专利名称：杀虫晶体蛋白BT-Cry1Ab/1Ac快速检测试条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测转基因蛋白，特别是BT-Cry1Ab/1Ac的检测技术及检测条，属于生物工程技术领域。
背景技术：
Bt(Bacillus thuringiensis)即苏芸金芽孢杆菌的简称，Bt杀虫剂是利用Bt杀虫菌，经培养生产的一种微生物制剂。这种杀虫菌，在生长发育过程中产生芽孢并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的结晶，叫做伴孢晶体。当害虫蚕食了伴孢晶体或芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，然后被蛋白酶酶解，释放出对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等幼虫有较强毒杀作用的毒性分子片段，于消化道上皮细胞表面特异受体结合，诱导细胞膜上形成微小孔道，致使胞内离子外流，胞外水分进入细胞，最终细胞肿胀裂解，昆虫停止进食而死亡。Bt杀虫晶体蛋白的选择杀虫特性是由昆虫消化道上皮细胞表面的特异性受体决定的。根据晶体蛋白一级结构以及敏感昆虫的范围可以将目前分离得到的晶体蛋白分为5类13个亚类。以cry(crystal protein)命名。其中cry I的亚类最多。各类之间氨基酸序列同源性为20％-30％，亚类间同源性为50％以上(cryIV除外)。cry I是研究的最多的一类Bt杀虫晶体蛋白，目前常见的转Bt基因是cry IA(b)、(c)，cry9c。BT晶体蛋白具有高特异的杀虫活性，是近年来应用最为广泛的生物杀虫剂。BT晶体蛋白基因也成为转基因研究中重要的外源基因。
转Bt植物的检测方法主要有三种(1)生物试法；(2)DNA检测；(3)蛋白的免疫检测。在这三种方法中，生物测试法用昆虫进行实验，需要统一虫源、虫龄，统一取样部位，统一饲养条件，试验占用空间大，所需时间长，不能对大量样本进行测定，测定结果变异大，且难以进行横向和纵向的比较，现在很少采用；DNA检测只是检测基因，并不代表蛋白水平，对于抗性的高低并无指导意义，而且方法复杂，步骤繁琐，假阳性高，不适合对大量样本进行检测和现场检测；免疫检测方法采用高度特异性的抗体抗原反应，实现对转基因植物样本中BT-Cry1Ab和BT-Cry1Ac的快速检测，该方法方便、实用、快速、经济，是目前转基因BT-Cry1Ab/1Ac蛋白检测的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测转基因蛋白，特别是BT-Cry1Ab/1Ac的快速、特异、敏感、方便的定性或半定量分析检测技术及检测试条，一步检测植物样品中是否含BT-Cry1Ab或BT-Cry1Ac基因，用于转基因产品的研制开发，或是转基因产品的安全性评价。
本发明的技术方案是(1)氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小(径在1-150nm)的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金，属于多相不均一体系，颜色呈桔红色到紫红色。颗粒颜色不同是由直径大小不同引起的。(2)胶体金标记，实质上是蛋白质(抗体)大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，属于物理吸附。(3)胶体金标记抗体通过高度特异的抗原抗体反应(双抗体夹心法抗体—抗原—抗体)，实现对转基因产物的特异检测。(4)来自一种抗原决定簇的单抗或多抗包被于反应膜上作为检查带，来自另一种抗原决定簇的单抗标记上胶体金作为显色剂，以抗原(转基因BT-Cry1Ab1/Ac)为中间偶联体，将分散状态下太小肉眼无法观察到的胶体金颗粒通过免疫反应聚集在反应膜上，使胶体金颜色被放大肉眼能够观察到。胶体金的这种显色方式为物理显色，无需底物参与反应，方法简单直观。
本发明技术方案的核心是高度完善的膜反应体系，可提供实现液体样本平行移动及完成免疫亲和层析的特异反应所须的各种条件。(1)BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试剂盒系统使用高分子纤维膜作为固相载体。该膜具有很强的蛋白吸附功能，BT-Cry1Ab/1Ac抗体包被于膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应抗原-胶体金标记抗体复合物快速结合。(2)在湿润状态下，液相中的抗原-胶体金标记抗体复合物可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相膜上的特异抗体结合，形成特异的金标记抗体—抗原—抗体红色沉积线。
作为BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试剂盒系统主体的膜反应体系由以下部分组成M1高蛋白亲和性的高分子纤维素膜，经预处理后制备为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果。
M2a，M2b M3样本垫，选用有较强吸水能力的高分子纤维素膜，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸取样本。
M4胶体金垫，吸附力较强的高分子纤维素膜，作为胶体金标记抗体的固相载体。
M5吸水垫，吸收检测后的样本。
M6塑料基板，作为反应体系的支撑物。
M7不同规格的双面和单面胶带，用于固定各反应膜和吸水材料于M6上。
M8透明保护胶带，固定和保护样本垫和胶体金垫M9彩色标志胶带，作为该检测试条的特征标识。
本发明还包括将反应膜M1分为质控区和检测区。在质控区包被羊抗鼠IgG形成质控对照线(C)，在检测区包被BT-Cry 1Ab/1A单抗或多克隆抗体形成反应检测线(T)。 本发明的预期反应状况及结果·阴性(-)出现一条紫红色条带。位于质控区(C)内。如样本中不含特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过程中不会与固定在膜上检测带内的抗体反应，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测带。无论BT-Cry1Ab/1Ac蛋白是否存在于植物样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。阴性结果表明待检样品中不含BT-Cry1Ab/1Ac蛋白或其含量在其阈值以下。
·阳性(+)质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红色条带。如果待植物样品中BT-Cry1Ab/1Ac蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上的另一抗体结合，因此在测试区内(T)出现紫红色检测带。阳性结果表明特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白含量在阈值以上。
·无效质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。
图1是膜反应体系M1的制备图2是BT-Cry1Ab/1Ae快速检测试条的结构示意3是BT-Cry1Ab/1Ac快速检测试条的俯视结构示意4是BT-Cry1Ab/1Ac快速检测试条检测反应结果示意图
具体实施例方式本发明的目的可以通过以下措施来达到1.BT-Cry1Ab/Ae单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。1周后，将Cry 1Ab/Ac单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。
2.BT-Cry1Ab/Ac单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及Sephacryl S 300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水→3000rpm离心15分钟→上清液加50％硫酸铵沉淀，过夜→3000rpm离心20分钟→沉淀溶于0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)→S-300凝胶柱→DEAE Blue层析柱→0-800mM NaCl梯度洗脱→超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95％以上；4)蛋白浓度测定 紫外分光光度计测定279nm处的O.D.值，按以下公式计算蛋白含量OD279/1.4＝mg/ml(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约1mg/ml；5)单抗活性测定选用Cry1Ac抗原包被ELISA板(1μg/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于1∶5000)。
3.羊抗鼠IgG高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂→免疫山羊→加强免疫二次，每次间隔一月→第二次加强后10天左右取血→离心取血清→硫酸铵沉淀→DEAE离子交换层析纯化；
2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1∶256；3)蛋白浓度测定紫外分光法测定OD279，计算蛋白浓度。
4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0.01％HauCl4加热至沸，加入一定量的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由兰→紫→红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入0.02％NaN3。
2)将胶体金液500ml用0.1M NaOH调pH8.4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2ml，搅拌20分钟。5500rpm离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4℃保存。
5.膜反应体系M1的制备1)将Cry 1Ab/Ac抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约0.2-2mg/ml。
2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2.0mg/ml；3)硝酸纤维素膜大小10cm×27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；5)设置喷速为2μl/cm，NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗Cry AD6(2mg/ml)在NC膜上包被反应检测线(图1a)，以1.0mg/ml兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离为4-4.5mm(图1b)；6)完成包被后，置37℃干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗一次；7)37℃干燥箱干燥备用；8)切制备好的硝酸纤维素膜1.8cm×27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置室温保存备用。
6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，室温保存。
1)M2a制备将制好的玻璃纤维切27cm×1.2cm/条；2)M2b制备将制好的玻璃纤维切27cm×1.8cm/条；
3)M3制备将制好的玻璃纤维切27cm×1.2cm/条。
7.膜反应体系M4的制备1)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混匀配成工作浓度；2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s；4)喷制规格为0.5-1.5cm×25cm/条，每条喷2遍；5)于37℃烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。
8.反应体组装(如图2，图3)1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7二条；2)在M7中间贴反应膜M1(18mm)，离M6上缘约22mm；3)在M7上贴M5(22mm)，与M6上缘对齐并与M1上缘交1mm；4)在M7上贴M2a(12mm)，与M1下缘相接；5)在M2上贴M4(10mm)，压住M1下缘0.5mm；6)在M7上贴M3(12mm)，上缘压住M4约2/3；7)在M7上贴M2b(18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住M1约1.5mm；9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与M1上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被面；10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3.5mm规格。
9.检测样本处理及准备植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以SEB4样本缓冲液抽提和稀释。为获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混匀，静置，取上清液作为检测样品。
10.检测及结果检测将检测条样品端垂直向下，插入准备好的样品液中，(样品端浸没入样品液的深度约为0.5cm)，吸水材料使待检样品缓慢上移，膜反应体系被启动。无论BT-Cry1Ab/1Ac蛋白是否存在于植物样品中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
结果判定1)如样本中不含特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会出现一条紫红色检测带，显示阴性(-)结果，即仅在质控区(C)内出现一条紫红色条带(如图4a)。阴性结果表明待检样品中不含BT-Cry1Ab/1Ac蛋白或其含量在其阈值以下。
2)如果待植物样品中BT-Cry1Ab/1Ac蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上的另一单抗结合，在测试区内(T)将还出现另一紫红色检测带，显示阳性(+)结果，即仅在质控区(C)和检测区内各出现一条紫红色条带(如图4b)。阳性结果表明特定BT-Cry1Ab/1Ac蛋白含量在阈值以上。注意测试区(T)内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性结果。
3)如质控区(C)未出现紫红色条带(如图4c)，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。
本发明所述BT-Cry1Ab/1Ac检测试条的优点在于1)特异性强BT-Cry1Ab/1Ac的检测试条以高特异性BT-Cry1Ab/1Ac抗体制备，与其他非目的蛋白的交叉反应很低。
2)敏感性高BT-Cry1Ab/1Ac的检测试条选用和力的BT-Cry1Ab/1Ac单抗标记胶体金，胶体金与抗体间无共价键形成，因而对抗体的特异性和亲和力影响很小，检测灵敏度可达0.5ng/ml。
3)操作简便BT-Cry1Ab/1Ac的检测试条的使用不需其他辅助设备。直接将试条查如待检样本，然后取出平放即可。
4)检测结果形象、准确、快速检测结果可在5分钟内肉眼直接判定。两条棕红色条带为阳性，一条棕红色条带为阴性。
权利要求
1.一种杀虫晶体蛋白(BT-Cry 1Ab和Cry 1Ac)的快速检测试条，其特征在于检测系统主体为膜反应体系，可对转基因植物(但不限于转基因植物)中的转基因杀虫晶体蛋白(BT-Cry 1Ab和Cry 1Ac)进行快速定性或半定量测定。
2.根据权利要求1所述的Bt为Bacillus thuringiensis，即苏芸金芽孢杆菌的简称；Cry为晶体蛋白(crystal protein)的简称；Cry 1Ab和Cry 1Ac为苏芸金芽孢杆菌基因编码的两种常见的杀虫晶体蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测系统主体膜反应体系由以下部分组成M1高蛋白亲和性的高分子纤维素膜，经预处理后制备为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果；M2a，M2b为样本垫的组成部分，选用有较强吸水能力的纤维性膜，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸取待检测样本；M3为样本垫的另一组成部分，吸水玻璃纤维，加速吸取待检测样本；M4胶体金垫，选用吸附力较强的纤维性薄膜，吸附胶体金标记抗体并作为其固相载体；M5吸水垫，吸收检测后的样本；M6塑料基板，作为反应体系的支撑物；M7不同规格的双面和单面胶带，用于固定各反应膜和吸水材料于M6上；M8透明保护胶带，固定和保护样本垫和胶体金垫；M9彩色标志胶带，作为该检测试条的特征标识；
4.根据权利要求3所述的高分子纤维素膜M1可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等高分子膜。经预处理后制备为反应膜，反应膜分为两个区域样品检测区和质控区。
5.根据权利要求3所述的样本垫M2a、M2b、M3为玻璃纤维或其他吸水性强的纤维性薄膜。
6.根据权利要求3所述的胶体金标记抗体载体膜M4可为玻璃纤维或其他纤维性薄膜，在载体膜上喷涂胶体金-抗体复合物。
7.根据权利要求3所述的反应体系的支撑板M6为塑料薄板，或其他疏水性薄板。
8.根据权利要求4所述的反应膜，在质控区包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体；在样品检测区包被特异功能性BT-Cry 1Ab/1Ac单克隆抗体或多克隆抗体。
9.根据权利要求6所述的胶体金系氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，聚合成一定大小(直径在1-150nm)的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，称胶体金，属于多相不均一体系，颜色呈桔红色到紫红色，为反应提供肉眼可检测的信号。
10.根据权利要求6所述的胶体金标记抗体为BT-Cry 1Ab/1Ac单克隆抗体。
全文摘要
杀虫晶体蛋白BT－Cry1Ab/1Ac快速检测试条。本发明属生物工程技术领域。本发明利用平行移动免疫亲和层析一步法，及单克隆抗体和胶体金标记技术，快速检测样本中BT－Cry1Ab/1Ac蛋白的特异性检测试条。为判定待检测样本是否含转基因植物样本(转Bt－Cry蛋白基因)提供直接证据。检测结果可为植物种子的质量评定提供依据，同时适用于边防、海关植物检验、食品安全检测等部门对可疑样本现场、快速筛查。检测试条包括高蛋白亲和性的纤维素膜作为系统反应的载体和显示反应结果，样本垫吸取待检测样本并为反应系统提供适合的反应条件，胶体金垫为胶体金标记抗体的固相载体，吸水垫吸收检测后的样本，塑料基板作为反应体系的支撑板，不同规格的双面和单面胶带用于固定各反应膜和吸水材料于支撑板上，透明保护胶带用于固定和保护样本垫和胶体金垫，彩色标志胶带作为该检测试条的特征标识。
文档编号G01N33/68GK1525173SQ03117358
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月27日 优先权日2003年2月27日
发明者郑建, 黄爱龙, 林敏 , 郑 建 申请人:重庆金标生物技术有限公司