专利名称：基因重组融合蛋白k1－en的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤即癌症，是威胁人类健康的最严重的疾病之一。恶性实体肿瘤的常规治疗包括手术摘除、化学治疗、放射治疗等，这些治疗方法存在易复发，对人体的毒副作用大，会诱导抗药性产生等不理想之处。生命科学基础研究的突破和生物技术的发展，为恶性肿瘤的最终攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世纪70年代初，Folkman博士提出“肿瘤增殖具有血管依赖性”的观点，即体积超过1mm3～2mm3的肿瘤需要新生血管维持营养和氧气的供给并且排出代谢产物，还需要新生血管提供转移的通道。从这个观点出发，提出一种治疗肿瘤的新策略，即不直接从正面攻击肿瘤，而是阻断肿瘤的营养供应，间接地抑制肿瘤生长，使其处于休眠状态。这就是抗血管生成疗法，也被形象地称为肿瘤的“饿死疗法”。
抗血管生成疗法是近几年来肿瘤生物治疗研究的热点，与以往的方法相比，有着显著的优越性①广泛的抑瘤谱；②不易产生耐药性；③无明显毒副作用；④药物易于到达靶部位；⑤可同时治疗肿瘤的转移；⑥与化疗和放疗有协同作用。目前已发现了多种血管生成抑制剂，有数百种药物进入了临床试验阶段，大多数处于二期临床，有十几种药物进入了三期临床，它们都显示出了初步疗效和光明的治疗前景。
Angiostatin(血管抑素)是人纤溶酶原(Plasminogen)的kringle1-kringle4区域，具有抑制血管内皮细胞增殖的能力。目前血管抑素已进入一期临床试验。其中K1(Kringle 1)不仅能有效抑制内皮细胞的增殖，还具有结合赖氨酸的能力(可以用赖氨酸亲和柱纯化蛋白)。
Endostatin(内皮抑素，EN)是胶原蛋白XVIII C未端片段，根据人胶原蛋白XVIII得到的人Endostatin有183个氨基酸。Endostatin含有Zn结合位点，参与结合的氨基酸残基是位于第1，3，11位的组氨酸和第76位的天冬氨酸，其N端环绕Zn形成二聚体结构。Endostatin含有11个精氨酸，与肝素有很高的亲和力。Endostatin在癌症的临床治疗方面具有广阔的应用前景。一是它具有很强的抑制血管生成的作用，即使是肿瘤已发生转移，也可以抑制其进一步发展。二是Endostatin具有高特异性。对正常细胞及其它组织无明显影响，在观察期内没有发现对机体的毒害作用。三是不诱导杭药性产生。四是可实现对肿瘤的休眠疗法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，该方法利用毕赤酵母真核表达系统对重组基因K1-EN进行表达，从而得到一种多靶点、多功能、高效的抗肿瘤血管生成基因重组融合蛋白K1-EN。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建重组质粒pPICZαA-K1-EN包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是K1基因和EN基因；1段连接臂是连接K1基因和EN基因的柔性连接臂(Gly)3；b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建；c.重组融合蛋白K1-EN的表达；d.重组融合蛋白K1-EN的纯化。
上述的重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建方法为以K1基因为模板进行PCR扩增，得到约300bp的K1基因。K1片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
上述的重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建的方法为以EN基因为模板进行PCR扩增，得到约560bp的EN基因，EN片段用Kpn I和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-EN；转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
上述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-K1-EN用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，点击参数为700V，5ms，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
上述的重组融合蛋白K1-EN的表达方法为将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到5.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为1.0％，发酵至第96小时时停止发酵，收获蛋白。
上述的重组融合蛋白K1-EN的纯化为用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，发酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002MPBS，PH＝7.4平衡好的亲和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去杂蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脱，洗脱产物经0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小时透析后冻存在-20℃。
毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(PAOX1)，在甲醇的诱导下能表达外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取与纯化。毕赤酵母能通过发酵罐发酵生产大量的目的蛋白，不需要外加热源，成本低，规模大。
图1为重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建流程2为K1-EN蛋白对PIEC细胞生长的抑制率曲线图具体实施方式
本发明主要包括三大部分重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建，重组融合蛋白K1-EN的表达与纯化，重组融合蛋白K1-EN生物活性的测定。
具体方案叙述如下1 重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建和鉴定1.1构建重组质粒pPICZαA-K1根据K1的核苷酸序列设计K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。
在K1的下游引物中引入连接臂(Gly)3的核苷酸序列，这样在PCR扩增之后就能直接得到约300bp的COOH端带有连接臂(Gly)3的K1片段。回收纯化扩增产物。
K1片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。重组质粒pPICZαA-K1用EcoRI和Kpn I双酶切，得到300bp和3.6kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，K1基因的序列正确。
1.2构建重组质粒pPICZαA-PFK-EN根据EN的核苷酸序列设计EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；
下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-EN。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
重组质粒pPICZαA-K1-EN用EcoRI和NotI双酶切，得到约860bp和3.6kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，K1-EN基因的序列正确。
2 重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建和鉴定重组质粒pPICZαA-K1-EN用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，点击参数为700V，5ms，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。挑选Zeocin浓度为1000ug/ml平板上长出的克隆。用玻璃珠法提取重组酵母的染色体组，以其为模板，以K1-EN的上下游引物进行PCR扩增，得到约860bp大小的片段，说明融合基因K1-EN成功地整合到了酵母染色体上。
3 重组融合蛋白K1-EN的表达将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到5.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为1.0％，并且每隔24小时(0，24，48，72，96小时)取出1ml菌液，将取出来的菌液离心，把上清液和菌体分别保存在-80℃。
将甲醇诱导不同时间(0，24，48，72，96小时)的发酵上清液浓缩后用SDS-PAGE分析，观察到在39KD处有特异性蛋白条带；并且随诱导时间延长，重组酵母表达目的产物的量也随之增加。Bradford法测定发酵液中总蛋白含量并用凝胶图像扫描测定目的蛋白所占的比例，计算出
4 重组融合蛋白K1-EN的纯化融合蛋白K1-EN中的K1具有结合赖氨酸的能力，因此可以用Sepharose 4B-Lys亲和柱纯化。用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，发酵上清液首先用0.002MPBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的亲和柱，0.01MPBS，PH＝7.4洗去杂蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脱，洗脱产物经0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小时透析后冻存在-20℃。
SDS-PAGE电泳图经凝胶图像密度扫描表明，纯化的重组融合蛋白K1-EN的纯度到达92.3％。本发明保留进一步提高纯度的可能。
5 12.8升发酵罐生产重组融合蛋白K1-EN在优化了的发酵条件下，重组融合蛋白K1-EN的表达量达到145mg/L。
6 MTT法测定重组融合蛋白K1-EN的生物活性将纯化得到的重组融合蛋白K1-EN，分别以终浓度100，50，25ng/ml加入猪髋动脉内皮细胞(PIEC)培养液中，用MTT比色分析法测定K1-EN蛋白对PIEC细胞生长的抑制率。图2的抑制率曲线表明K1-EN能抑制猪髋动脉内皮细胞的生长，ID50≈85ng/ml。
7 重组菌株的遗传稳定性将重组酵母菌pPICZαA-K1-EN/GS115传代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍稳定地整合在染色体上，SDS-PAGE结果说明目的蛋白仍然表达，Bradford法测定和凝胶图像密度扫描证实目的蛋白的表达量基本维持不变。
重组融合基因K1-EN的核苷酸序列为GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAAGGTGGCGGTACCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAG最终获得的重组融合蛋白K1-EN的氨基酸序列为VYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPE
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权利要求
1.一种基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建重组质粒pPICZαA-K1-EN包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是K1基因和EN基因；1段连接臂是连接K1基因和EN基因的柔性连接臂(Gly)3；b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建；c.重组融合蛋白K1-EN的表达；d.重组融合蛋白K1-EN的纯化。
2.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1的构建方法为根据K1的核苷酸序列设计K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。在K1的下游引物中引入连接臂(Gly)3的核苷酸序列，用来连接K1基因和EN基因。以K1的cDNA为模板，通过PCR直接得到约300bp的COOH端带有连接臂(Gly)3的K1片段。回收纯化扩增产物。K1片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1-EN的构建方法为根据EN的核苷酸序列设计EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-EN。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
4.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-K1-EN用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，点击参数为700V，5ms，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
5.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于所述的重组融合蛋白K1-EN的表达方法为将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到5.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为1.0％，发酵至第96小时时停止发酵，收获蛋白。
6.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-EN的制备方法，其特征在于所述的重组融合蛋白K1-EN的纯化为用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，发酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的亲和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去杂蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脱，洗脱产物经0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小时透析后冻存在-20℃。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组融合蛋白K1－EN的制备方法。该方法包括以下步骤重组质粒pPICZαA－K1－EN的构建、重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－EN/ GS115的构建、重组融合蛋白K1－EN的表达、重组融合蛋白K1－EN的纯化。毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(P
文档编号C07K1/00GK1896245SQ20061002620
公开日2007年1月17日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者黄筱颖, 陈宇光 申请人:上海大学