专利名称：：一种苹果腐烂病抗性的离体鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及一种苹果腐烂病抗性的离体鉴定方法。
背景技术：
：苹果腐烂病俗称烂皮病，是我国北方苹果树重要病害之一，病原ValsamaliMiyabeetYamada称苹果黑腐皮壳菌，属子囊菌亚门真菌。无性世代为CytosporamandshuricaMiura称苹果干腐烂壳囊孢菌，属半知菌亚门真菌。该病具有潜伏侵染和连续发作等特点，一旦发病，无药可治，造成树势衰弱、枝干枯死、死树，甚至毁园。因此，鉴定苹果腐烂病抗性种质，培育抗性品种，是防治腐烂病的重要举措。目前苹果腐烂病抗性鉴定多用菌丝做侵染源。陈策(陈策.病原菌的分离、人工培养和接种[J].中国果树1978，(5))提出，用菌丝块接种经过烫伤的离体枝条，来鉴定苹果腐烂病抗性，但这种方法未见应用于具体实践。刘捍中等(刘捍中，任庆棉，刘立年.苹果树主要种质资源抗苹果腐烂病性状调查[J].山西果树，1990，(02))用菌丝块接种正在生长的苹果树野生树种，鉴定出12份抗性资源。日本学者(Abe，K.;Kotoda，N.;Kato，H.;Soejima，(2007)ResistancesourcestoValsacanker(Valsaceratosperma)inagermplasmcollectionofdiverseMalusspeciesJPlantBreeding，126，p449_453)用收集制干的菌丝，配成菌丝悬浮液，接种离体枝条，鉴定苹果树野生树种和富士、金冠、红玉等栽培品种的抗病性，获得了四个抗性相对较强的野生资源，而栽培品种之间抗性无明显的差异。由于菌丝含有较多的毒素和降解树皮细胞壁的酶类，这种接种方法致毒力大，发病迅速，难以鉴别苹果品种的抗性。通过苹果黑星病抗性育种和分子标记的实践，大家认识到，鉴定栽培品种的抗性资源及抗性基因，通过育种使基因积聚，是今后抗性育种的重要方向。因此，发展一种合适的抗性鉴定方法，鉴定不同品种的抗性，培育抗性品种，是十分必要的。通过模式植物研究表明，抗病性机制是病原真菌和植物宿主相互作用的结果；分生孢子萌发、侵入所产生的一系列诱导因子是影响植物产生抗性的重要因素(JanA.L.vanKan，(2006)LicensedtokillthelifestyleofanecrotrophicplantpathogenTRENDSinPlantScience.11，247-253)。
发明内容本发明的目的是提供一种苹果腐烂病抗性的离体鉴定方法。本发明所提供的苹腐烂病抗性的离体鉴定方法，包括以下步骤(1)将苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30。C培养6_24小时，得到萌发的分生孢子；(2)用步骤(1)萌发的分生孢子接种离体的树枝，在20-3(TC，相对湿度为60_100%的条件下进行培养，培养5-16天后取出枝条，进行抗性鉴定。所述树枝在接种前还需进行如下处理将树枝洗净晾干，在晾干的树枝上打孔，孔深至木质部，去除树皮；所述孔的直径为4-10mm。其中，步骤(1)中所述苹果腐烂病菌分生孢子在PDA液体培养基中进行培养，所述苹果腐烂病菌分生孢子在PDA液体培养基中的初始浓度可为1X104_1X108CFU/毫升。步骤(1)中所述培养为震荡培养，震荡的转速可为100-300转/分钟。步骤(2)中所述萌发的分生孢子配制成悬浮液进行接种，所述悬浮液中萌发的分生孢子的浓度为1X104_1X108CFU/毫升。本发明所述苹果腐烂病可发生于苹果属(Malus)果树，如苹果、沙果、海棠、香果等。所述树枝具体可为苹果树枝；所述树枝的直径可为0.1-4.0厘米。目前苹果腐烂病抗性鉴定多用菌丝做侵染源，但一方面由于菌丝生长状态不一致，导致鉴定结果可靠性不高；另一方面是有的侵染方法致毒力大，发病迅速，难以鉴别苹果品种的抗性。虽然用苹果腐烂病分生孢子做侵染源是比较理想的接种方式，但由于分生孢子萌发需要营养，而单凭伤口提供的营养难于支持孢子侵染发病，成为使用分生孢子做侵染源的制约因素。本发明鉴定苹果腐烂病抗性的方法是采用经过培养的处于萌发状态的孢子，侵染树枝，不仅符合腐烂病菌侵染的规律，而且致病力适中，发病均匀，可以较好的鉴定苹果品种对腐烂病的抗性。本发明方法的优点在于根据植物抗病性研究进展和腐烂病发病特点，用经过处理的腐烂病菌分生孢子，接种经过处理的离体树枝，进行苹果腐烂病抗性鉴定，具有方便、快速、简单易行、结果可靠等优点。用萌发的分生孢子做侵染源，符合腐烂病菌侵染发病的规律；用离体枝条做试材，有效避免了用生长果树做试材带来的损失和不便；接种的分生孢子数量可控，更能显示苹果品种抗性的差异。图1为苹果腐烂病菌分生孢子器的图片。图2为苹果腐烂病菌萌发的分生孢子的图片。图3为实施例1中未发病与发病枝条的图片，图左为高抗个体26-88的图片，图中为抗性个体22-98的图片，图右为高感个体22-117的图片。具体实施例方式实施例1、金冠和红玉杂交后代的腐烂病抗性鉴定及筛选1、培养基的配置(l)PDA培养基的配制配方去皮马铃薯200g蔗糖(C^H220n，CHG/T3462-1999，北京化工厂)20g琼脂(DH0110-1.l，北京鼎国生物技术有限责任公司)15-20g蒸馏水(GB50172-92):1000ml操作步骤1)将去皮马铃薯秤取200g，切成小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯及其残渣，收集滤液；2)向滤液中分别加入琼脂和蔗糖加热融化，用蒸馏水定容至1000ml;3)将溶液分装到三角烧瓶中，密封，编号；4)将分装好的溶液放到高压蒸汽灭菌锅中，12rC高压蒸汽灭菌20min;5)在无菌条件下，将25ml融化的培养基倒入培养皿中，冷却凝固，编号待用。(2)液体PDA培养基的配制配方去皮马铃薯200g葡萄糖(HG/T3475-1999，北京化学试剂公司)20g蒸馏水(GB50172-92):1000ml操作步骤1)将去皮马铃薯秤取200g，切成小块，放入烧杯中，加水800ml，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯及其残渣，收集滤液；2)向滤液中加入葡萄糖，加热融化，用蒸馏水定容至1000ml;3)将溶液分装到三角烧瓶中，密封，编号；4)将分装好的溶液放到高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-18SI0，北京东南仪诚实验室设备有限公司)中，12rC高压蒸汽灭菌20min，待用。2、苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)ACCC30052分生孢子的培养萌发1)将苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)ACCC30052接种于PDA培养基上，置恒温光照培养箱(HPG-280BX，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)中，26t:光照恒温培养30天；2)将变黑的分生孢子器(见图1)取下，在无菌的条件下，置灭菌的研钵中研碎，加入液体PDA培养基；3)将液体PDA培养基转入45ml离心管中，以1500-3000转/分钟的转速离心5分钟；4)取上清，转入灭菌的三角烧瓶中，取少量悬浮液，用血球计数板(36XL上海宙山精密光学仪器有限公司)在400倍下计数分生孢子浓度，然后用液体PDA培养基将悬浮液中分生孢子的浓度调节至1X106CFU/毫升；5)将悬浮液置26t:恒温振荡培养箱(BS-1EA金坛市杰瑞尔电器有限公司)中，以100-300转/分钟震荡的转速培养12小时，使分生孢子萌发(见图2);6)将经过培养的悬浮液以1500-3000转/分钟离心10分钟，去上清，用蒸馏水重悬分生孢子，将孢子浓度调节至1X106CFU/毫升。3、接种、培养及抗性鉴定1)金冠(统一编号PGB0196)与红玉(统一编号PGB0057)于2003年杂交，获取的种子萌发后定植于育种圃。2008年冬天，选取金冠与红玉杂交的68株实生树，每株树取直径约l厘米的休眠苹果枝条三根，截成20厘米的长度，用水洗净晾干，用打孔器(江都市三联玻璃仪器厂)间隔相等的距离打三个孔，孔的直径为10mm，孔深至木质部，去除树皮，试验设三次重复；2)将40iU浓度为1X106CFU/毫升的孢子悬浮液用移液器加入每个树孔中，待溶液吸收完全后，将枝条用湿毛巾包裹保湿(相对湿度大于60%)，放入瓷盘，在培养箱(HPG-280BX哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)中26t:恒温培养；3)培养七天后取出枝条，测量病斑扩展长度，划分抗性等级；5按接种点病斑扩展情况进行划分高抗未发病；抗发病，但未扩展；中抗扩展系数小于0.25;中感扩展系数小于0.5;感扩展系数小于0.75;高感扩展系数大于或等于0.75或等于1;扩展系数=平均扩展长度/最感个体平均扩展长度；抗性分级结果根据抗病性分级，试验所选用的68株实生树中获得高抗个体4株，抗个体6株，中抗个体18株，感病个体12株，中感个体17株，高感个体11株(见表1)。表l的数据表明，在接种一定量的经过处理的分生孢子后，经7天，金冠和红玉杂交后代腐烂病抗性差别明显，能够较好的区分抗、感个体，为抗性个体筛选、分子标记奠定了基础。本实验重复三次，结果重现性好。图3为实施例中未发病与发病枝条的图片，其中，高抗个体26-88枝条如图3左所示，由图可知高抗个体接种孔周围未出现坏死现象，并长出愈伤组织；抗性个体22-98的枝条如图3中所示，由图可知抗性个体病斑扩展速度较慢，在接种孔周围出现坏死组织，树皮腐烂，坏死组织和未发病部分区别明显；高感个体22-117枝条如图3右所示，由图可知高感个体发病迅速，7天坏死组织即扩展至全枝条，树皮腐烂。且高感个体22-117枝条有明显的酒糟味。表1病斑扩展长度及抗性分级个体号总扩展长度(cm)平均扩展长度(cm)扩展系数抗性分级26—88000高抗25—15000高抗37—56000高抗22—98000高抗42—1140.50.170.01抗45—1090.60.20.01抗40—1230.80.270.02抗6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求苹果腐烂病抗性的离体鉴定方法，包括以下步骤(1)将苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30℃培养6-24小时，得到萌发的分生孢子；(2)用步骤(1)萌发的分生孢子接种离体的树枝，在20-30℃、相对湿度为60-100％的条件下进行培养，培养5-16天后取出枝条，进行抗性鉴定。2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述树枝在接种前进行如下处理将树枝洗净晾干，在晾干的树枝上打孔，孔深至木质部，去除树皮；所述孔的直径为4-10mm。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述苹果腐烂病菌的分生孢子在液体PDA培养基中进行培养，所述苹果腐烂病菌的分生孢子在液体PDA培养基中的初始浓度为1X104-1X108CFU/毫升。4根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述培养为震荡培养，震荡的转速为100-300转/分钟。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述萌发的分生孢子配制成悬浮液进行接种，所述悬浮液中萌发的分生孢子的浓度为1X104-1X108CFU/毫升。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述萌发的分生孢子配制成悬浮液进行接种，所述悬浮液中萌发的分生孢子的浓度为1X104-1X108CFU/毫升。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述树枝为苹果树枝。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述树枝的直径为0.1-4.0厘米。全文摘要本发明公开了一种苹果腐烂病抗性的离体鉴定方法。该方法包括以下步骤(1)将苹果腐烂病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30℃培养6-24小时，得到萌发的分生孢子；(2)用步骤(1)萌发的分生孢子接种离体的树枝，在20-30℃，相对湿度为60-100％的条件下进行培养；培养5-16天后取出枝条，进行抗性鉴定。本发明鉴定苹果腐烂病抗性的方法是根据植物抗病性研究进展和腐烂病发病特点，采用经过培养的处于萌发状态的孢子，侵染树枝，不仅符合腐烂病菌侵染的规律，而且致病力适中，发病均匀，可以较好的鉴定苹果品种对腐烂病的抗性，具有方便、快速、简单易行、结果可靠等优点。文档编号C12Q1/02GK101750478SQ200810227888公开日2010年6月23日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者刘广华,张新忠,韩振海申请人:中国农业大学