专利名称：采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质结晶领域，特别涉及一种采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法及采用该方法培养蛋白质晶体的方法。
背景技术：
随着人类基因组测序的完成，由基因控制表达的各种蛋白质的结构的测定成为当今生物学家的首要任务。确切地了解每一种蛋白质的三维结构，无论是对于客观地了解蛋白质的各项功能，还是研究出直接有效的治疗药物都是非常重要的。目前蛋白质三维结构的测定很大程度上还是通过X射线衍射来实现的，因此获得衍射能力好的蛋白质晶体是结构测定的前提条件。但由于蛋白质分子量大、结构复杂、容易失活等特点，蛋白质晶体生长要比其他晶体困难得多。现在如何获得适合于衍射实验的蛋白晶体已经成为了制约蛋白质结构测定的瓶颈。正是因为如此，研究蛋白质晶体生长的机理，改善蛋白质晶体生长的方法和条件成为研究热点。在结晶基底材料的选择上，就有过多种尝试，如多种矿物质表面、高分子聚合膜等等，但效果并不明显。本申请人曾将一种硅烷化云母作为蛋白质晶体生长的基底材料(参见2005年12月14日公开的、公开号为CN1707252的专利申请)，经过多种蛋白质的结晶实验证明，使用该基底能够改善若干种蛋白质的晶体生长过程。但是常规的蛋白质晶体生长方法，包括在上述硅烷化云母表面生长蛋白质晶体的方法，对蛋白质的活性要求都比较高。已有研究表明二维长程有序的云母表面可能具有诱导蛋白质分子有序排列的特性，然而这种特有的有序表面结构是不是也能够诱导蛋白质分子形成有序的晶核，并进一步形成高质量的蛋白质晶体则是一个新的课题；而且由于裸云母表面是亲水性的，它很难在常规的蛋白质结晶方法中作为基底材料使用，因为常规的蛋白质结晶使用的是悬滴法或坐滴法，这两种方法都要求基底表面是疏水的，否则蛋白质溶液会迅速在基底表面铺开，没有办法进行结晶。
发明内容
本发明的目的就是要解决上述课题，提供一种可得到更高质量晶体的采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法，以及采用该方法培养蛋白质晶体的方法。
本发明的目的之一通过下列技术方案来实现一种采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法，其包括下列步骤①将蛋白及其沉淀剂溶液滴在硅烷化的云母表面，在液滴上面覆盖新解理的裸云母片，在覆盖之前先在两云母片之间设置隔离装置；②将步骤①得到的体系翻转覆盖在按常规加有沉淀剂的晶体板上，从而使该裸云母成为蛋白质晶体生长的基底。
本发明所说的裸云母是指未经修饰的云母片，本发明优选洁净的新解理的云母片。硅烷化的云母可按上述CN1707252文献公开的方法来制得。
其中，步骤①中设置隔离装置是使裸云母表面和硅烷化的云母表面之间保持一定的间隔，这样蛋白和沉淀剂溶液的混合液就能够在两者之间形成一个液滴，液滴的高度由隔离装置的高度决定；如不设置隔离装置，则加入液体后，两个云母片表面会吸附在一起，形成不了液滴。
因此，所述隔离装置可为任一种可使上、下两云母片相隔的装置，其高度根据需要而定，通常不超过3.0mm，本发明优选0.3mm～1.5mm。简单易得地，本发明选用一O型圈或至少两根杆状物，如毛细管等，其固定在液滴周围或两侧的硅烷化的云母表面上。当然，也可以先固定于对应的裸云母上。
上述固定可为任何固定，简单地为黏附固定，如采用凡士林、真空脂或粘胶等来固定。
本发明的另一目的，即提供一种培养蛋白质晶体的方法，是通过下列技术方案来实现。其包括上述采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法；然后在该基底上按常规方法进行蛋白质晶体生长。其中，常规的蛋白质晶体生长方法和条件，可参见如上述专利申请文献公开的内容来进行，包括用凡士林将整个结晶体系密封，然后将结晶板静置在该蛋白相应的温度中进行晶体生长。本发明为试验目的，每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录。
本发明首次成功地将亲水的裸云母表面作为蛋白质晶体生长的基底表面，利用上述方法进行蛋白质晶体生长，不仅可以有效地控制晶体生长过程中的晶核数量，增大晶体的尺度；而且对于某些放置时间过长的蛋白质，当用现有结晶方法已经不能获得高质量的蛋白质晶体时，利用本发明的方法依然能够获得高质量的蛋白质晶体。
图1为人类造血干细胞中的蛋白质LA0415分别采用本发明的晶体生长方法得到的晶体照片(A)，及常规盖玻片悬滴法进行生长得到的晶体照片(B)。
图2为溶菌酶分别采用本发明的晶体生长方法得到的晶体照片(A)，采用常规盖玻片悬滴法进行生长得到的晶体照片(B)，以及采用硅烷化云母为基底得到的晶体照片(C)。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1以人类造血干细胞中的蛋白质LA0415为例说明利用这种晶体生长体系生长晶体，可以有效地控制蛋白质晶体生长过程中的晶核数量。其中蛋白质的结晶条件为蛋白原始浓度为20mg/ml，使用的沉淀剂(槽液)为8％(w/v)PEG8K，0.1M MES pH6.3，0.1M Li2SO4，结晶温度为4℃。
①用去离子水和乙醇彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；②用硅烷化试剂对经预处理后的云母表面进行硅烷化修饰，对硅烷化后云母进行钝化处理(云母硅烷化修饰及钝化处理的操作步骤请参见CN1707252)；③通过凡士林将两根毛细管固定在硅烷化的云母表面，蛋白和沉淀剂溶液按1∶1的比例滴在两根毛细管围成的区域中央，将洁净的新解理的云母片覆盖在液滴表面；④将这一体系翻转覆盖在已经加有上述沉淀剂的晶体板上，并用凡士林将整个结晶体系密封；⑤将结晶板静置在4℃的环境中，每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录。
实验结果如图1所示利用本发明新的晶体生长方法生长的LA0415晶体(A图)较利用普通盖玻片的悬滴法生长的晶体(B图)数量明显减少，晶体尺寸也增大，在硅烷化云母表面上生长的晶体和在盖破片上生长的情况类似。这说明利用本发明培养蛋白质晶体的方法能有效地控制蛋白质晶体生长过程中的晶核数量。
实施例2以4℃保存了10个月的溶菌酶(Lysozyme)为例说明利用本发明晶体生长体系生长晶体，可以有效地改善蛋白质晶体的外形，而且对蛋白质的活性要求也可以有所降低。其中，使用的溶菌酶由于在冰箱里放置了10个月，期间多次使用，经过圆二色谱分析发现，已有部分蛋白质失去了二级结构。我们试验用得其中溶菌酶的结晶条件参见Hampton公司出版的《Crystallization Research Tools》一书。即将溶菌酶蛋白粉末用缓冲液(0.1M醋酸钠，pH4.8)溶解，浓度为50mg/ml，使用的沉淀剂为8％W/V氯化钠，0.1M醋酸钠，pH4.8；结晶温度为18℃。
步骤①、②与实施例1相同；③通过真空脂将O圈固定在硅烷化的云母表面，蛋白和沉淀剂溶液按1∶1的比例滴在O圈围成的区域中央，将洁净的新解理的云母片覆盖在液滴表面；④将这一体系翻转覆盖在已经加有上述沉淀剂的晶体板上，并用凡士林将整个结晶体系密封；⑤将结晶板静置在18℃的环境中，每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录。
在4℃保存了10个月的Lysozyme在三种晶体生长方法中生长的晶体对照图片如图2所示A图为利用本发明晶体生长方法生长的晶体，外形漂亮，尺度大而且均匀；B图为利用常规的盖玻片悬滴法生长的晶体，外形较差，大小也不均匀；C图为利用硅烷化云母为基底，按上述CN 1707252文献公开的方法生长的晶体，外形很差。
可见，通过对Lysozyme蛋白和人类造血干细胞中的蛋白质LA0415的晶体生长进行对比实验发现用本发明方法生长的蛋白质晶体，在晶体外形和尺寸方面都有明显改善。
上述实施例中所用的云母为购自四川雅安云母公司的白云母；溶菌酶蛋白购自Sigma公司；蛋白质LA0415来自北京生物物理研究所。其它试剂均为常规试剂。
权利要求
1.一种采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法，其包括下列步骤①将蛋白及其沉淀剂溶液滴在硅烷化的云母表面，在液滴上面覆盖新解理的裸云母片，在覆盖之前先在两云母片之间设置隔离装置；②将步骤①得到的体系翻转覆盖在按常规加有沉淀剂的晶体板上，从而使该裸云母成为蛋白质晶体生长的基底。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①中所述隔离装置为一O型圈或至少两根杆状物，其固定在液滴周围或两侧的硅烷化的云母或裸云母表面上。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于该杆状物为毛细管。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述固定为黏附固定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述黏附固定可采用凡士林、真空脂或粘胶来固定。
6.一种培养蛋白质晶体的方法，其包括如权利要求1～5任一项所述的采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法；然后在该基底上按常规方法进行蛋白质晶体生长。
全文摘要
本发明公开了一种采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的方法，其包括下列步骤将蛋白及其沉淀剂溶液滴在硅烷化的云母表面，在液滴上面覆盖新解理的裸云母片，在覆盖之前先在两云母片之间设置隔离装置；再将得到的体系翻转覆盖在按常规加有沉淀剂的晶体板上。本发明还公开了采用裸云母作为蛋白质晶体生长基底的培养蛋白质晶体的方法，其不仅可以有效地控制晶体生长过程中的晶核数量，而且可以明显地改善晶体质量。
文档编号C07K17/14GK101050231SQ20061002554
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月7日 优先权日2006年4月7日
发明者唐琳, 孙丽华, 徐春艳, 胡钧, 何建华 申请人:中国科学院上海应用物理研究所