专利名称：：鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：结核病(Tuberculosis)是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一，本世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势，据世界卫生组织报道，我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5%，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全球人口感染率为l/3的水平。同时，非结核分枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势，2000年卫生部组织的流调数据显示，NTM菌株分离率上升至11.1%，NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。大量研究以及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对NTM病很少或没有疗效，传统的菌种鉴定和药敏试验方法烦琐、费时，延误病人的治疗。因此，结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌区分检测对结核病的早期诊断、鉴别诊断、个体化的有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的区分目前仍然依靠传统的分离培养的方法，通常需要1-4周的时间才能得到确切的结果，这样大大的延误了病人的治疗，给病人造成额外的经济负担和精神负担。
发明内容本发明的目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括进行PCR扩增的引物和探针，其中，所述引物包括4条引物，分别为引物l、2、3和4，所述引物1和引物2能与结核分枝杆菌的特异片段结合，所述引物3和引物4能与分枝杆菌特异片段结合；所述探针包括2条，分别为探针1和探针2，所述探针l能与结核分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物1和引物2与结核分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针2能与分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物3和引物4与分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针1和所述探针2的5'端带都有荧光物质，3'端都带有淬灭物质，所述探针l和所述探针2的5'端的荧光物质不同。所述结核分枝杆菌的特异片段可选自如下IS6110、16s、IS986、MTP40、38kDa、IS1081和ESAT-6。所述分枝杆菌特异片段可选自如下16s、dnaj基因、编码65kDa蛋白的核苷酸序列、编码38kDa蛋白的核苷酸序列和编码32kDa蛋白的核苷酸序列。所述引物1的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述引物2的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述引物3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述引物4的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5;所述探针1的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3，所述探针2的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6。所述引物1的核苷酸序列还可为序列表中的序列7，所述引物2的核苷酸序列还可为序列表中的序列8，所述引物3的核苷酸序列还可为序列表中的序列10，所述引物4的核苷酸序列还可为序列表中的序列11;所述探针1的核苷酸序列还可为序列表中的序列9，所述探针2的核苷酸序列还可为序列表中的序列12。所述荧光物质为FAM、HEX、TET、TAMRA、VIC、CY5、TexasRed或JOE。所述淬灭物质为TAMRA、Dabcyl或Eclipse。所述探针合成时，荧光物质和淬灭物质被标记在探针的末端，所用荧光物质和淬灭物质可进行选择，能提供合成服务的公司有宝生物工程有限公司、上海生工生物工程技术服务有限公司、上海基康生物技术有限公司、ABI公司等。本发明的另一个目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤用所述的试剂盒中的引物和探针对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果能检测到探针1的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果不能检测到探针l的荧光信号，而能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。所述非结核分枝杆菌为如下表1所示。表1.非结核分枝杆菌<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Mycobacteriumadamsoni亚当斯氏分枝杆菌Mycobacteriumadamsoni亚氏分枝杆菌Mycobacteriumafricanum非洲分枝杆菌Mycobacteriumagreste乡村分枝杆菌Mycobacteriumagri田野分枝杆菌Mycobacteriumagri土地分枝杆菌Mycobacteriumaichiense爱知分枝杆菌Mycobacteriumalbum白色分枝杆菌Mycobacteriumalvei蜂房分枝杆菌Mycobacteriumammethystinum紫晶分枝杆菌Mycobacteriumanabanti攀登分枝杆菌Mycobacteriumanaerobium厌氧分枝杆菌Mycobacteriumaquae水分枝杆菌Mycobacteriumasiaticum亚细亚分枝杆菌Mycobacteriumasiaticum亚洲分枝杆菌Mycobacteriumasteroids星状分枝杆菌Mycobacteriumaurum金色分枝杆菌Mycobacteriumaustroafricanum南非分枝杆菌Mycobacteriumavium鸟分枝杆菌Mycobacteriumaviumsubsp.avium鸟分枝杆菌鸟亚种Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis鸟分枝杆菌副结核亚种Mycobacteriumaviumsubsp.silvaticum鸟分枝杆菌森林土壤亚种Mycobacteriumaviumsubsp.suis鸟分枝杆菌猪亚种Mycobacteriumbalnei巴尔内氏分枝杆菌Mycobacteriumbalnei巴氏分枝杆菌Mycobacteriumberolinensis柏林分枝杆菌Mycobacteriumbifidum两形分枝杆菌Mycobacteriumblattelae蟑螂分枝杆菌Mycobacteriumbrevicale短小分枝杆菌Mycobacteriumbrumae冬天分枝杆菌Mycobacteriumbrunense深褐色分枝杆菌Mycobacteriumbutanitrificans生丁硝分枝杆菌Mycobacteriumbutyricum丁酸分枝杆菌Mycobacteriumbutyricum酪酸分枝杆菌Mycobacteriumbutyricum乳酪分枝杆菌Mycobacteriumcaesius青灰分枝杆菌<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Mycobacteriumterrae土分枝杆菌Mycobacteriumtestudinis龟分枝杆菌Mycobacteriumthamnopheos蛇分枝杆菌Mycobacteriumthermoresistible抗热分枝杆菌Mycobacteriumtokaiense东海分枝杆菌Mycobacteriumtomidae托氏分枝杆菌Mycobacteriumtortuosum多曲分枝杆菌Mycobacteriumtriviale次要分枝杆菌Mycobacteriumtriviale通俗分枝杆菌Mycobacteriumtropidonoti赤炼蛇分枝杆菌Mycobacteriumtropidonoti水蛇分枝杆菌Mycobacteriumtumescens肿胀分枝杆菌Mycobacteriumulcerans溃疡分枝杆菌Mycobacteriumulcerogenes产溃疡分枝杆菌Mycobacteriumvaccae母牛分枝杆菌Mycobacteriumvadosum浅滩分枝杆菌Mycobacteriumvalentiae瓦伦西亚分枝杆菌Mycobacteriumviridis绿色分枝杆菌Mycobacteriumxenopi蟾蜍分枝杆菌Mycobacteriumxenopi蟾分枝杆菌使用本发明的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒能快速鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，且对仪器要求简单，费用低，操作简单，在结核病的早期诊断和鉴别诊断方面具有广泛的应用前景。图1为实施例1中结核分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。图2为实施例1中堪萨斯分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。图3为实施例2中结核分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。图4为实施例2中堪萨斯分枝杆菌FAM通道和HEX通道扩增曲线图。具体实施例方式实施例1、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的鉴别鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒由如下部分组成提取核酸的试剂、PCR反应试剂、引物、探针、阳性标本对照和阴性标本对照及说明书。其中的引物为引物P1和P2，引物P3和P4，探针l的5'端带有FAM荧光标记，3'端带有Eclipse荧光淬灭基团。探针2的5'端带有HEX荧光标记，3'端带有Eclipse荧光淬灭基团。引物Pl和P2是针对结核分枝杆菌IS6110序列设计，引物Pl和P2的核苷酸序列如下引物P1:5，-AAGCCCGCAGGACCACGAT-3，(序列表中的序列1);引物P2:5，-CGTAGGCGTCGGTGACAAAGG-3'(序列表中的序列2)。探针l的序列如下-5'-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3'(序列表中的序列3)。弓l物P3和P4是针对分枝杆菌65kDa蛋白的核苷酸序列设计的，弓|物P3和P4的核苷酸序列如下引物P3:5'-AGACCAAGGAGCAGATCGCT-3'(序列表中的序列4);引物P4:5，-CGCATACCCTCGGTGAGCT-3，(序列表中的序列5)。探针2的序列如下5'-TGATGACACCCTCGTTGCCGACC-3，(序列表中的序列6)。以结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸作为模板。结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸(结核PCR检测参考品)购自中国生物制品鉴定所。反应体系如下2XRealtimetaqmanbuffer(博奥公司)10lU，Taq酶0.3ul，引物P1和P2(IOuM)各O.6u1，探针l(10uM)0.8ul;引物P3和P4(10uM)各1.2ul，探针2(10uM)0.8ul;模板2ul，H202.5ul。在ABI7700进行反应检测，程序如下先94°。3min，然后94°C15sec、60。C30sec进行40个循环，荧光信号采集点在60°C30sec。PCR扩增结果如图1和2所示，表明以结核分枝杆菌核酸为模板进行扩增时，FAM通道出现扩增信号；以堪萨斯分枝杆菌(非结核分枝杆菌)核酸为模板进行扩增时，FAM通道没有扩增信号，仅有HEX通道有扩增信号。实施例2、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的鉴别鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒由如下部分组成提取核酸的试剂、PCR反应试剂、引物、探针、阳性标本对照和阴性标本对照及说明书。其中的引物为引物P1和P2，引物P3和P4，探针1的5'端带有FAM荧光标记，3'端带有Eclipse荧光淬灭基团。探针2的5'端带有HEX荧光标记，3'端带有Eclipse荧光淬灭基团。引物Pl和P2是针对结核分枝杆菌MTP40序列设计，引物Pl和P2的核苷酸序列如下引物P1:5，-CAAGTTGGGTCTGGTCGAATTC-3，(序列表中的序列7);引物P2:5，-CACACCTCGCAATTGAAGTTGA-3，(序列表中的序列8)。探针3的序列如下5'-TGAGGTCATGTCGCCAACCACGCC-3'(序列表中的序列9)。引物P3和P4是针对分支杆菌16s序列的核苷酸序列设计的，引物P3和P4的核苷酸序列如下引物P3:5，-GGATTGACGGTAGGTGGAGAAG-3，(序列表中的序列10);引物P4:5，-TTCACGAACAACGCGACAAAC-3，(序列表中的序列11)。探针2的序列如下5'-CCAACTACGTGCCAGCAGCCGC-3'(序列表中的序列12)。以结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸作为模板。结核分枝杆菌的核酸和堪萨斯分枝杆菌的核酸(结核PCR检测参考品)购自中国生物制品鉴定所。反应体系如下2XRealtimetaqmanbuffer(博奧公司)10yl，Taq酶0,3ul，引物P1和P2(10uM)各0.6u1，探针l(10uM)0.8ul;引物P3和P4(10uM)各1.2ul，探针2(10uM)0.8ul;模板2ul，H202.5yl。在ABI7700进行反应检测，程序如下先94。C3min，然后94°C15sec、60。C30sec进行40个循环，荧光信号采集点在6(TC30sec。PCR扩增结果如图3和4所示，表明以结核分枝杆菌核酸为模板进行扩增时，FAM通道出现扩增信号；以对堪萨斯分枝杆菌(非结核分枝杆菌)核酸为模板进行扩增时，FAM通道没有扩增信号，仅有HEX通道有扩增信号。序列表<110〉博奥生物有限公司清华大学〈120>鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒〈130>CGGNARW81966〈160〉12<210>1<211〉19〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉<400>1aagcccgcaggaccacgat19〈210〉2<211>21〈212>DNA〈213〉人工序列<220><223><400>2cgtaggcgtcggtgacaaagg21<210〉3〈211〉24〈212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉3ccacagcccgtcccgccgatctcg24<210〉4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4agaccaaggagcagatcgct20〈210〉5<211〉19<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉<400>5cgcataccctcggtgagct19〈210〉6〈211〉23〈212〉腿<213>人工序列<220><223〉<400〉6tgatgacaccctcgttgccgacc23<210〉7〈211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>7caagttgggtctggtcgaattc22<210>8<211>22〈212>DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉〈400〉8cacacctcgcaattgaagttga22〈210〉9<211>24〈212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉<400〉9tgaggtcatgtcgccaaccacgcc24<210>10〈211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉<400〉10ggattgacggtaggtggagaag22<210〉11<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉<400>11ttcacgaacaacgcgacaaac21<210〉12<211>22〈212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223>〈400〉12ccaactacgtgccagcagccgc2权利要求1、鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括进行PCR扩增的引物和探针，其特征在于所述引物包括4条引物，分别为引物1、2、3和4，所述引物1和引物2能与结核分枝杆菌的特异片段结合，所述引物3和引物4能与分枝杆菌特异片段结合；所述探针包括2条，分别为探针1和探针2，所述探针1能与结核分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物1和引物2与结核分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针2能与分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物3和引物4与分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针1和所述探针2的5’端带都有荧光物质，3’端都带有淬灭物质，所述探针1和所述探针2的5’端的荧光物质不同。2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述结核分枝杆菌的特异片段选自如下IS6110、16s、IS986、MTP40、38kDa、IS1081和ESAT-6。3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述分枝杆菌特异片段选自如下16s、dnaj基因、编码65kDa蛋白的核苷酸序列、编码38kDa蛋白的核苷酸序列和编码32kDa蛋白的核苷酸序列。4、根据权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述引物l的核苷酸序列为序列表中的序列l，所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列2，所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列4，所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列5;所述探针l的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述探针2的核苷酸序列为序列表中的序列6。5、根据权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述引物l的核苷酸序列为序列表中的序列7，所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列8，所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列10，所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列11;所述探针l的核苷酸序列为序列表中的序列9，所述探针2的核苷酸序列为序列表中的序列12。6、根据权利要求4或5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述荧光物质为FAM、HEX、TET、TAMRA、CY3、VIC、CY5、TexasRed或JOE。7、根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述淬灭物质为TAMRA、Dabcyl或Eclipse。8、一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤用权利要求1至7中任一项所述的试剂盒中的引物和探针对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果能检测到探针l的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果不能检测到探针1的荧光信号，而能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。全文摘要本发明公开了一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。本发明的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括引物和探针，其中所述引物包括4条引物，它们的核苷酸序列分别是序列表中序列1、序列2、序列4和序列5；所述探针包括2条，它们的核苷酸序列分别是序列表中序列3和序列6；所述探针的5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质；所述2条探针的5’端的荧光物质不同。本发明的试剂盒能快速鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，且对仪器要求简单，费用低，操作简单，在结核病的早期诊断和鉴别诊断方面具有广泛的应用前景。文档编号C12Q1/68GK101413031SQ20081022788公开日2009年4月22日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者伟侯,王思贤,京程,高华方申请人:博奥生物有限公司;清华大学