专利名称：草甘膦抗性基因及含该基因的载体和转化子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种草甘膦抗性基因以及含有该基因的载体和转化子。
背景技术：
化学除草已成为现代化农业生产的重要组成部分。全世界除草剂的总用量、施用面积及费用均已超过杀虫剂和杀菌剂的总和。在众多的除草剂中，草甘膦(N-phosphonomethylglycine)是目前世界上使用最为广泛的一种。它的优点是对人畜无毒，降解快，对环境污染非常小，而且价钱便宜，因而深受欢迎。仅美国每年销售量就达几百万美元。草甘膦是一种广谱、内吸性的除草剂，它可无选择地抑制所有植物的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(下面简称EPSPS)活性，阻断植物芳香族氨基酸的合成，因此它也抑制农作物的生长。应用基因工程技术培育对草甘膦具有抗性的农作物，对于安全使用草甘膦具有重要意义。
目前，获得抗草甘膦转基因农作物研究途径主要有一、导入过量表达的EPSP合酶基因，以此抵御草甘膦的竞争性抑制；二、导入通过定点突变而获得对草甘膦低亲和性或无亲和性的EPSP合酶，从而减轻草甘膦的抑制作用。但通过以上两个途径获得的转基因农作物对草甘膦的实际抗性却并不理想。已有报道草甘膦对莽草酸的生物合成、核酸的生物合成以及光合磷酸化及ATP酶的活性都有抑制。所以植物代谢中可能存在着草甘膦作用的多个靶位点。概括来说EPSPS转基因农作物对草甘膦的作用机理上是起一种拮抗作用，并没改变除草剂的代谢。如果能够到找与草甘膦代谢相关的基因，利用这样的基因获得具有高效降解底物能力的转基因农作物。通过加快分解草甘膦解除它对作物的毒害，才能从根本上提高植物对除草剂的抗性，对环境保护也有着重要意义。
甲基磷酸、乙基磷酸和草甘膦等有机膦化合物中的磷元素，都是以相同的C-P单键形式存在，具有微生物能裂解该键。Zeleznicketal在1963年首次发现，E.coli能裂解C-P键利用甲基磷酸或乙基磷酸作为磷源。却并不能利用草甘膦。而有些土壤细菌例如根瘤菌(Flavobacterium spp.)菌株及农杆菌(Agrobacterium spp.)等不仅与E.coli相同能利用甲基磷酸和乙基磷酸，而且能裂解草甘膦的C-P键，产生肌氨酸和无机磷，作为细菌的磷源加以吸收。这两种的代谢差异体现在分子水平上就是该代谢途径相关基因的差异。可是Parker在1999年的实验证明在能降解草甘膦的Rhiz.mcliloti中有与E.coli的C-P降解酶体系基因同源的基因簇。这就提示了两种的C-P键裂解谢途径的差异，并不没改变降解酶的特性。那些能利用草甘膦作为磷源的土壤细菌也许是在C-P键裂解谢途径存在某个基因让细菌获得了草甘膦抗性，而使它们的C-P降解酶能正常工作降解草甘膦。
迄今除了EPSP合酶突变基因外，其它与草甘膦相关基因转化植物的研究尚未深入。除草剂抗性基因替代抗生素抗性基因，也是迫切开发这类基因的意义。我们实验室在草甘膦相关基因方面作了很多探索。对不同种属的微生物利用草甘膦的能力通过数种方式作了量化比较，筛选出具有高效降解能力的菌株进行以下研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的草甘膦抗性基因及含该基因的功能表达载体和转化子。
本发明是根据基因互补的原理，利用现代分子生物学和DNA重组技术，选择具有降解草甘膦能力的微生物，从中分离和克隆草甘膦抗性基因。发明人在研究中发现苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti(中科院微生物研究所保藏编号IMAS AS1.166M010)具有高效降解草甘膦的能力，提示其含有草甘膦抗性基因。本发明以苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010菌株为材料建立基因文库，然后转化到不能降解草甘膦的大肠杆菌中去，通过基因互补获得草甘膦抗性基因。通过基因测序获得1059bp的DNA编码序列，命名为Glr基因。我们构建了含有Glr基因的细菌质粒转化大肠杆菌，检测比较它和对照在不同草甘膦浓度的无磷培养基中的生长情况。由此证明Glr基因的存在提高了宿主对草甘膦的抗性。为了确证我们所获得的新基因的实用性，将其连接到植物转化载体转入模式植物烟草中进行表达，叶片抗性实验和整株幼苗的草甘膦筛选实验都证明我们克隆到的Glr基因有提高生物对除草剂草甘膦的抗性作用。
本发明所用的苜蓿根瘤菌来源于广东省微生物研究所菌种保藏选育实验室。
本发明的草甘膦抗性基因Glr的DNA序列如序列表所示。
本发明的草甘膦抗性基因Glr可以按照序列表中<400>1所示的序列通过已知的常规方法合成得到。
本发明的pCR Glr质粒是在pCR2.1质粒载体上位于BamHI和XhoI酶切位点间插入上述的草甘膦抗性基因Glr片段而得到。其结构如图2所示。
本发明的pCAMBIA Glr质粒是在pCAMBIA 1300质粒载体上位于T-DNA区域的BamHI-XbaI位点间，从5′到3′方向插入了含有CaMV35S启动子序列烟草TSPGlr.Nos终止子序列的片段而得到；Glr为上述的草甘膦抗性基因Glr。该质粒的结构如图4-2所示。
本发明的LBA Glr的工程菌是它由上述的质粒pCAMBIA Glr转化农杆菌LBA4404而获得。
以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是野生型苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；图2是含有草甘膦抗性基因的质粒pCRGlr结构图；图3是XLI-pCRGlr转化子、以及对照XLI-pCR2.1转化子在含有不同浓度草甘膦的无磷液体培养基中的生长曲线；图4-1是TSP，Glr和Nos polyA片段克隆到pCR2.1载体构建示意图；图4-2是CaMV35S，与TSPGlrNos PolyA大片段克隆到表达载体pCAMBIA1300的构建示意图；图5是诱导生根的抗性幼苗照片；图6是再生植株的PCR分析电泳结果照片；图7是叶片盘法草甘膦抗性分析结果照片；图8是整体植株草甘膦抗性分析照片。
具体实施例方式
实施例1.检测苜蓿根瘤菌降解草甘膦能力将苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166M010接种在含有0，2，4，6，8和10mM草甘膦的液体根瘤菌无磷培养基(培养基成分见表1)中，测定其生长曲线(见图1)。从曲线上可见，在含2.0mM草甘膦的液体无磷培养基中，该菌的生长速度最快；但是随着草甘膦浓度的提高，其生长也逐渐受到抑制。说明苜蓿根瘤菌具有较强的降解草甘膦的能力。
表1.液体根瘤菌无磷培养基成分MOPS/KOH(pH7.4) 25mM， MgSO42mM，柠檬酸铁 100μM，CaCl21.2mM，NH4Cl33mM， 维生素B10.5mg/L，烟酸 0.1mg/l， 生物素 0.1mg/L泛酸，0.5mg/L 丁二酸钠50mM微量元素CoCl20.8μM，CuSO440μM，H3BO414μM， MnCl20.1μM，Na2MoO410μM， ZnSO41.5μM。实施例2.建立苜蓿根瘤菌基因文库将苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166 M010的单菌落接种于200ml根瘤菌丰富培养基(培养基成分见表2)中，在28℃空气浴中震荡培养48小时。离心收菌，以5ml DNA提取缓冲液(50mM Tris-Cl，10mM EDTA，1％SDS，5μg/ml溶菌酶)重悬菌体，用超声波破壁。然后用等体积的苯酚和氯仿抽提除蛋白，再通过酒精沉淀DNA。最后将DNA溶于1ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)。将DNA以限制性内切酶BamH I和EcoR I进行部分酶切。通过琼脂糖凝胶电泳将不同大小的DNA片段分开，并切下其中含有2-10kb左右片段的凝胶，用Omega公司试剂盒(Gel ExtrationKit试剂盒)回收DNA。随后按载体∶插入片段＝1∶3的比例，用T4连接酶将该片段连接到已用相同酶切处理的质粒pCR2.1上。将连接液转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，涂布到含氨苄青霉素(Amp)50ug/ml的LB固体培养基上，37℃培养过夜。收集到大约5000个转化子。
表2.根瘤菌丰富培养基成分酵母膏1克， 土壤浸提液 200毫升，甘露醇10克， 蒸馏水(pH7.2) 800毫升。
土壤浸提液的制法取土壤50克，加水200毫升，在高压蒸汽锅中，以15磅压力蒸煮1小时，过滤去固体物，滤液加水补足到200毫升。实施例3.草甘膦抗性基因的克隆和序列分析将上述实施例2制备的转化子菌落用大肠杆菌无磷液体培养基(培养基成份见表3)从LB固体培养基上洗脱下来，离心收集菌体，而后再用大肠杆菌无磷液体培养基重复洗涤2次，然后随机地涂布到含不同浓度草甘膦(0mM，0.05mM，0.1mM，0.25mM，0.5mM)的大肠杆菌无磷固体(培养基成份见表3)平板上，37℃培养3天。结果我们获得了一个能在含草甘膦的无磷固体培养基上生长的转化子，命名为XLI-pCRX。只有含有草甘膦抗性基因的转化子才能正常生长启动phn基因簇，利用培养基中的唯一磷源--草甘膦而生长。因此无疑XLI-pCRX含有编码草甘膦抗性的基因。将pCRX质粒DNA提纯并用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切检测。结果表明pCRX包含一个2.2kb插入片段。这个克隆含有的草甘膦降解酶基因的插入片段的核酸序列已经完全测序，用序列分析软件分析结表明其中1059bp的DNA才是编码序列，命名为Glr基因。将Glr基因与Genebank、EMBL核酸序列库比较显示，未发现任何具有相似功能的同源性的序列。所以应该是一个全新的草甘膦抗性基因，该Glr基因的具体序列如序列表所示。
表3.大肠杆菌液体无磷培养基成分MOPS(pH7.4) 40mM， N-三甲基甘氨酸 4mM，次氮基三乙酸 15mM， NaCl50mM，NH4Cl 10mM， K2SO40.28mM，MgSO4·7H2O0.02mM，MgCl20.6mM，亮氨酸 30mg/L，色氨酸 20mg/L，葡萄糖 20g/L；微量元素MnSO4·H2O 6μM mM， FeSO4·7H2O 10μM，CaCl2·2H2O0.6μM，CoCl2·6H2O 0.4μM，ZnSO4·7H2O0.4μM，H3BO30.3μM，Na2MoO4·2H2O 0.04μM， CuSO40.04μM；固体培养基为液体培养基中加入15g/L琼脂，12g/L柠檬酸三钠。实施例4.质粒pCRGlr的构建及检测转化子XL1-pCRGlr利用草甘膦的能力为了更有力地证明Glr基因编码抗性基因存在使phn基因簇正常作用促进了草甘膦的代谢，根据已完全测序的DNA片段设计引物5’-CGGATCCTGGTGATCCTCACCCTCTATG-3’5’-CCGCTCGAGTCACAGAAATCCGATCGCGCG-3’PCR扩增序列表给出的序列，克隆获得了5’是BamI、3’是XhoI酶切位点的Glr基因。与用BamI和XhoI酶切过的pCR2.1连接，构建结构如图2所示的大肠杆菌转化质粒，我们把该质粒命名为pCRGlr。
将质粒pCRGlr和不含插入片段的对照载体pCR 2.1转化到大肠杆菌XL1-blue中，获得转化子XLI-pCRGlr、和XLI-pCR2.1。将XLI-pCRGlr转化子与没有外源插入片段的XLI-pCR2.1转化子做对比。首先将转化株接种到LB培养基中，37℃过夜培养。然后离心收取菌体，并用大肠杆菌液体无磷培养基洗涤2次，转接到草甘膦浓度为0，0.2，0.4，1，2mM的液体无磷培养基中，37℃培养72小时。检测培养液的OD600值，比较各菌在不同草甘膦浓度下的生长情况(测定结果如图3所示)。结果表明，XLI-pCRGlr转化子在0.4mM草甘膦浓度下生长较好。而对照样品，即没有外源片段的XLI-pCR2.1转化子在浓度为0.2mM的草甘膦作用下已完全被抑制。实施例5.构建含克隆新基因的植物表达载体为了确证我们所获得的新基因的实用性，将其连接到植物转化载体转入模式植物烟草中进行表达。我们选用了CaMV35S启动子序列、Nos终止子序列、烟草转导肽TSP序列和农杆菌穿梭质粒pCAMBIA1300(购于澳大利亚的CAMBIA公司)，构建成植物表达载体。CaMV35S-Nos启动子-终止子系统已被证实能非常有效地提高外源基因在植物中的转录水平(序列和获得方法如1987的Science，1299-1302页的Duplication of the CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhance for plant genes.中所记载)；TSP序列则使表达的蛋白能进入草甘膦作用部位的叶绿体中(Genbank Access No.M61904)。
首先设计引物5’-CGCGGATCCTGGCACAGATTAGCATG-3’5’-CATGCCATGGTCTGTGCAGTGACCACTGAT-3’从烟草染色体DNA中，用(按表5.1和表5.2体系)PCR扩增法克隆获得转导肽TSP序列。
再设计引物5’-CATGCCATGGTGATCCTCACCCTCTATG-3’5’-CCGCTCGAGTCACAGAAATCCGATCGCGCG-3’用PCR扩增法(按表5.1和表5.2体系)从pCRGlr质粒上克隆到Glr基因。
由于质粒pCAMBIA1300载体分子大、拷贝数少而不易进行基因操作，所以我们以质粒pCR2.1载体为中介。按如图4-1所示的质粒构建路线，先将TS，Glr和Nos polyA片段克隆到pCR2.1载体上，最终得到一个从5′到3′方向依次排列着烟草TSP、Glr基因和Nos终止子序列的DNA大片段。再按图4-2所示将CaMV35S和按图4-1已构建好的TSPGlrNos polyA大片段克隆到表达载体pCAMBIA1300上，构建烟草转化所需的质粒。最终获得如图4-2所示的植物转化载体pCAMBIA Glr。
表5.1 PCR反应液2×TaqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200μM，根据各模板设计的特异引物各3pM(BIOASIA)，
各模板DNA约102-104拷贝，TaqDNA聚合酶(上海生工)约.0.5-5U。具体为dNTPs 2μl模板DNA1μlTaqDNA聚合酶 0.5μl引物1 0.5μl引物2 0.5μlddH2O 16.5μl表5.2PCR反应程序预变性94℃，5分钟循环94℃60秒，58℃60秒，72℃60秒共进行30次。
72℃延伸10分钟。实施例6.获得含Glr基因的农杆菌工程菌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备28℃过夜培养的农杆菌，转接到新鲜的YEB液体培养基(成分见表6)中，28℃空气浴中振摇培养3-4小时，直至OD600＝0.5左右，置于冰上5分钟。再于4℃下、3500rpm离心20分钟收集菌体，用1ml浓度未20mmol/L冰冷CaCl2的溶液重悬菌体，以每管100微升的量分装，存放-70℃中备用。
一管制备好的农杆菌感受态细胞，加入前述构建好的穿梭质粒(pCAMBIA Glr)0.5-1.0μg混匀，依次置冰浴5分钟，置37℃5分钟。加入YEB培育培养基1毫升，在28℃空气浴中振摇培养2-4小时，然后把上述转化好的细胞悬夜涂布到含有合适抗生素的YEB固体平板上。28℃培养两天后，可见到抗性转化子的出现。所获得的转化子即为含Glr基因的农杆菌工程菌，其含有按实施例5构建的植物转化载体pCAMBIA Glr。
表6.YEB培养基成份胰化蛋白胨5g/L， 酵母提取物1g/L，氯化钠5g/L， MgSO4.7H2O 0.493g/L。
固体培养基为液体培养基中加入15g/L琼脂。实施例7.以所获工程菌转化烟草检测Glr基因在植物中的作用转化好的农杆菌在含链霉素和卡那霉素的YEB液体培养基上，28℃培养过夜后，以十分之一的量转接于新鲜YEB培养基中，继续培养约6小时。4℃，3500rpm离心20分钟收集菌体，重悬于MS液体培养基中。把烟草无菌苗的叶子剪成约0.5cm2的叶片，放入MS培养基悬浮的菌液中，浸泡10-30分钟。取出叶片，在无菌滤纸上吸去多余的菌液，把叶片放在分化培养基上(MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+3％蔗糖+0.7％琼脂)，25℃暗培养2-3天。取出叶片，用无菌水洗几次，再用无菌滤纸吸去多余的水分，把叶片放到加有300mg/L头孢霉素和25mg/L潮霉素的分化培养基上，25℃恒温，每天16小时光照条件下培养。待叶片的边缘长出潮霉素抗性株后，把分别把抗性株移至MS0生根培养基(MS加300mg/L头孢霉素、25mg/L潮霉素和0.1mg/L NAA+0.7％琼脂)上诱导生根。获得很高的潮霉素抗性苗比率，在68％-80％之间。抗性小芽在含Hyg 25mg/L的生根培养基中生长良好，长出多而粗壮的根(如图5)。
为证实Glr基因已经被导入到上述潮霉素抗性植株中，我们分别提取转基因烟草的DNA，以根据细菌Glr基因序列设计的特殊引物进行了PCR法分析。结果如图6所示，其中M为分子量标记；-为不加模板的负对照；+为以细菌中提取的相同的所购建转化载体为模板对Glr基因PCR扩增结果为正对照；1-8以转基因植物染色体DNA为模板PCR扩增的结果。1-7有与正对照相同的结果。8无结果为假阳性。可见从转基因植物染色体DNA中，能得到相同大小的PCR扩增产物。而从作为负对照的非转化烟草中，则没有扩增产物的产生。检验结果在分子水平证实了Glr基因，已经通过农杆菌介导，转入到转基因烟草中。
将各株由通过PCR检测证实含目的基因的抗性幼苗叶子，剪成直径大约5mm的叶片，置于含有0-0.03mM草甘膦的固体MS分化养基上，于25℃恒温，每天16小时光照条件下培养。以未经转化的烟草的叶片作为对照。观察在不同浓度草甘膦中叶片的表现。转入Glr基因的株系愈伤组织生长情况明显好于野生型对照转化植株。如图7所示，在5-15μmol/L草甘膦存在的情况下，愈伤组织形态、颜色和生长速度正常，没有明显草甘膦抑制现象，经继续培养仍可分化成苗。而未转化的对照株愈伤组织在10μmol/L草甘膦存在的情况下，生长已开始受到抑制，在含30μmol/L以上草甘膦的培养基中，叶片因受草甘膦的毒害，不能分化为愈伤组织，且发黄萎缩。
将分化出的潮霉素抗性株后至MS0生根培养基上诱导生根，只是不加通常所用的筛选抗生素潮霉素，和未转化对照植株一起加入15μmol/L草甘膦直接筛选。21天后，观察烟草生长，生根情况。如图8所示20％的转化小芽生长良好，叶片颜色绿，根系发达；30％转化小芽的叶片细长，根部膨大，分化较少的根；剩余30％根部膨大生成褐色愈伤不生根。而野生型对照小芽叶片变黄，不生根，死亡。可见我们克隆的草甘膦抗性基因不仅在整株植株表达抗性显示了它的实用价值，也提示其能替代抗生素抗性基因进行转基因植物筛选。
表7.1MS培养基成份10×大量元素母液(g/L)NH4NO316.5，KNO319.0，KH2PO41.7，MgSO4·7H2O 3.7，CaCl2·2H2O 4.4；1000×微量元素母液(g/L)MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，H3BO36.2，KI 0.83，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025；200×铁母液(g/L)；FeSO4·7H2O 5.57，Na2.EDTA 7.45；100×有机物母液甘氨酸200mg/L，烟酸50mg/L，盐酸硫胺素40mg/L，盐酸吡哆醇50mg，肌醇10g。
序列表<110>中山大学<120>草甘膦抗性基因及含该基因的载体和转化子<160>1<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>1059<212>DNA<213>苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti IMAS AS1.166 M010<400>1atcctcaccc tctatggcgg caatgacggc ctgaacaccg tgatcccgtt caccgacaac 60gcctactacg acgcccggcc cgatctggcg ttcgggcccg agacggtcat cgatctggac 120ggaacggtcg gcctgaaccc cgcgctgacc ggtttggcgt ccgcctggcg caacgacaac 180ctggccatca tccgtggcgt cggctatccc aagcaggacc gaagccactt ccggtccatg 240gacatctggc agacagcctc ccccgatgac ccgaccgcgt ccggctggat cggccgctgg 300ctggacagca gcggcgacga tccgctgcgc gcggtgaaca tcggaaccgt gttgccaccg 360atggccgtcg gccaaaagtg caccgccgca gggctttctg cgacgatccc gagactgccc 420ggcgatatgc ccggtgtgct ggaggcgatg agcgcacccg acccactcga tacgcccgcg 480atggccgcgg tccgcgccga ttaccgggcc taccgcacca tcgatgacac gttccgaacc 540ttcaccgacc gccccctgcc gccgacggcg gccaccgatc tcggcaagca actcgccgac 600gatctggaac tggtggccca gtgtgtgcgg gccggagtgc ccaccaaggt gtacatggtc 660tcgctcggcg gattcgacac ccacgccaat gagcgcggcg accaacagaa actgctgacc 720gccctcgacg gcgccatcac accgttcctg aagcagatgc gcaacagcgc ctatggccgg 780caggtggtga cgatgatcta ttcggagttc ggcaggcggg tggccgccaa cgccacacag 840ggcaccgacc acggcacctc gggtccggtc ctgatcctgg gcgagtccgt ccggggcggg 900ttctacggtg acgcgccgag cctcaccgat ctgcgcgacg gcgacctcaa gacgaccacc 960gactttcgag atgtgtatca cgaactgctg gatcagacgc tgggcaccga cccggagcca1020tcggtcggcc cgggccgccg cgcgatcgga tttctgtga 1059
权利要求
1.命名为Glr的草甘膦抗性基因的DNA序列，其特征是该DNA序列的总长为1059bp，具体序列如序列表所示。
2.命名为pCR Glr的质粒，其特征是在pCR2.1质粒载体上位于BamHI和XhoI酶切位点间有如权利要求1所述的命名为Glr的DNA序列的插入片段。
3.命名为pCAMBIA Glr的质粒，其特征是在pCAMBIA 1300质粒载体上位于T-DNA区域的BamHI-XbaI位点间，从5′到3′方向插入了含有CaMV35S启动子序列烟草TSPGlrNos终止子序列的片段；Glr为权利要求1中的命名为Glr的DNA序列。
4.命名为LBA Glr的工程菌，其特征是它由权利要求3所述的质粒pCAMBIA Glr转化农杆菌LBA4404而获得。
全文摘要
本发明提供一种从苜蓿根瘤菌Rhizobium melilotiIMAS AS1.166 M010中克隆到的草甘膦抗性基因(Glr)以及含有该基因的载体和转化子。该基因的序列总长为1059bp。含有Glr序列的农杆菌穿梭质粒pCAMBIA Glr，在烟草中表达使植物对草甘膦具有抗性。该基因不仅能转化制造草甘膦抗性植物，也可作为筛选转基因植物品系的标记基因。
文档编号C07H21/04GK1431219SQ0311357
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月16日 优先权日2003年1月16日
发明者李绿砚, 步怀宇, 徐培林 申请人:中山大学