专利名称：肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及畜牧生产新技术和兽用疫苗领域。
背景技术：
促进农业动物的肌肉生长一直是畜牧生产和畜牧研究所追求的目标。促进畜禽的肌肉生长或提高瘦肉率，不仅提高动物饲养的效率，还可以生产优质和健康的肉类，并且大大提高畜牧生产的经济效益。
目前主要通过常规的育种工作、调节营养素和营养水平来促进肌肉生长和提高畜禽肌肉生长的速度。但到目前为止，畜禽在常规则生产和饲养技术下的肌肉生长性能已经发挥到了极限，利用以上常规方法促进肌肉生长的空间已经越来越小。要进一步促进肌肉的生长，提高畜牧生产效率和生产优质肉品，必须寻找更新的技术方法，调控和促进肌肉的生长。
可以大幅提高肌肉生长性能的方法主要为内分泌调控技术，包括使用①类固醇激素、②β-肾上腺素受体激动剂、③生长激素、④生长激素释放激素及其制剂和⑤主动免疫生长抑素等。
以上内分泌调控技术中，由于类固醇激素、β-肾上腺素受体激动剂(即β-兴奋剂)和生长激素由于其药残问题和潜在的对人体生理活动的影响，都被明令禁止使用。而主动免疫生长抑素的技术则因促生长效应仅限于幼龄动物且效果很不稳定，也不能很好地应用于畜牧生产。
目前发现在动物的肌肉生长过程中特别是在肌肉生长的后期，肌肉细胞产生一种名为第8生长分化因子(Growth Differentiation Factor-8，简称GDF-8)的内分泌因子，该因子也被称为肌肉生长抑制素(Myostatin，简称MSTN)。肌肉生长抑制素作用于肌肉细胞表面的受体，从而抑制肌肉细胞的肥大或过度生长。本发明创造的任务或要解决的问题，就是在不影响动物的遗传基础、营养和饲养要求或条件下，解除或去除动物“肌肉生长抑制素”对肌肉生长的抑制作用，使肌肉细胞或组织在生长后期能够不受限制继续生长或肥大，从而大幅度提高肌肉生长速度。
目前美国已经生产出专门结合或中和抑制“肌肉生长抑制素”的特异性抗体，该抗体使“肌肉生长抑制素”不能与肌肉细胞表面的受体结合，解除其对肌细胞生长的抑制作用，从而实现肌肉的“无限制”生长。目前发现对小鼠注射该抗体(称为“被动免疫”)可以把肌肉组织重量提高20～30％。但该“被动免疫”技术目前仅处于实验阶段，同时“被动免疫”的做法还必需每天注射抗体，在生产上因操作繁琐和国外受动物福利人士的抗议而无生产应用前景。因此本发明的目的或任务是采用“主动免疫”的途径，制备“肌肉生长抑制素”的基因工程疫苗并用该疫苗对动物进行免疫，然后利用动物自身的免疫系统长期生产抗“肌肉生长抑制素”的抗体，该抗体完全具有专门结合和抑制“肌肉生长抑制素”的能力，从而也能够解除“肌肉生长抑制素”对肌细胞生长的抑制作用，实现肌肉的“无限制”生长。
发明内容
本发明的内容包括1)肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，和2)对动物或畜禽主动免疫肌肉生长抑制素基因工程疫苗促进动物肌肉生长的两部分。
一.肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备肌肉生长抑制素基因在肌肉细胞中被首先翻译为一375个氨基酸残基的激素肽原，该肽原的263-266氨基酸残基处有一蛋白裂解位点RSRR，在此处将氨基端的亲水性分泌信号肽切下后产生具生物活性的羧基端109个氨基酸残基的肌肉生长抑制素成熟肽。由于肌肉生长抑制素在不同物种之间(包括畜禽)呈高度保守，其基因核苷酸序列在不同物种之间非常相似，所编码的成熟肽氨基酸残基序列在猪、鸡和鹅都一样，因此任何这些动物的基因都可以用于制备肌肉生长抑制素的基因工程疫苗。
肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，①克隆畜禽肌肉生长抑制素编码基因，②利用畜禽肌肉生长抑制素编码基因，制备肌肉生长抑制素的重组融合蛋白，③利用该肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫原制备肌肉生长抑制素的基因工程疫苗。
克隆畜禽肌肉生长抑制素编码基因，①利用根据GenBank中所发表的鸡肌肉生长抑制素基因序列，设计出该基因的特异性上游引物P1(序列为5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)和下游引物P2(序列为5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)；②利用异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从畜禽肌肉组织中提取总RNA作为模板用引物P2反转录成第一链cDNA；③用该第一链cDNA作为模板和引物P1、P2通过PCR反应扩增出鸡、猪或鹅的肌肉生长抑制素的编码cDNA序列。
制备畜禽肌肉生长抑制素重组融合蛋白制备方法之一是利用IPTG诱导大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株表达制备重组融合蛋白①根据肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，合成上游引物P3(序列为5‘-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3’，下划线部分为BamHI限止性酶切位点)和下游引物P4(序列为5‘-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3’，下划线部分为SacI限止性酶切位点)；②利用该对引物、上述反转录扩增出的肌肉生长抑制素编码cDNA序列作为模板，再次通过PCR反应扩增出肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③扩增出的肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过BamHI和SacI双酶切后，克隆入表达质粒pRSET A的BamHI和SacI两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pMSTN SCAU；④将重组表达质粒pMSTN SCAU转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，在培养液中加入0.01mmol/L的IPTG诱导6小时使重组细菌表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白。
制备畜禽肌肉生长抑制素重组融合蛋白方法之二是利用毕赤酵母在甲醇诱导下表达此融合蛋白①根据狮头鹅肌肉生长抑制素成熟肽编码cDNA的碱基序列和用于转化毕赤酵母的穿梭质粒pPICZαA的多克隆位点的碱基序列，设计上游引物YP1(序列为5‘-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3’，下划线部分为EcoRI酶切位点)和下游引物YP2(5‘-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3’，下划线部分为KpnI酶切位点)；②利用该对引物、以上反转录扩增出的肌肉生长抑制素编码cDNA序列作为模板，再次通过PCR反应扩增出肌肉生长抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭质粒克隆片段，该cDNA克隆片段经过EcoRI和KpnI双酶切后，克隆入穿梭质粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位点之间后，构建成重组质粒pPICZ-MSTN SCAU；③将重组质粒pPICZ-MSTN SCAU线性化并转化感受态酵母菌X-33，并在ZeocinTM的YPDS固体培养基培养，挑选白色菌落至YPDS液体培养基培养，并用上游引物AOX1(5‘-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3’)通过PCR反应来鉴定和挑选Mut+表型重组酵母；④挑取将肌肉生长抑制素成熟肽融合基因正确整合入基因组的单个重组酵母菌接种于BMGY培养基培养，对培养液中添加甲醇至终浓度0.5％诱导表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白，所表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培养液中。
纯化所表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白，将用8Mol尿素裂解以上表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，或通过离心分离出含有肌肉生长抑制素重组融合蛋白的酵母培养液，将两种含有肌肉生长抑制素重组融合蛋白的溶液通过Ni-NTA凝胶纯化树脂进行层析，最后洗脱纯化出肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫用的抗原。
将以上纯化出的肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫原制备油乳剂疫苗①按2～6mg/mL的浓度将肌肉生长抑制素重组融合蛋白溶于含2～4％Tween80的水溶液中制成水相；②将10号轻质白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向内加入2％的硬脂酸铝，混合均匀制成油相；③将水相和油相按4∶6的比例混合，并于搅拌机下制成油包水的均质乳液作为肌肉生长抑制素基因工程疫苗。
肌肉生长抑制素基因工程疫苗的应用，主要是通过主动免疫的途径促进动物的肌肉生长，对生长阶段的猪、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周于肌肉内注射肌肉生长抑制素基因工程油乳剂疫苗，促进动物体内免疫系统产生抗自身肌肉生长抑制素的抗体，该抗体可以中和抑制动物肌肉细胞分泌的肌肉生长抑制素，解除肌肉生长抑制素对畜禽肌肉生长的抑制作用，促进动物肌肉的生长。
现结合实例和附图对该发明作进一步说明，其中附
图1为肌肉生长抑制素重组融合基因的大肠杆菌表达质粒的构建流程图。附图2为含有肌肉生长抑制素重组融合基因的酵母穿梭质粒的构建流程图。附图1所列构建步骤为，①从狮头鹅肌肉生长抑制素编码cDNA中扩增出其成熟肽cDNA克隆片段，并将该片段经BamHI和SacI双酶切；②另外将用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的质粒pRSET A同样用BamHI和SacI双酶切；③然后将酶切后的成熟肽cDNA克隆片段和pRSET A载体用T4连接酶连接，构建成表达质粒pMSTN SCAU，其中用于表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列2所示。附图2所列构建步骤为，①从狮头鹅肌肉生长抑制素编码cDNA中扩增出其成熟肽cDNA克隆片段，并将该片段经EcoRI和KpnI双酶切后；②另外将用于向酵母基因组整合外源基因的穿梭质粒pPICZαA同样用EcoRI和KpnI双酶切；③然后用酶切后的成熟肽cDNA克隆片段和穿梭质粒pPICZαA载体用T4连接酶连接，构建成重组穿梭质粒pPICZ-Mstn SCAU，其中用于表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
具体实施方案以下是利用从狮头鹅中克隆出的肌肉生长抑制素编码cDNA进行制备肌肉生长抑制素的基因工程疫苗的说明。由于到目前为止所发现的不同动物的肌肉生长抑制素的成熟肽氨基酸残基序列极为相似，因此除了利用狮头鹅的肌肉生长抑制素基因外，还可以用鸡、猪、牛和羊的肌肉生长抑制素基因来制备肌肉生长抑制素的基因工程疫苗。
具体的做法是(1)获得或克隆畜禽的肌肉生长抑制素编码基因，(2)利用该基因在大肠杆菌或酵母中表达肌肉生长抑制素的重组融合蛋白作为抗原或免疫原，(3)纯化所表达的肌肉生长抑制素融合蛋白免疫原并将其与矿物油佐剂混合制成肌肉生长抑制素疫苗。
1.动物肌肉生长抑制素编码cDNA的克隆①根据GenBank中所发表的畜禽肌肉生长抑制素基因序列，设计出该基因的特异性引物。上游引物P1(5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)对应于肌肉生长抑制素基因编码区第1-22位核苷酸；下游引物P2(5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)对应于肌肉生长抑制素基因编码区第1109-1128位核苷酸。上下游引物之间包含了1128bp的核苷酸序列，覆盖了畜禽肌肉生长抑制素编码区cDNA的完整序列及之后的TGA终止密码子。
②取100mg狮头鹅骨骼肌，置于1ml异硫氰酸胍苯酚溶液(Trizol液，Invitrogen公司)中匀浆，然后用氯仿去除蛋白质，离心15分钟后取出上清液，向上清液中加入异丙醇再离心沉淀总RNA。把总RNA配成1μg/μl的浓度溶于含DEPC的水中，并与下游引物P2和dNTP混合，在AMV反转录酶催化下进行反转录合成第一链cDNA。
③用引物P1、P2、dNTP和反转录合成的第一链cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增出狮头鹅的肌肉生长抑制素的编码cDNA片段。
④将所扩增出的狮头鹅肌肉生长抑制素cDNA片段与克隆质粒pUCm-T载体(购于上海生工公司)的连接，并将构建成的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α株(Invitrogen公司)进行复制、永久保存、核苷酸序列测定。序列表中序列1为用此方法反转录扩增出的狮头鹅肌肉生长抑制素cDNA的核苷酸序列，其中下划线部分分别对应P1和P2引物，第799～1125位核苷酸为肌肉生长抑制素成熟肽的编码cDNA序列，最后的tga为终止密码子。该扩增的狮头鹅肌肉生长抑制素基因核苷酸序列与其它禽类的同源性在90％以上，和家畜的同源性在85％以上；所编码的成熟肽氨基酸残基序列与鸡、猪的完全一样，与牛的仅有2个氨基酸残基的差异，与羊的仅有3个氨基酸残基的差异。因此完全可以用狮头鹅肌肉生长抑制素编码cDNA制备肌肉生长抑制素基因工程疫苗。
2.肌肉生长抑制素重组融合蛋白的表达利用狮头鹅肌肉生长抑制素cDNA，可以通过原核表达系统如大肠杆菌BL21DE3株(Invitrogen公司)或真核表达系统如毕赤酵母(Invitrogen公司)进行肌肉生长抑制素重组融合蛋白的表达。
(1)大肠杆菌BL21 DE3株(Invitrogen公司)中表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白①根据测序所得到的狮头鹅肌肉生长抑制素cDNA的核苷酸序列，按其成熟肽的cDNA序列(序列表中序列1)，设计一上游引物P3(5‘-ATT GATT TTGGCCTTGACT-3’)对应于肌肉生长抑制素基因编码区的第799～814位核苷酸序列，并含一BamHI酶切位点(双下划线部分)和一下游引物P4(5‘-AAT TGAGCACCCGCAACGA-3’)，对应于肌肉生长抑制素基因编码区的第1109～1125位核苷酸序列，含一SacI酶切位点(双下划线部分)和该位点之后补充的两个腺嘌呤核苷酸(单下划线部分)以维持扩增片段的阅读框架。②利用引物P3、P4、扩增得到的肌肉生长抑制素cDNA片段作为模板和dNTP在Pfu DNA聚合酶催化下经PCR反应再次扩增出两端带有BamHI和SacI酶切位点的肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段，用于插入表达质粒pRSET A(Invitrogen公司)。图1显示了含有肌肉生长抑制素重组融合基因的大肠杆菌表达质粒的构建流程利用引物P3和P4扩增得到肌肉生长抑制素成熟肽cDNA克隆片段，将该片段经BamHI和SacI双酶切；将具有多克隆酶切位点、能够装载并在大肠杆菌中表达外源基因的表达质粒pRSETA用BamHI和SacI双酶切；然后用T4连接酶连接肌肉生长抑制素成熟肽cDNA克隆片段和表达质粒pRSET A载体，构建成表达质粒pMSTNSCAU。其中肌肉生长抑制素重组融合基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中下划线部分分别与引物P3和P4相对应，下划线之间的部分为肌肉生长抑制素成熟肽cDNA序列，其余部分为来自于质粒的核苷酸序列。③将该重组表达质粒pMSTN SCAU转化大肠杆菌BL21 DE3株，重组细菌在培养后0.01mmol/L在IPTG浓度下诱导6小时表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白。该重组融合蛋白的氨基酸残基序列如序列表中序列3所示，其中单下划线部分即为肌肉生长抑制素成熟肽109个氨基酸残基序列，其前方和后方分别为来自表达质粒的36位和14位氨基酸残基序列，双下划线部分为6个组氨酸残基标记(His-Tag)。
(2)在毕赤(Pichia)酵母中表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白①根据狮头鹅肌肉生长抑制素成熟肽cDNA核苷酸序列和用于转化毕赤酵母的穿梭质粒pPICZαA(Invitrogen公司)的多克隆位点核苷酸序列，设计一对特异性引物。上游引物YP1(5‘-AGG GATTTTGGCCTTGACTGC-3’)，对应于肌肉生长抑制素基因编码区的第799～816位核苷酸序列，含EcoRI酶切位点(双下划线部分)；下游引物YP2(5‘-AA TGAGCACCCGCAACG-3’)，对应于肌肉生长抑制素基因编码区的第1110～1125位核苷酸序列，含一KpnI酶切位点(双下划线部分)和维持阅读框架的两个碱基TT(单下划线部分)。②利用引物YP1、YP2、dNTP、反转录PCR扩增得到的肌肉生长抑制素cDNA片段作为模板，在Pfu DNA聚合酶催化下经PCR反应扩增出两端带有EcoRI和KpnI酶切位点的肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段。图2显示了含有肌肉生长抑制素重组融合基因的酵母穿梭质粒的构建流程利用引物YP1和YP2扩增得到肌肉生长抑制素成熟肽cDNA克隆片段，将该片段用EcoRI和KpnI双酶切；将具有多克隆酶切位点、能够装载并在将外源基因整合到毕赤酵母基因组中的穿梭质粒pPICZαA用EcoRI和KpnI双酶切；然后用T4连接酶连接肌肉生长抑制素成熟肽cDNA克隆片段穿梭质粒pPICZαA载体，构建成重组穿梭质粒pPICZ-Mstn SCAU。该质粒中的肌肉生长抑制素重组融合基因的cDNA序列如序列表中序列4所示，其中下划线部分分别对应于YP1和YP2，中间为肌肉生长抑制素成熟肽编码cDNA，之前为α因子信号肽编码cDNA，之后为来自于穿梭质粒的核苷酸所编码的氨基酸残基，其中包括一个6个组氨酸的标记(His-tag)。③将重组穿梭质粒pPICZ-Mstn SCAU转化大肠杆菌DH5α株在其中进行复制，取培养的含有重组穿梭质粒的DH5α培养菌液涂布低盐LB(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl)+ZeocinTM(25μg/mL)固体培养基上培养，挑取单菌落至低盐LB+ZeocinTM液体培养基培养，进行PCR和酶切鉴定和测序鉴定。④将鉴定构建正确的重组质粒pPICZ-Mstn SCAU线性化，提纯后电击转化感受态酵母菌X-33，涂布含ZeocinTM的YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L D-葡萄糖，1mol/L山梨醇，20g/L琼脂粉)固体培养基，培养至白色菌落出现。挑单菌落至YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L D-葡萄糖)液体培养基培养。同时合成一对引物，上游引物AOX1(5‘-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAAT GGCATTC TGAATCC-3’)。用引物AOX1、AOX2、dNTP、重组酵母培养菌在DNA聚合酶催化下进行PCR反应，鉴定并挑选Mut+表型重组酵母。⑤挑选构建正确的已经将肌肉生长抑制素成熟肽基因整合入基因组的单个重组酵母菌接种于25mLBMGY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/LD-生物素，10mL/L丙三醇，100mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0)培养基30℃培养至OD600＝2.6，收获重组酵母菌并用BMMY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/L D-生物素，5mL/L甲醇，100mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0)培养基稀释至OD600＝1，30℃振荡培养4d，每隔24h添加甲醇至终浓度0.5％，每12h取样备SDS-PAGE分析所表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白。
以上用毕赤酵母所表达的重组蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。其中含来自于载体的89个氨基酸的α因子信号肽序列，109个氨基酸残基的肌肉生长抑制素成熟肽序列(下划线部分)，来自质粒基因序列所编码的29个残基的肽序列和用于纯化的6个氨基酸残基的组氨酸标记。酵母在表达时会将该蛋白分泌至胞外培养液中，此时会把氨基端的89个氨基酸的α因子信号肽序列裂解开，形成包含一个144氨基酸残基的肌肉生长抑制素重组融合蛋白，其中109个氨基酸残基为肌肉生长抑制素成熟肽的氨基酸残基序列，羧基端的35个氨基酸残基为来自质粒pPICZαA的基因所编码，包括位于最后的6个组氨酸残基标记(His-tag)。
3.肌肉生长抑制素重组融合蛋白的纯化利用大肠杆菌表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白的氨基端具有一6个连续组氨酸的标记(His-tag)，在酵母表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白的羧基端具有一6个连续组氨酸的标记。此His-Tag标记能够与镍离子发生特异亲和结合，因此将表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的细菌经8M尿素溶液裂解、或将在甲醇诱导后表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的酵母培养表达液加载到Ni-NTA凝胶纯化树脂层析柱，使其中的肌肉生长抑制素重组融合蛋白被吸附到Ni-NTA凝胶纯化树脂并洗脱不能与镍离子树脂结合的菌体杂蛋白，最后改变洗脱液pH值将目的蛋白肌肉生长抑制素重组融合蛋白洗脱纯化。
4.肌肉生长抑制素油乳剂疫苗的制备将以上所表达并纯化出的肌肉生长抑制素重组融合蛋白按2～6mg/mL的浓度溶于含2～4％Tween 80的水溶液中制成水相；再将10号轻质白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向加入2％的硬脂酸铝混合均匀制成油相；将水相和油相按4∶6的比例混合，并于搅拌机下制成油包水的均质乳液作为肌肉生长抑制素基因工程疫苗。
二.畜禽主动免疫“肌肉生长抑制素”基因工程疫苗促进肌肉生长的方法对猪、牛、羊、山羊和鹿每隔3-4周肌肉注射以上制备的“肌肉生长抑制素”的基因工程油乳剂疫苗，即可以有效促进动物体内免疫系统产生抗自身肌肉生长抑制素的抗体，该抗体可以中和抑制动物肌肉细胞自身分泌的肌肉生长抑制素，解除肌肉生长抑制素对畜禽肌肉生长的抑制作用，促进畜禽肌肉的生长。
与现有技术相比所具有的优点、特点或者积极效果“主动免疫肌肉生长抑制素基因工程疫苗促进畜禽肌肉生长的方法”所使用的物质是“肌肉生长抑制素”基因工程疫苗或“肌肉生长抑制素”的重组融合蛋白，该蛋白无毒性，不对动物造成任何疾病；该蛋白作为基因工程疫苗使用后使动物产生本质是上免疫球蛋白的抗体，不会造成其他药物残留，对人畜无害，不会对消费者产生任何不良影响。与其他任何技术相比，该技术促进肌肉组织生长的效力强，特异性高，具有其他任何技术无法比拟的优点和性能。
序列表<110>华南农业大学<120>肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备及其应用<140>
<141>
<160>5<210>1<211>1128<212>DNA<213>狮头鹅(Anser anser)<220>
<222>(1)...(1128)<223>肌肉生长抑制素编码区cDNA序列<220>
<221>misc_recomb<222>(1)...(12)<223>引物P1对应区域<220>
<221>misc_recomb<222>(799)...(814)<223>引物P3对应区域<220>
<221>mat_peptide<222>(799)...(1125)<223>肌肉生长抑制素成熟肽cDNA序列<220>
<221>misc_recomb<222>(1109)...(1128)<223>引物P2对应区域<220>
<221>misc_recomb<222>(1110)...(1125)<223>引物P4对应区域<400>1atgcaaaagc tagcagtcta tgtttatatt tacctgttca tgctgatttc agttgatccg 60gtggctcttg atgacggtag tcaccccaca gagaatgctg aaaaagatgg actgtgcaat 120gcttgtacat ggagacagaa tacaaaatct tccagaatag aagccataaa aattcaaatc 180ctcagcaaac tgcgtctgga acaagctcct aacattagca gggatgttat taaacaactt 240ttacccaaag ctcctccact acaggaactg gttgatcaat atgacgtcca gagagatgac 300agtagcgatg gctctttgga agacgatgac tatcatgcca caactgaaac gattatcaca 360atgcctacag agtctgattt tcttgtacaa atggagggaa aaccaaaatg ttgcttcttt 420aagtttagct ctaaaataca atataacaaa gtagtaaagg cacaattgtg gatatacttg 480aggcaagtcc aaaaacctac aacagtgttt gtgcagatcc tgagacttat taagcccatg 540aaagacggta caagatatac tggaattcga tctttgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600
ggtatttggc agagtattga tgtgaagaca gtgttgcaaa attggctcaa acagcctgaa 660tccaatttag gcgtcgaaat aaaagctttt gatgagaatg gacgagatct tgctgtaact 720ttcccaggac caggtgaaga tggattgaat ccatttttag aggtcagagt tacagacaca 780ccgaaacgat cccgcaga gcgatg agcactcgac agaatccaga 840tgttgtcgct acccactaac tgtggacttt gaagcttttg gatgggactg gattatcgca 900cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa 960tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca aatcctagag gctcggcagg cccctgctgc 1020acgcccacca agatgtcccc cataaatatg ttgtatttca atggaaaaga acaaataata 1080tacggaaaga taccagccat ggttgtag 1128
<210>2<211>480<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(480)<223>质粒pMSTN SCAU中肌肉生长抑制素重组融合基因序列<220>
<222>(103)...(124)<223>引物P3对应区域<220>
<222>(419)...(443)<223>引物P4对应区域<400>2atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga ttttggcctt120gactgcgatg agcactcgac agaatccaga tgttgtcgct acccactaac tgtggatttt 180gaagcttttg gatgggactg gattatcgca cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct 240ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca 300aaccctagag gctcggcagg cccctgctgc acgcccacca agatgtcccc cataaatatg 360ttgtatttca atggaaaaga acaaataata tacggaaaga taccagccat ggttgtagat420cgttgcgggt gctcattgag ctcgagatct gcagctggta ccatggaatt cgaagcttga 480
<210>3<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
<222>(1)...(159)<223>重组大肠杆菌表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白氨基酸残基序列<220>
<222>(5)...(10)<223>His-tag标记氨基酸残基序列<220>
<222>(27)...(145)<223>肌肉生长抑制素成熟肽氨基酸残基序列<400>3Met Arg Gly Ser 1 5 10Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln11 15 20Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp21 25 30Lys Asp Arg Trp Gly SerAsp Phe Gly Leu31 35 40Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg
41 45 50Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe51 55 60Glu Ala Phe Gul MMT arp Asp Trp Ile Ile Ala61 65 70Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser71 75 80Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys81 85 90Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala91 95 100Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys101 105 110Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met111 115 120Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile121 125 130Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp131 135 140Arg Cys Gly Cys SerLeu Ser Ser Arg Ser141 145 150Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Glu Ala151 155 159
<210>4<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(702)<223>质粒pPICZ-MSTN SCAU中肌肉生长抑制素重组融合基因序列<220>
<222>(268)...(291)<223>引物YP1对应的区域<220>
<222>(585)...(608)<223>引物YP2对应的区域<400>4atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgattttg gccttgactg cgatgagcac300tcgacagaat ccagatgttg tcgctaccca ctaactgtgg actttgaagc ttttggatgg 360gactggatta tcgcacctaa aagatacaaa gccaattact gctctggaga atgtgaattt 420gtatttctac agaaatatcc gcacactcat cttgtacacc aagcaaatcc tagaggctcg 480gcaggcccct gctgcacgcc caccaagatg tcccccataa atatgttgta tttcaatgga 540aaagaacaaa taatatacgg aaagatacca gccatggttg tagatcgttg cgggtgctca600aaggtacctc gagccgcggc ggccgccagc tttctagaac aaaaactcat ctcagaagag 660gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt ga 702
<210>5<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<222>(1)...(233)<223>重组酵母表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白氨基酸残基序列<220>
<222>(1)...(89)<223>α因子信号肽氨基酸残基序列<220>
<222>(92)...(200)<223>肌肉生长抑制素成熟肽氨基酸残基序列<400>5Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val1 5 10Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala11 15 20Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr21 25 30Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly31 35 40
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val41 45 50Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn51 55 60Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile61 65 70Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val71 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu81 85 90PheAsp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His91 95 100Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro101 105 110Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp111 115 120Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys121 125 130Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe131 135 140Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His141 145 150Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser151 155 160Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met161 165 170
Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly171 175 180Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro181 185 190Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser191 195 200Lys Val Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser201 205 210Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu211 215 220Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His221 225 230His His His231 23权利要求
1.肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，其特征在于①克隆畜禽肌肉生长抑制素编码基因，②利用畜禽肌肉生长抑制素编码基因，制备肌肉生长抑制素的重组融合蛋白，③利用该肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫原制备肌肉生长抑制素的基因工程疫苗。
2.根据权利要求1所说的肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，其特征在于克隆畜禽肌肉生长抑制素编码基因，①利用根据GenBank中所发表的鸡肌肉生长抑制素基因序列，设计出该基因的特异性上游引物P1(序列为5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)和下游引物P2(序列为5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)；②利用异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从畜禽肌肉组织中提取总RNA作为模板用引物P2反转录成第一链cDNA；③用该第一链cDNA作为模板和引物P1、P2通过PCR反应扩增出鸡、猪或鹅的肌肉生长抑制素的编码cDNA序列。
3.根据权利要求1所说的肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，其特征在于制备畜禽肌肉生长抑制素重组融合蛋白，制备方法之一是利用IPTG诱导大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株表达制备重组融合蛋白①根据肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，合成上游引物P3(序列为5‘-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3’，下划线部分为BamH I限止性酶切位点)和下游引物P4(序列为5‘-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3’，下划线部分为Sac I限止性酶切位点)；②利用该对引物、上述反转录扩增出的肌肉生长抑制素编码cDNA序列作为模板，再次通过PCR反应扩增出肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③扩增出的肌肉生长抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过BamH I和SacI双酶切后，克隆入表达质粒pRSET A的BamH I和Sac I两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pMSTN SCAU；④将重组表达质粒pMSTN SCAU转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，在培养液中加入0.01mmol/L的IPTG诱导6小时使重组细菌表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白。
4.根据权利要求1所说的肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，其特征在于制备畜禽肌肉生长抑制素重组融合蛋白，制备方法之二是利用毕赤酵母在甲醇诱导下表达此融合蛋白①根据狮头鹅肌肉生长抑制素成熟肽编码cDNA的碱基序列和用于转化毕赤酵母的穿梭质粒pPICZαA的多克隆位点的碱基序列，设计上游引物YP1(序列为5‘-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3’，下划线部分为EcoR I酶切位点)和下游引物YP2(5‘-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3’，下划线部分为Kpn I酶切位点)；②利用该对引物、以上反转录扩增出的肌肉生长抑制素编码cDNA序列作为模板，再次通过PCR反应扩增出肌肉生长抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭质粒克隆片段，该cDNA克隆片段经过EcoR I和KpnI双酶切后，克隆入穿梭质粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位点之间后，构建成重组质粒pPICZ-MSTN SCAU；③将重组质粒pPICZ-MSTN SCAU线性化并转化感受态酵母菌X-33，并在ZeocinTM的YPDS固体培养基培养，挑选白色菌落至YPDS液体培养基培养，并用上游引物AOX1(5‘-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3’)通过PCR反应来鉴定和挑选Mut+表型重组酵母；④挑取将肌肉生长抑制素成熟肽融合基因正确整合入基因组的单个重组酵母菌接种于BMGY培养基培养，对培养液中添加甲醇至终浓度0.5％诱导表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白，所表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培养液中。
5.根据权利要求1所说的肌肉生长抑制素基因工程疫苗的制备，其特征在于纯化所表达的肌肉生长抑制素重组融合蛋白，将用8Mol尿素裂解以上表达肌肉生长抑制素重组融合蛋白的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，或通过离心分离出含有肌肉生长抑制素重组融合蛋白的酵母培养液，将两种含有肌肉生长抑制素重组融合蛋白的溶液通过Ni-NTA凝胶纯化树脂进行层析，最后洗脱纯化出肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫用的抗原。
6.根据权利要求1所说的肌肉生长抑制素基因基因工程疫苗的制备，其特征在于将以上纯化出的肌肉生长抑制素重组融合蛋白作为免疫原制备油乳剂疫苗①按2～6mg/mL的浓度将肌肉生长抑制素重组融合蛋白溶于含2～4％Tween 80的水溶液中制成水相；②将10号轻质白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向内加入2％的硬脂酸铝，混合均匀制成油相；③将水相和油相按4∶6的比例混合，并于搅拌机下制成油包水的均质乳液作为肌肉生长抑制素基因工程疫苗。
7.肌肉生长抑制素基因工程疫苗的应用，主要是通过主动免疫的途径，用于促进动物的肌肉生长，其特征在于对生长阶段的猪、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周于肌肉内注射肌肉生长抑制素基因工程油乳剂疫苗，促进动物体内免疫系统产生抗自身肌肉生长抑制素的抗体，该抗体可以中和抑制动物肌肉细胞分泌的肌肉生长抑制素，解除肌肉生长抑制素对畜禽肌肉生长的抑制作用，促进动物肌肉的生长。
全文摘要
本发明属于兽用疫苗制备领域，通过基因工程的方法，克隆肌肉生长抑制素的基因，在大肠杆菌或酵母中表达肌肉生长抑制素的重组融合蛋白作为免疫原或基因工程疫苗。对生长畜禽主动免疫此肌肉生长抑制素基因工程疫苗，可以促进动物产生抗肌肉生长抑制素的抗体，该抗体可以中和抑制畜禽体内肌肉自身产生的肌肉生长抑制素，解除肌肉生长抑制素的抑制肌肉生长作用，从而促进肌肉生长。该技术促进肌肉生长效力强，特异性高，并且无毒性，无致病性，无药物残留，不对消费者产生任何不良影响。
文档编号C12P19/00GK1569230SQ20031011202
公开日2005年1月26日 申请日期2003年11月5日 优先权日2003年11月5日
发明者施振旦, 刘颖, 郭文军 申请人:华南农业大学