专利名称：非抗性筛选dna疫苗载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗载体以及构建的方法。
背景技术：
DNA疫苗自1990年被发现以来在人类医学和动物医学领域已取得很大的进展，作为第三代疫苗，它可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，具有制备相对简单，运输保存容易，可方便构建多价疫苗和加入多种免疫佐剂分子等优点。但限制其应用的一个主要问题是“安全性问题”。目前商品化的DNA疫苗载体中均含有抗生素抗性基因作为选择性标记，而细菌的抗生素耐药性问题日益严重，已成为全球性共同关注的问题，因此DNA疫苗上抗生素抗性基因成为阻碍DNA疫苗发展和大规模应用的一大障碍。
发明内容
本发明目的在于发明一种无选择性的DNA疫苗载体。
本发明具有以下特征载体全长3114bp，其序列为gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960
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另外，本发明还对具有上述特征的DNA疫苗载体提供构建方法，即将扩增的鼠伤寒沙门氏菌asd用pVUII和PagI双酶切；用pVUII和PagI双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后将asd基因与去除卡那霉素抗性基因的载体进行连接。
本发明采用染色体-质粒平衡致死系统代替抗生素抗性基因来作为DNA疫苗扩增的选择性标记，构建新型非抗性筛选DNA疫苗载体，与质粒pVAX1相比，缺失其中的卡那霉素抗性基因，取而代之的是长度为1281bp的鼠伤寒沙门氏菌asd基因，从而避免了抗生素抗性基因的潜在性危险问题。
具体实施例1、鼠伤寒沙门氏菌asd基因的扩增鼠伤寒沙门氏菌YZ1392(本室分离)用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，浓度为109CFU/mL，100℃加热10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液5μL进行PCR扩增反应，采用引物如下正义5’aaacag ctggca cat crc ttt gca gga a 3’反义5’gcctca tgacat ctg cgt tta crc ctg t 3’正义和反义引物分别含pVU II和Pag I酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系为50μL细菌裂解上清5μL10×缓冲液5μL上游引物(50μmol/L)0.5μL下游引物(50μmol/L)0.5μLTaq酶(3U/μL)0.5μL4种dNTP混合物(2.5mmol/L)4μL超纯水35.5μLPCR反应条件为94℃ 40S，57℃ 40S，72℃ 60S，共30个循环，结束后用浓度为0.8％琼脂糖电泳分离，回收长1281bp的asd基因。
2、新DNA疫苗载体的构建回收的asd基因用pVU II和Pag I双酶切，同时用pVU II和Pag I双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后将asd基因与载体进行连接反应，体系如下asd基因(pVU II-Pag I)3μLpVAX1(pVU II-Pag I)1μL连接缓冲液1μLT4 DNA连接酶(1U/μL)1μL超纯水4μL
4℃连接16小时，然后转化asd基因缺失型大肠杆菌X6212，涂布LB平板，37℃培养24小时后，挑取生长菌落LB液体培养，提质粒鉴定。
新质粒先采用酶切鉴定。采用pVU II和Pag I双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约1.3kb的目的条带，然后将新质粒的插入序列进行测序，测序引物分别是5’aaacag ctggca cat ctc ttt gca gga a 3’5’caggcatgctggggatgog 3’5’tcgccgatgaactggcgac 3’测序证实原来质粒中的卡那霉素基因已被删除，长1281bp的asd基因成功连入，形成长3114bp的非抗性筛选DNA疫苗载体(以下简称pYZU)。
应用实验1、携带红色荧光蛋白(DsRed)基因的pYZU-DsRed体外转染COS-7细胞结果从携带红色荧光蛋白基因的质粒pDsRed-Express(BD Biosciences Clontech公司)上切下DsRed基因，装入pYZU和pVAX1的相应位点得pYZU-DsRed和pVAX-DsRed(BamH I-EcoR I)，然后进行体外转染实验，每个质粒转染三个孔的细胞。
转染前一天接种4×105的COS-7细胞至直径35mm的培养皿中，转染当天先用100微升无血清，无抗生素DMEM(由GIBCOBRL公司生产的一种细胞培养用培养基，英文全称为Dulbecco’s Modified)培养基稀释1.5微克的质粒，然后加入10微升PolyFect(由QIAGEN公司生产的一种转染试剂，英文全称为PolyFect&reg；Transfection)转染试剂，混匀，室温放置5-10分钟，再加入600微升完全DMEM培养基，混匀，直接转至经PBS洗涤过含1.5毫升完全DMEM培养基的培养皿中，37℃5％CO2培养24小时，胰酶消化后进行流式细胞仪检测，发红色荧光细胞占总细胞的比例判为转染效率。
实验结果显示pYZU-DsRed转染COS-7细胞的转染效率为54.1±4.5％，对照组pVAX-DsRed转染效率为52.3±3.2％，两者转染效率类似。
2、携带乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的pYZU-HBsAg肌肉注射途径免疫小鼠实验结果从质粒pRc/CMV-HBs(S)(Dr.Robert Whalen赠送)上用Kpn I和Not I切下HBsAg基因装入pYZU和pVAX1的相应位点得pYZU-HBsAg和pVAX-HBsAg。8周龄BALB/c小鼠在第0，4周分别在双侧股四头肌注射100微升PBS溶解的100微克的质粒(每侧50微升)。分别于第在首免后的第0，4，8周小鼠眼眶静脉窦采血，分离的血清用间接ELISA法(厦门新创公司试剂盒)测定HBsAb抗体。结果显示以pYZU为载体的DNA疫苗可诱生比pVAX1为载体的DNA疫苗稍强的抗体免疫应答。
附表pYZU-HBsAg质粒免疫小鼠后血清抗体滴度水平免疫组 编号零周 第四周第八周pYZU-HBsAg 1 ＜1∶51∶3201∶12802 ＜1∶51∶20 1∶1603 ＜1∶51∶3201∶6404 ＜1∶51∶80 1∶3205 ＜1∶51∶10 1∶806 ＜1∶51∶3201∶12807 ＜1∶51∶1601∶6408 ＜1∶51∶80 1∶320pVAX-HBsAg 1 ＜1∶51∶80 1∶6402 ＜1∶51∶20 1∶803 ＜1∶51∶20 1∶3204 ＜1∶51∶80 1∶3205 ＜1∶51∶10 1∶806 ＜1∶51∶1601∶6407 ＜1∶5＜1∶5＜1∶58 ＜1∶51∶20 1∶160空载体组pYZU1-6＜1∶5＜1∶5＜1∶5由上述实验得出1、DNA疫苗载体中用天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Asd)基因代替了抗生素抗性基因，新型非抗性筛选DNA疫苗载体质粒避免了抗生素抗性基因的潜在性危险。
2、体外和体内实验表明pYZU具有与原载体pVAX1相似或稍强表达外源基因和激发机体免疫应答的能力，为该载体推广使用奠定了坚实的基础。
权利要求
1.非抗性筛选DNA疫苗载体，其特征在于该载体全长3114bp，其序列为gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080aagcgaaccg gaattgccag ctggcacatc tctttgcagg aaaaaaacgc tatgaaaaat 1140gttggtttta tcggctggcg cggaatggtc ggctctgttc tcatgcaacg catggtagag 1200gagcgcgatt tcgacgctat tcgccctgtt ttcttttcta cctcccagtt tggacaggcg 1260gcgcccacct tcggcgacac ctccaccggc acgctacagg acgcttttga tctggatgcg 1320ctaaaagcgc tcgatatcat cgtgacctgc cagggcggcg attataccaa cgaaatttat 1380ccaaagctgc gcgaaagcgg atggcagggt tactggattg atgcggcttc tacgctgcgc 1440atgaaagatg atgccattat tattctcgac ccggtcaacc aggacgtgat taccgacggc 1500ctgaacaatg gcgtgaagac ctttgtgggc ggtaactgta ccgttagcct gatgttgatg 1560tcgctgggcg gtctctttgc ccataatctc gttgactggg tatccgtcgc gacctatcag 1620gccgcctccg gcggcggcgc gcgccatatg cgcgagctgt taacccagat gggtcagttg 1680tatggccatg tcgccgatga actggcgacg ccgtcttccg caattcttga tattgaacgc 1740aaagttacgg cattgacccg cagcggcgag ctgccggttg ataactttgg cgtaccgctg 1800gcgggaagcc tgatcccctg gatcgacaaa cagctcgata acggccagag ccgcgaagag 1860tggaaaggcc aggcggaaac caacaagatt ctcaatactg cctctgtgat tccggttgat 1920ggtttgtgtg tgcgcgtcgg cgcgctgcgc tgtcacagcc aggcgttcac catcaagctg 1980aaaaaagagg tatccattcc gacggtggaa gaactgctgg cggcacataa tccgtgggcg 2040aaagtggtgc cgaacgatcg tgatatcact atgcgcgaat taaccccggc ggcggtgacc 2100ggcacgttga ctacgccggt tggtcgtctg cgtaagctga acatggggcc agagttcttg 2160tcggcgttta ccgtaggcga ccagttgtta tggggcgccg ccgagccgct gcgtcgaatg 2220ctgcgccagt tggcgtagtg gctattgcag cgcttatcgg gcctgcgtgt ggttctgtag 2280gccggataag gcgcgtcagc gccgccatcc ggcggggaaa tttgtgttaa accaggggtg 2340catcgtcacc ctttttttgc gtaatacagg agtaaacgca gatgtcatga ccaaaatccc 2400ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2460ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2520agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 2580cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2640caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2700tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 2760ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2820ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2880gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 2940gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3000tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3060cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tctt。
2.具有权利要求1所述序列的非抗性筛选DNA疫苗载体的构建方法，其特征在于将扩增的鼠伤寒沙门氏菌asd用pVUII和PagI双酶切；用pVUII和PagI双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因；然后将asd基因与去除卡那霉素抗性基因的载体进行连接。
全文摘要
本发明涉及一种DNA疫苗载体以及构建的方法，将扩增的鼠伤寒沙门氏菌asd用pVUII和PagI双酶切；用pVUII和PagI双酶切质粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因；然后将asd基因与去除卡那霉素抗性基因的载体进行连接，构成长度为3114bp的新型非抗性筛选DNA疫苗载体。本发明采用染色体－质粒平衡致死系统代替抗生素抗性基因来作为DNA疫苗扩增的选择性标记，构建新型非抗性筛选DNA疫苗载体，从而避免了抗生素抗性基因的潜在性危险问题。
文档编号C12N15/12GK1546669SQ200310112640
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者焦新安, 张晓明, 潘志明, 张晓荣, 刘秀梵 申请人:扬州大学