一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法
【专利摘要】本发明公开了一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程【技术领域】。本发明提供的阿魏酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，分子量为112KDa，晶体结构由8个不对称单体组成，其中单体A（1）和单体H（8）组成二聚体、单体B（2）与单体F（6）组成二聚体、单体C（3）和单体E（5）组成二聚体、单体D（4）与其不对称伴侣组成二聚体、单体G（7）与其不对称伴侣组成二聚体，晶胞参数为本发明所提供的阿魏酸脱羧酶的结构信息可用于提高苯乙烯产量、提高酶活性、改变底物特异性、提高酶pH和热稳定性、构建阿魏酸脱羧酶突变体库、生产反式肉桂酸相似体、去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积累等方面。
【专利说明】一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]现今，每年大约有10%的化石燃料被用于生产诸如塑料，橡胶和树脂等材料。由于大约70年前塑料的发明，使这些“万能的”材料已经被用于现代生活的各个方面。然而，由于化石燃料的不可再生性以及人们对二氧化碳积累所带来的环境问题关注度的提高，寻找能够替代诸如石油，天然气和煤炭等化石燃料的可再生能源变得越来越重要。本领域的研究直接关系着经济竞争力和国家安全。发展制备这些聚合物的新技术是目前世界学术研究和工业应用的当务之急。[0003]苯乙烯是多聚物生产中产量最大和最重要的石油化学品和多聚物单体之一。现在，每年苯乙烯的产量在三千万吨以上。苯乙烯单体可以转化成聚苯乙烯(PS)，苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)，丙烯腈丁二烯苯乙烯塑料(ABS)，苯乙烯-丙烯腈树脂(SAN)。另外，苯乙烯还被广泛地用于油漆，燃料和合成药剂复合物。据估计，大约有1.3%的石油和天然气被直接或间接用于生产苯乙烯和苯乙烯衍生物。目前，农产品，尤其是农产品的副产物是最广泛的可再生生物材料的来源。因此，利用农产品副产物生产苯乙烯以及一个有效的生物合成方法具有重要的经济价值。
[0004]现有技术将过量表达苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL，来自拟南芥)和FDC (来自酿酒酵母)基因导入过量生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌宿主菌，从而实现苯乙烯的生产。阿魏酸脱羧酶可以催化反式肉桂酸生成苯乙烯。
[0005]酶的晶体结构通常被用于解释酶的催化机理以及酶活性与催化位点的关系。目前为止，只有报道了一种来自肠杆菌属(Enterobacter sp.)的FDC晶体结构(Gu et al., “Structural basis of enzymatic activity for the ferulic aciddecarboxylase (FADase) from Enterobacter sp.Px6_4,，，PLoSOne, 2011，6: el6262).)。然而，Enterobacter sp.Px6_4FDC的氨基酸序列(168个氨基酸残基)与酵母FDC (503个氨基酸残基)只有19.0%的同源性，并且序列较短。因此，来自肠杆菌属的FDC的结构与来自于酵母的FDC不具有可比性，并且不能用于鉴定酵母来源FDC的底物连接残基。
[0006]因此，为了研究苯乙烯的生物合成，FDC晶体结构的获取是不可或缺的。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种阿魏酸脱羧酶的晶体结构，采用技术方案如下:
[0008]所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为:单体A (I)、单体B
(2)、单体C (3)、单体D (4)、单体E (5)、单体F (6)、单体G (7)和单体H (8);含有一个3-羟基肉桂酸配体；
[0009]晶体结构参数为:
[0010]空间群C121;[0011 ] 晶胞参数(A):
[0012]
a= 251.%Α
[0013]
b= 121.00Α
[0014]
c=159.56A?
[0015]所述阿魏酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为:单体A (I)、单体B (2)、单体C (3)、单体D (4)、单体E
(5)、单体F (6)、单体G (7)和单体H (8);含有一个3-羟基肉桂酸配体；
[0016]晶体结构参数为:
[0017]空间群C121;
[0018]晶胞参数(A):
[0019]
a=251.96A
[0020]
b= 121.0OA
[0021]
c=159.56A。
[0022]所述阿魏酸脱羧酶分子量为112KDa。
[0023]所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中单体A (I)和单体H (8)组成二聚体、单体B (2)与单体F (6)组成二聚体、单体C (3)和单体E (5)组成二聚体、单体D (4)与其非对称伴侣组成二聚体、单体G (7)与其不对称伴侣组成二聚体。
[0024]所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中，单体B (2)和单体F (6)组成的二聚体是通过两个α -螺旋中的氨基酸残基的相互作用来维持，通过盐桥和疏水相互作用调节结构。
[0025]所述单体的多肽链折叠成一个三结构域结构，N端部分的结构是由两个结构域构成，C端是由一个侧面的α-螺旋结构组成；Ν端结构是由四个绳状结构，三个螺旋和一个310-螺旋组成，中间结构域主要由结构元素构成，包含7个β-折叠，8个反平行β-折叠，C端结构域与中间结构域相连，其核心包含5个β -折叠及两侧面的两个α -螺旋构成。
[0026]所述晶体的空间群C I 2 I的参数为:a=249A-252A； b=120A-12lA； c=i58A-160A。本发明还提供了一种阿魏酸脱羧酶晶体结构的解析方法，是通过冷冻液氮从培养液中结晶出单一晶体，利用X射线源获取的晶体数据。
[0027]所述方法的具体步骤如下:
[0028]I)从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据；
[0029]2)晶体结构可借助于基于类似芳香酸脱羧酶结构的相位器和1-TASSER模型利用分子替代法定向；[0030]3)根据Matthew参数，一个不对称单位中含有八个单体，相位器中的溶液的最高LLG为497.9，最高TFZ % 28.7, Rcryst为55.9% ;利用Phenix和COOT软件对结构数据进行修正，获得Rcryst因子达到36.3%，Rfree因子达到46.4%的模型；
[0031]4)初始相关模型单体可用于获得MR的第二数据集合，同时，在不对称单位中发现八个蛋白质单体，初始模型可以根据步骤3)所述方法进行数据修正，结构模型可以通过TLSMotion Determination Server分析，再利用eight TLS groups进行数据细化，获得一个Rcryst因子为17.4%, Rfree因子为23.0%的模型，利用CCP4程序SFCHECK和PR0CHECK对最终模型进行检查。
[0032]本发明的有益效果:
[0033]本发明能够用于提高苯乙烯产量，提高酶活性，改变底物特异性，提高稳定性(pH和热稳定性)，构建FDC突变体库，生产反式肉桂酸相似体，去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积累。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为FDC不对称结构的连续剖面图。
[0035]图2为FDC生物活性二聚体结构的示意图。
[0036]图3为FDC单体结构的示意图。
[0037]图4为FDC四级结构的示意图。
[0038]图5为I σ水平上的电子密度地图的示意图。
`[0039]图6为一个表征FDC单体静电电势四级表面结构的示意图。
[0040]图7为带有3-羟基肉桂酸的FDC四级表面结构的示意图和活性位点的封闭视图。
[0041]图8为苯乙烯生物合成的代谢途径和HPLC检测。
[0042]图9为不同反应条件和反应时间下不同来源的酶促反应能得到的苯乙烯产量。【具体实施方式】
[0043]本发明主要涉及FDC的晶体结构及其解析方法。一方面，本发明在分子水平的基础上进一步解析了 FDC的晶体结构。晶体结构及其衍生出的信息适用于设计和鉴定新底物，适用于设计具有高稳定性和底物特性的突变酶，适用于设计具有高催化活性的酶。本发明可用于诸如，改善苯乙烯产量，提高酶活性，改变底物特异性，提高稳定性(pH和热稳定性)，构建FDC突变体库，生产反式肉桂酸相似体，去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积累。
[0044]另一方面，本发明提供了解析FDC晶体结构的方法。通过该方法成功获得了阿魏酸脱羧酶晶体结构。
[0045]所述的晶体是含有一个配体的FDC的晶体结构。配体可以包括任何与FDC酶相连的分子。因此,配体可以包括但也不限于FDC酶的底物。
[0046]所述的晶体结构信息可以通过X-射线衍射数据，并对数据进行分析处理后获得。晶体结构可以通过假定芳香酸脱羧酶结构逐步定向(see, e.g.，Jacewicz etal., “Structural insights into the UbiD protein family from the crystalstructure of PA0254from Pseudomonas aeruginosa, 2013, PloS One.9: e63161，，)。[0047]本发明公布的FDC晶体结构信息可用于解释基于构效关系的FDC催化机制。本发明可以用于设计和/或修改roc以提高酶的催化活性，提高稳定性以及调节底物特异性。
[0048]下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0049]实施例1阿魏酸脱羧酶的结构测定
[0050]在100K下直接冷冻蒸汽流动的液态N2，可以从带有母液中可以直接获得两个单一晶体，利用Argonne美国国家实验室的配有CXD探测器(ADSCQUANTUM315r)的X射线源191Dbeamline可以直接获得在412.87mm和378.90mm下的晶体数据。在0.979,4.，0.3。和
1.0°振幅指示(P1211and C121)和用HKL3000 (Minor et al.，2006)测量可获得晶体图片(600frames和180frames)。表1列出了归纳获得的单位小室晶体的参数和数据细化统计信息。本例的 FDC 来自酵母菌 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC204508/S288c)0
[0051]初始FDC (P121, 2.62A)结构可借助于基于假定芳香酸脱羧酶(PDB:4IWS)结构(Jacewicz et al., “Structural insights into the UbiD protein familyfrom the crystal structure of PA0254from Pseudomonas aeruginosa,，，2013，PLoSOne.9: e63161)的相位器(McCoy et al.，2007，“Phaser crystallographic software, ^J.Appl.Cryst.,2007,40:658-674)和 1-TASSER 模型(Zhang, “1-TASSER serverfor protein3D structure prediction,，，BMC Bioinformatics, 2008, 9:40 ; Roy etal., u1-TASSER:a unified platform for automated protein structure and functionprediction, ”Nature Protocols, 2010, 5:725-738)利用分子替代法(MR)定向。
[0052]根据Matthe w参数，四个蛋白质单体预测处在不对称单位中。相位器中的溶液的最高 LLG 为 497.9，最高 TFZ 为 28.7，Rcryst 为 55.9%。利用 Phenix 软件(Adams etal., “PHENIX:a comprehensive Python-based system for macromolecular structuresolution, ” Acta Crystallog.Biol.D., 2010, 66:213-221)进行数据细化，根据 Rfree算法(Briinger et al., “Crystallography&NMR system:A new software suite formacromo I ecu Iar structure determination,，，Acta Crystallog.Biol.Crystallog.D, 1998, 54:905-921)排除10%数据。模拟退火和对原始方案B因子的细化会产生一个在48.8-2.7A范围内，Rcryst达到36.3%，Rfree达到46.4%的模型。在这一阶段，可采用COOT (Emsley et al., “Coot:model_building tools for molecular graphics,，，ActaCrystallog.Biol.Crystallog.D, 2004，60:2126-2132)进行人工拟合。
[0053]初始roc模型单体可用于获得MR的第二数据集合(C121and 235 A )，同时，在不对称单位中发现八个蛋白质单体。初始模型(top LLG of35680，top TFZ of21.5andan Rcryst of 40.5%)可以根据上述方法进行细化。结构模型可以通过TLS MotionDetermination Server (Painter et al.，“Optimal description of a proteinstructure in terms of multiple groups undergoing TLS motion, ”Acta Crystallog.Biol.Crystallog.D，2006，62:439-450)进行分析，利用 eight TLS groups 进行细化，获得一个Rcrystl7.4%，Rfree23.0%的模型。最终模型可以利用CCP4程序SFCHECK和PR0CHECK(Collaborative Computational Project, 1994;Vaguine et al., uSFCHECK:a unifiedset of procedures for evaluating the quality of macromoIecuIar structure-factordata and their agreement with the atomic model，，，Acta Crystal log.Biol.Crystallog.D, 1999, 55:191-205;Laskowsky et al., “Main-chain bond lengths andbond angles in protein structures,，，J.Mol.Biol.1993，231:1049-1067)进行分析。表I中列出了数据收集和结构修正参数。
[0054]表1.酿酒酵母FDC晶体结构的数据统计
[0055]
【权利要求】
1.一种阿魏酸脱羧酶的晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为:单体A (I)、单体B (2)、单体C (3)、单体D (4)、单体E (5)、单体F(6)、单体G (7)和单体H (8);含有一个3-羟基肉桂酸配体； 晶体结构参数为: 空间群C121 ； 晶胞参数(A):
a=251.96A
b= 121.0O A
c=159.56A?
2.权利要求1所述晶体结构，其特征在于，氨基酸序列如SEQID N0.1所示，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为:单体A (I)、单体B (2)、单体C (3)、单体D (4)、单体E (5)、单体F (6)、单体G (7)和单体H (8);含有一个3-羟基肉桂酸配体； 晶体结构参数为: 空间群C121 ； 晶胞参数(A
a=251.96A
b= 121.0OA
c=159.56A,
3.权利要求2所述晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶分子量为112KDa。
4.权利要求2所述晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中单体A(I)和单体H (8)组成二聚体、单体B (2)与单体F (6)组成二聚体、单体C (3)和单体E (5)组成二聚体、单体D (4)与其不对称伴侣组成二聚体、单体G (7)与其不对称伴侣组成二聚体。
5.权利要求2所述晶体结构，其特征在于，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中，单体B(2)和单体F (6)组成的二聚体是通过两个α -螺旋中的氨基酸残基的相互作用来维持，通过盐桥和疏水相互作用调节结构。
6.权利要求2所述晶体结构，其特征在于，所述单体的多肽链折叠成一个三结构域结构，N端部分的结构是由两个结构域构成，C端是由一个侧面的α-螺旋结构组成；Ν端结构是由四个绳状结构，三个螺旋和一个310-螺旋组成，中间结构域主要由β_结构元素构成，包含7个β-折叠，8个反平行β-折叠，C端结构域与中间结构域相连，其核心包含5个β-折叠及两侧面的两个α_螺旋构成。
7.权利要求2所述晶体结构，其特征在于，所述晶体的空间群C121的参数为:a=249A-252.A；b=120A-12lA； c=158A-160A?
8.权利要求1所述晶体结构的解析方法，其特征在于，是利用冷冻液氮从培养液中结晶出单一晶体，通过X射线源获取的晶体数据。
9.权利要求8所述方法，其特征在于，具体步骤如下: I)从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据；2)晶体结构可借助于基于类似芳香酸脱羧酶结构的相位器和1-TASSER模型利用分子替代法定向； 3)根据Matthew参数，一个不对称单位中含有八个单体，相位器中的溶液的最高LLG为`497.9，最高TFZ为28.7，Rcryst为55.9% ;利用Phenix和COOT软件对结构数据进行修正，获得Rcryst因子达到36.3%，Rfree因子达到46.4%的模型； 4)初始相关模型单体可用于获得MR的第二数据集合，同时，在不对称单位中发现八个蛋白质单体，初始模型可以根据步骤3)所述方法进行数据修正，结构模型可以通过TLSMotion Determination Server分析，再利用eight TLS groups进行数据细化，获得一个Rcryst因子为17.4%, Rfree因子为23.0%的模型，利用CCP4程序SFCHECK和PR0CHECK对最终模型进行检查。
【文档编号】C12N9/88GK103865912SQ201410062028
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】余晓丹 申请人:无锡新和源发酵技术研究院有限公司