4糖苷键对应的化学位移为5.11ppm，α-1,6糖苷键对应的化学位移为4.75ppm，α-1,6糖苷键含量就是淀粉的分支度(DB)。式中：DB为淀粉分支度(％)；I_α-1,6为α-1,6糖苷键化学位移处对应的峰面积；I_α-1,4为α-1,4糖苷键化学位移处对应的峰面积。

实施例1

(1)将玉米淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成质量百分比浓度为15％的淀粉溶液，并调节pH至7.8，置于密闭容器中，在99℃下搅拌糊化60min；糊化完成后，冷却至95℃，加入耐高温α-淀粉酶(Liquozyme Supra，Novozymes公司)，用量为每克干淀粉加入耐高温α-淀粉酶8U，酶解1min，调节pH至2.5，并保持10min灭酶活，得到酶解后的淀粉溶液；

(2)将步骤(1)的酶解后的淀粉溶液在pH为5.5，60℃条件下加入普鲁兰酶(OPTIMAX L-1000,杰能科生物工程有限公司)，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶10U，搅拌反应30min；加热至100℃保持10min灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

(3)将步骤(2)中腹膜透析液粗酶解液先用体积分数为40％的乙醇醇沉，于0-4℃冰箱中静置12h，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将其沉淀物进行冷冻干燥；

(4)将步骤(3)得到的样品用蒸馏水配成质量百分比浓度为10％的溶液，经孔径为10000Dal(SMU-460)与20000Dal(SMU-470)的超滤膜超滤，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到3种不同分子量的样品液，依次为样品液A(分子量在20000Da以上)；样品液B(10000Da到20000Da之间)；样品液C(10000Da以下)，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定样品液B的重均、数均分子量，¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量；

(5)将步骤(4)中的最终酶解产物进行冷冻干燥，得到固体粉末样品；

本实施例1所得艾考糊精重均分子量为15517Da，位于13000～19000Da之间，数均分子量为5530Da，位于5000～6500Da之间，α-1,6糖苷键比例为8.75％，低于10％，且根据GPC测定的分子量图谱显示，分子量分布较集中。

图1是实施例1中所得艾考糊精的分子量分布，由图1可知，该酶解产物的保留时间为29.200min，根据GPC软件分析可得到表1，即该艾考糊精的重均分子量为15517Da，数均分子量为5530Da，并且根据图1峰型可得，峰窄且高，说明经过本实施例酶解组合、醇沉、膜过滤以及凝胶色谱柱分离后的酶解产物分子量分布集中，基本位于平均分子量附近。根据GPC图谱中峰的宽度可以确定，本实施例得到的分子量图谱峰面积比较集中，峰比较窄，可以认为分子量分布集中，产率较高。

表1.GPC结果

实施例2

(1)将小麦淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成质量百分比浓度为5％的淀粉溶液，并调节pH至5.8，置于密闭容器中，在95℃下搅拌糊化100min；糊化完成后，冷却至70℃，加入耐高温α-淀粉酶(Liquozyme Supra，Novozymes公司)，用量为每克干淀粉加入耐高温α-淀粉酶1U，酶解8min，调节pH至3.0，并保持15min灭酶活，得到酶解后的淀粉溶液；

(2)将步骤(1)的酶解后的淀粉溶液在pH为6.5，50℃条件下加入异淀粉酶(Pseudomonas sp,Sigma-Aldrich公司)，用量为每克干淀粉加入异淀粉酶2U，搅拌反应30min；加热至90℃保持15min灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

(3)将步骤(2)中腹膜透析液粗酶解液先用体积分数为40％乙醇醇沉，于0-4℃冰箱中静置12h，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将其沉淀物进行减压干燥；

(4)将步骤(3)得到的样品用蒸馏水配成质量百分比浓度为30％的溶液，经超滤膜(孔径10k-20kD)超滤，将分子量在10000(SMU-460)与20000Dal(SMU-470)的超滤膜超滤，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到3种不同分子量的样品液，依次为样品液A(分子量在20000Da以上)；样品液B(10000Da到20000Da之间)；样品液C(10000Da以下)，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定样品液B的重均、数均分子量，¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量(测定方法见实施例1)；

(5)将步骤(4)中的最终酶解产物进行减压干燥，得到固体粉末样品；

本实施例2所得艾考糊精重均分子量为13942Da，数均分子量为5372Da，α-1,6糖苷键比例为8.93％，且分子量分布较集中。

实施例3

(1)将蜡质玉米淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成质量百分比浓度为5％的淀粉溶液，并调节pH至7.0，置于密闭容器中，在95℃下搅拌糊化100min；糊化完成后，冷却至95℃，加入耐高温α-淀粉酶(Liquozyme Supra，Novozymes公司)，用量为每克干淀粉加入耐高温α-淀粉酶8U，酶解3min，调节pH至2.7，并保持12min灭酶活，得到酶解后的淀粉溶液；

(2)将步骤(1)的酶解后的淀粉溶液在pH为5.8，40℃条件下加入普鲁兰酶(OPTIMAX L-1000,杰能科生物工程有限公司)，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶8U，搅拌反应40min；加热至95℃保持12min灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

(3)将步骤(2)中粗酶解液先用体积分数50％乙醇醇沉，于0-4℃冰箱中静置12h，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将其沉淀物进行喷雾干燥；

(4)将步骤(3)得到的样品用蒸馏水配成质量百分比浓度为20％的溶液，经超滤膜(孔径10k-20kD)超滤，将分子量在1000010000(SMU-460)与20000Dal(SMU-470)的超滤膜超滤，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到3种不同分子量的样品液，依次为样品液A(分子量在20000Da以上)；样品液B(10000Da到20000Da之间)；样品液C(10000Da以下)，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定样品液B的重均、数均分子量，¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量(测定方法同实施例1)；

(5)将步骤(4)中的最终酶解产物进行喷雾干燥，得到固体粉末样品；

本实施例3所得艾考糊精重均分子量为18536Da，数均分子量为5550Da，α-1,6糖苷键比例为7.94％，且分子量分布较集中。

实施例4

(1)将马铃薯淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成质量百分比浓度为10％的淀粉溶液，并调节pH至6.5，置于密闭容器中，在98℃下搅拌糊化70min；糊化完成后，冷却至85℃，加入耐高温α-淀粉酶(Liquozyme Supra，Novozymes公司)，用量为每克干淀粉加入耐高温α-淀粉酶3U，酶解3min，调节pH至2.8，并保持13min灭酶活，得到酶解后的淀粉溶液；

(2)将步骤(1)的酶解后的淀粉溶液在pH为6.5，50℃条件下加入普鲁兰酶(OPTIMAX L-1000,杰能科生物工程有限公司)，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶6U，搅拌反应45min；加热至98℃保持11min灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

(3)将步骤(2)中粗酶解液先用体积分数为45％乙醇醇沉，于0-4℃冰箱中静置12h，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将其沉淀物进行常压干燥；

(4)将步骤(3)得到的样品用蒸馏水配成质量百分比浓度为30％的溶液，经超滤膜(孔径10k-20kD)超滤，将分子量在1000010000(SMU-460)与20000Dal(SMU-470)的超滤膜超滤，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到3种不同分子量的样品液，依次为样品液A(分子量在20000Da以上)；样品液B(10000Da到20000Da之间)；样品液C(10000Da以下)，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定样品液B的重均、数均分子量，¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量(测定方法同实施例1)；

(5)将步骤(4)中的最终酶解产物进行常压干燥，得到固体粉末样品；

本实施例4所得艾考糊精重均分子量为18536Da，数均分子量为5550Da，α-1,6糖苷键比例为7.94％，且分子量分布较集中。

实施例5

(1)将木薯淀粉用磷酸盐缓冲溶液配置成质量百分比浓度浓度为8％的淀粉溶液，并调节pH至6.8，置于密闭容器中，在96℃下搅拌糊化80min；糊化完成后，冷却至80℃，加入耐高温α-淀粉酶(Liquozyme Supra，Novozymes公司)，用量为每克干淀粉加入耐高温α-淀粉酶5U，酶解4min，调节pH至2.5，并保持11min灭酶活，得到酶解后的淀粉溶液；

(2)将步骤(1)的酶解后的淀粉溶液在pH为6.0，40℃条件下加入普鲁兰酶，用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶5U，搅拌反应60min；加热至100℃保持10min灭酶活，得到腹膜透析液粗酶解液；

(3)将步骤(2)中粗酶解液先用体积分数为40％乙醇醇沉，于0-4℃冰箱中静置12h，离心分离后取其沉淀物，再用蒸馏水洗涤后离心分离，将其沉淀物进行冷冻干燥；

(4)将步骤(3)得到的样品用蒸馏水配成质量百分比浓度为20％的溶液，经超滤膜(孔径10k-20kD)超滤，将分子量在1000010000(SMU-460)与20000Dal(SMU-470)的超滤膜超滤，将分子量在10000～20000Da之间的样品经葡聚糖凝胶色谱柱分离提纯，得到3种不同分子量的样品液，依次为样品液A(分子量在20000Da以上)；样品液B(10000Da到20000Da之间)；样品液C(10000Da以下)，利用凝胶渗透色谱(GPC)测定样品液B的重均、数均分子量，¹H-NMR测定其α-1,6糖苷键的含量(测定方法同实施例1)；

(5)将步骤(4)中的最终酶解产物进行冷冻干燥，得到固体粉末样品；

本实施例5所得艾考糊精重均分子量为18353Da，数均分子量为5952Da，α-1,6糖苷键比例为8.93％，且分子量分布较集中。

中国发明专利2014102015745公开了淀粉基补铁营养强化剂的制备方法。该方法先将淀粉原料配成淀粉乳，并调节pH，置于密闭容器中在95～99℃下搅拌糊化30～60min；糊化完成后，将糊化液冷却，加入脱支酶，在45～65℃下搅拌反应；调节pH至5.5～7.0，加入α-淀粉酶，在45～110℃下搅拌反应，得直链淀粉溶液。但从上述实施例可知，利用淀粉酶和脱支酶对淀粉进行酶解，现有技术已有一定的介绍；如但是现有技术基本是先用脱支酶酶解再用α-淀粉酶酶解，顺序与本发明相反，目的也完全不同。现有技术大多是为了得到直链淀粉；而本发明为了得到艾考糊精，是有一定的支链的淀粉。而且由于数均分子量的范围难以控制，分支度不容易通过酶解得以控制，很难在数均、重均分子量以及α-1,6糖苷键三方面同时满足艾考糊精要求；现有技术尚未发现用酶解的方式制备艾考糊精；中国发明专利2013104530981就是用酸解的方式制备艾考糊精。

本发明先使用淀粉酶酶解α-1,4糖苷键，将原淀粉的主链分解成片段，再在脱支酶作用下，通过部分酶解淀粉溶液中的α-1,6糖苷键，将酶解产物中的α-1,6糖苷键比例协同控制在10％以下，关键是要合理控制酶解时间与加酶量以及温度等工艺条件，通过脱支酶酶解α-1,6糖苷键，耐高温α-淀粉酶酶解α-1,4糖苷键，将酶解产物的分支度进行控制，继而控制重均与数均分子量的范围，最后通过筛选两种酶的酶解条件使得重均分子量与数均分子量同时达到标准。淀粉酶与脱支酶共同作用控制糖苷键比例和分散度的艾考糊精的现有技术还未见报道。

以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方法，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。