专利名称：抗草甘膦基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种抗草甘膦基因以及该基因编码的蛋白质。这种基因可以用来在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦选择性地防除杂草。本发明也可以运用在作物的育种、植物细胞培养的筛选。
背景技术：
草甘膦是一种非常重要的杀草剂。它抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一种重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。草甘膦是一种极广谱的杀草剂，对农作物也同样具备杀伤力。因此为了能够在农作物生长时选择性地杀草，农作物需要获得具有抗草甘膦的能力。
草甘膦也能够抑制大部分细菌中芳香族氨基酸的生物合成中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。但部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌CP4和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS和植物中表达而获得的抗性已在生产中引用(美国专利453590，4769061，5094945)。但是为了抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的抗草甘膦植物。然而，种细菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高低，是不能通过EPSPS的氨基酸序列预测的。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种基因，该基因具有很高的抗草甘膦能力，可以用来产生抗草甘膦植物，也可作为微生物和植物细胞培育中的筛选标记。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。
本发明还提供了一种蛋白质多肽该蛋白质多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO2或者与SEQ ID NO2相比具有不小于80％的相同性的蛋白质。其在细胞中能提高细胞的抗草甘膦能力。
本发明还提供了种蛋白质，其包含二个蛋白质多肽区域，其中个蛋白质多肽区域的氨基酸序列为SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2相比具有不小于80％的相同性。其在细胞中能提高细胞的抗草甘膦能力。
本发明还提供了编码上述蛋白质多肽的核苷酸序列分子。
本发明还提供了种质粒包含上述核苷酸序列分子，并且功能性地与控制表达的核苷酸序列连接。
本发明还提供了一种利用上述核苷酸序列分子在细胞中表达而获得表达蛋白质的方法。
本发明还提供了种包含上述核苷酸序列分子的植物细胞。
本发明还提供了一种对植物进行改造的方法包括利用上述植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株具有抗草甘膦能力。植物可选用为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。
本发明还提供了利用上述核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培养中作筛选标记。
依据本发明所提供的一种蛋白质(GT-1)以及与它具有80％或以上序列相同性的蛋白质，通过现有的植物转基因技术；可以把编码这些蛋白质的基因导入植物或植物组织，使植物或植物组织表达这种蛋白质，从而获得抗草甘膦的能力。
氨基酸序列相同性相当高的蛋白质一般具有相同的功能，因此与SEQ IDNO2所示氨基酸序列具有80％或以上相同性的基因都可能对草甘膦有抗性。氨基酸的相同性可以通过现有的方法获得，例如Karlin和Altschul，1990，Porc.Natl.Acad.Sci.USA 873364；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877.)。特别需要说明的是相同性是基于同源部分的比较，而不包括人工或天然融合基因中的不同源的部分。
利用GT-1核酸序列，可以获得具有相同功能的同源基因。一种方法是利用GT-1核酸为探针杂交DNA文库获得同源基因，另一种方法是根据Gt-1核酸序列设计引物通过PCR而获得。不仅如此，通过本发明发现的核酸序列和蛋白质序列，可以通过分子信息学的方法从基因组库中找出高同源性的基因。BLAST(www.ncbi.nih.gov)可以发现在基因库中的所有的同源基因。这些基因也同样可以用来产生抗草甘膦植物或植物组织。
GT-1也可以用来人工引入一个或多个变异而获得保持有抗草甘膦能力的GT-1变异分子。例如利用低保真PCR的方法可以产生很多GT-1变异分子，而这些变异分子可以通过草甘膦筛选获得继续保持有抗草甘膦能力的GT-1变异分子。
利用本发明的基因编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。例如Campbell和Gowri(1990)的报道(Plant Physiol.921-11)。而这个核酸序列可以进一步构建包含表达构件的植物转化质粒。表达构件包括启动子，带有叶绿体信号肽的抗草甘膦基因和终止子。在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin启动子，或者水稻Actin启动子，或者其他启动子。而终止子可以是根癌农杆菌终止子或者其他终止子。抗草甘膦的GT-1基因在5’端连接一个在同一个表达阅读框内表达的编码信号肽的DNA片段，这个信号肽可以引导GT-1蛋白质进入叶绿体。这个信号肽可以是Rubisco的亚基的信号肽(de Castro Silva Filho 1996 Plant Mol.Biol.30767-780)，或者植物EPSPS信号肽(Archer 1990 J.Bioenerg.Biomemb.22(b)789-810)。这个表达构件可以通过农杆菌(如Agrobacterium菌株LAB4404)转入整合到植物的基因组中，稳定遗传和表达。
本发明的又一个方面是GT-1用来作为植物转基因的筛选标志。通过已知的分子克隆技术可以使GT-1在植物细胞中表达，通常构建个在植物中表达的表达构件。这个表达构件包括启动子、带有叶绿体信号肽的GT-1和终止子。这个表达构件可作为筛选标志被克隆到植物转化质粒。植物转化质粒通常还含有目的基因和其他DNA序列。植物转化质粒可以通过基因枪或农杆菌方法导入植物组织，而含有合适浓度的草甘膦培养基则可以选择性地杀死没有导入质粒DNA的植物细胞，从而选择含有GT-1和目的基因的植物细胞。
进一步，本发明可以用来开发转基因抗草甘膦植物。含有GT-1表达构件的植物转化质粒可以获得抗草甘膦转基因植株。植物转化的方法和步骤各种植物有所不同，同种植物不同的品种也可能有所不同。但是植物转化的技术和方法是已知和成熟的。通常通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用1～5mM的草甘膦培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的种苗。更进一步，草甘膦可以喷施在转化苗及其后代筛选除去未转化植株和后代分离失去GT-1基因的植株。
本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。
具体实施例方式
实施例1、抗草甘膦细菌菌株的筛选草甘膦污染土壤样品在含有50mM草甘膦的M63培养基培养。由于M63不含芳香族氨基酸，存活和生长的细菌为抗性菌。培养基的配方如下(每升M6313.6g KH.sub.2PO.sub.4，2g(NH.sub.4).sub.2SO.sub.4，0.5mgFeSO.sub.4-7H.sub.2O，2.4mg MgCl.sub.2，10g glucose，10mg Thiamine-HCl和25mg L-Proline)。其中一种菌株，命名为G3被选择，它能在含200mM草甘膦的M63培养基生长。
实施例2、抗性菌株的鉴定通过PCR获得了部分16sRNA序列。PCR的引物是16s细菌RNA的通用引物。PCR产物被克隆到pMD18-T质粒后进行了测序。结果发现它与Burkholderia caryophylli，Pseudomonas sp.′FSL R1-057′(AF205137)，bacteriumSV70AB2-1(AY770429)，Pseudomonas putida(AB 180734)(AM184283)；与Pseudomonas rhizosphaerae(AY866408)均有～99％的相同性。因此该菌株是一种假单胞杆菌(Pseudomonas sp G3)。
实施例3、EPSPS基因的克隆根据基因库Pseudomonas已完成基因组测序的基因序列资料，设计了一组兼并引物(PsR5’gacatsgcgatrcgrtgrtg；PsFa5’gasctgcgsgtcaaggarwsyga)。经过PCR而获得的产物用pMD18-T克隆并测序。结果发现它与Pseudomonas putida等已完成基因组测序的EPSPS相似。进步根据相关基因组测序结果设计了放大全长EPSPS片断的PCR引物(PsN5’tggcccgccgggcctatgtggacgctatgaac，PsC5’tgaccggtgcttgcgaactcacgact)。PCR放大的全片断被克隆到pMD18-T中，并经过ABI 3700测序。这个基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1，被命名为Gt-1。
实施例4、Gt-1基因在大肠杆菌中的表达1、导致大肠杆菌对草甘膦的高效抗性。
Gt-1基因被克隆在载体pMD18-T中获得克隆g6。克隆g6的阅读框与pMD18-T的LacZ阅读框连接并且致，这样Gt-1能在LacZ启动子和操纵子的控制下而获得表达。
克隆g6和pMD18-T(空载体，对照)在LB中培养，当OD600达到0.6时，取0.2ml在5000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀的细胞经过M63培养液清洗后再离心，然后将沉淀的细胞用含100mM草甘膦的M63培养液稀释到0.02(OD600)。在37℃摇床，250转/分钟，培养24小时后，测定OD600。克隆g6是0.95，而pMD18-T对照仅仅为0.03.这个实验重复进行了4次，得到了相同的结果。显然，Gt-1使大肠杆菌获得了抗草甘膦的能力。
为进一步证明Gt-1的抗草甘膦的能力，克隆g6和pMD18-T(对照)均被分别涂在含有30mM和100mM草甘膦的M63琼脂培养基上，24小时后，PMD18-T(对照)没有发现菌落的生长，而克隆g6明显在30和100mM草甘膦的培养基上均能生长。这也说明GT-1具有抗草甘膦能力。
实施例5、Gt-1与其他已知抗草甘膦基因的相似性
Gt-1与其他已知抗草甘膦基因相当不同。例如它与已知具有抗草甘膦的农杆菌CP4的EPSPS基因的氨基酸序列只有46.4％的相同性，与Pseudomonassp PG2982的只有46.5％的相同性(美国专利5633435)。
Gt-1基因与Pseudomonas putida F1，Pseudomonas putida k224，Pseudomonas entomophila L48，和Pseudomonas fluorescens Pf-5全基因组测序结果中一种理论预测蛋白质序列的一个功能区域的氨基酸序列有较高的相似性(Pseudomonas putida F1全基因组序列NZ AALM00000000，5925059bp；Pseudomonas putida KT2440全基因组序列AE015451，6181863bp；Pseudomonas entomophila L48全基因组序列CT573326，5888780bp；和Pseudomonas fluorescens Pf-5全基因组NC 004129 7074893bp)。
在Pseudomonas putida F1中，这个理论预测蛋白质有746个氨基酸(gbEAP49406.1)，其中氨基酸27～291的肽与预苯酸脱氢酶(PDH)相似，氨基酸322～732的肽与EPSPS相似。但是理论预测的蛋白质的实际功能并不清楚，特别是其是否抗草甘膦更不清楚。
实施例6、Pseudomonas putida F1的理论预测蛋白质的EPSPS区域具有EPSPS抗草甘膦功能Gt-1基因与Pseudomonas putida F1的理论预测蛋白质的EPSPS区域有98.8％的氨基酸序列相同性和93％DNA序列相同性。因此对Pseudomonasputida F1的理论预测蛋白质的EPSPS区域的抗草甘膦功能进行了研究。根据玉米氨基酸秘码子的使用频率，人工合成了编码Pseudomonas putida F1的理论预测蛋白质的EPSPS区域(氨基酸309-746)的核苷酸序列Gt-2(见SEQID NO3)。Gt-2经BglII和SacI处理后克隆至pET-28a的BamHI和SacI之间，获得表达质粒pET-Gt-2，并进一步将pET-Gt-2质粒转入大肠杆菌BL21Star菌株中。
克隆pET-Gt-2和pET-28a(空载体，对照)在LB中培养，当OD600达到0.6时，取0.2ml在5000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀的细胞经过M63培养液清洗后再离心，然后将沉淀的细胞用含50mM草甘膦的M63培养液稀释到0.02(OD600)。在37℃摇床，250转/分钟，培养24小时后，测定OD600。克隆pET-Gt-2是1.27而pET-28a对照仅仅为0.04。显然，Gt-2使大肠杆菌获得了抗草甘膦的能力。
本发明第一次发现和证明了这种理论预测的蛋白质的EPSPS区域具有高抗草甘膦的能力。
实施例7、转变基因抗草甘膦水稻的获得转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌 龚祖埙 1998 生命科学10125-131；刘凡等，2003 分子植物育种 1108-115)。选取成熟饱满种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含适当抗生素的筛选培养基上，筛选培养(2mM草甘膦)两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。
显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO11ATGAACGCCA ACGATCTGAT TTTCCTGGCC CAACCGGGTG GCCGCCTGAA CGGGCGGATT61 CGCGTACCGG GCGACAAGTC GATTTCCCAC CGCTCGATCA TGCTCGGCTC GCTGGCCGAA121 GGCACTACCG AGGTCGAAGG CTTCCTCGAG GGTGAAGACG CGCTGGCGAC CCTGCAGGCA181 TTCCGTGACA TGGGTGTGGT CATCGAAGGC CCCAACCATG GTCGAGTGAC CATTCATGGT241 GTCGGCCTGC ATGGCCTCAA GCCGCCGCCT GGCCCGCTGT ATGTGGGTAA CTCCGGTACT301 TCGATGCGCC TGCTGTCGGG CCTGTTGGCC GGTCAGTCGT TCGACGTGAC CATGACGGGC361 GACGCCTCGC TGTCCAAGCG CCCGATGAAC CGTGTGGCCA ACCCGCTGCG CGAAATGGGT421 GCCGTGGTCG AGACCGGTCC GGAAGGCCGC CCGCCGCTGA CCATCCGTGG TGGCCACAAG481 CTCAAGGGGC TGACCTACAC GCTGCCGATG GCCAGCGCCC AGGTAAAATC CTGCCTGCTG541 CTGGCTGGCC TGTACGCCGA AGGCAAGACC ACTGTCACCG AGCCTGCGCC TACCCGTGAC601 CACACCGAGC GCATGCTGCG TGGTTTCGGC TATTCGGTCG AAAGCAACGG CCCAGTCGCT661 TCGCTGCAGT CCGGCGGCAA ACTGACCGCT ACCCGCATCG AAGTGCCGGC CGACATTTCC721 TCGGCGGCGT TCTTCCTGGT GGCAGCTTCT ATCGCCGAAG GCTCCGAGTT GGTGCTGGAG781 CACGTTGGCA TCAACCCGAC CCGTACCGGC GTAATCGACA TTCTGCGCCT GATGGGTGGC841 GACATCACCC TGGAAAACCA GCGTGAAGTC GGCGGCGAGC CAGTGGCCGA CCTGCGTGTG901 CGCGGTGCCC AGCTCAAAGG TATCGATATT CCAGAAGCGT TGGTGCCGCT GGCCATCGAC961 GAATTCCCGG TGCTGTTCGT CGCGGCTGCA TGCGCTGAAG GGCGCACAGT GCTACGTGGC1021 GCCGAAGAGC TGCGGGTGAA GGAGTCCGAC CGCATCCAGG TCATGGCTGA CGGCCTGATC1081 ACGCTGGGAA TCAAGTGCGA GCCGACCCCG GACGGCATCA TCATCGACGG CGGCCAGTTG1141 GGCGGCGGCG AAGTACACGG GCATGGTGAC CACCGCATCG CCATGGCCTT CAGCGTGGCC1201 TCGCTGCGCG CCAGTGCGCC GATCCGCATC CACGACTGCG CCAACGTCGC CACCTCGTTC1261 CCCAACTTCC TGGCACTGTG CGCCGAAGTG GGCATCCGCG TGGCGGAAGA GGGCAAGTCG1321 TGASEQ ID NO21 Met Asn Ala Asn Asp Leu Ile Phe Leu Ala Gln Pro Gly Gly Arg Leu Asn Gly Arg Ile21 Arg Val Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser Ile Met Leu Gly Ser Leu Ala Glu41 Gly Thr Thr Glu Val Glu Gly Phe Leu Glu Gly Glu Asp Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ala61 Phe Arg Asp Met Gly Val Val Ile Glu Gly Pro Asn His Gly Arg Val Thr Ile His Gly81 Val Gly Leu His Gly Leu Lys Pro Pro Pro Gly Pro Leu Tyr Val Gly Asn Ser Gly Thr101Ser Met Arg Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ala Gly Gln Ser Phe Asp Val Thr Met Thr Gly121Asp Ala Ser Leu Ser Lys Arg Pro Met Asn Arg Val Ala Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly141Ala Val Val Glu Thr Gly Pro Glu Gly Arg Pro Pro Leu Thr Ile Arg Gly Gly His Lys161Leu Lys Gly Leu Thr Tyr Thr Leu Pro Met Ala Ser Ala Gln Val Lys Ser Cys Leu Leu181Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Thr Thr Val Thr Glu Pro Ala Pro Thr Arg Asp201His Thr Glu Arg Met Leu Arg Gly Phe Gly Tyr Ser Val Glu Ser Asn Gly Pro Val Ala221Ser Leu Gln Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Thr Arg Ile Glu Val Pro Ala Asp Ile Ser241Ser Ala Ala Phe Phe Leu Val Ala Ala Ser Ile Ala Glu Gly Ser Glu Leu Val Leu Glu261His Val Gly Ile Asn Pro Thr Arg Thr Gly Val Ile Asp Ile Leu Arg Leu Met Gly Gly281Asp Ile Thr Leu Glu Asn Gln Arg Glu Val Gly Gly Glu Pro Val Ala Asp Leu Arg Val301Arg Gly Ala Gln Leu Lys Gly Ile Asp Ile Pro Glu Ala Leu Val Pro Leu Ala Ile Asp321Glu Phe Pro Val Leu Phe Val Ala Ala Ala Cys Ala Glu Gly Arg Thr Val Leu Arg Gly
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权利要求
1.抗草甘膦基因，其特征是该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1或SEQID NO3。
2.一种蛋白质多肽，其特征是该蛋白质多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2相比具有不小于80％的相同性的蛋白质。
3.一种蛋白质，其特征是包含二个蛋白质多肽区域，其中一个蛋白质多肽区域的氨基酸序列为SEQ ID NO2或者与SEQ ID NO2相比具有不小于80％的相同性。
4.一种编码权利要求2或3蛋白质多肽的核苷酸序列分子。
5.一种质粒，其特征是包含权利要求4所述的核苷酸序列分子，并且功能性地与控制表达的核苷酸序列连接。
6.一种利用权利要求4的核苷酸序列分子在细胞中表达而获得表达蛋白质的方法。
7.一种包含权利要求4的核苷酸序列分子的植物细胞。
8.一种对植物进行改造的方法，其特征是包括利用权利要求7所述的植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。
9.根据权利要求8所述的改造方法，其特征是所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。
10.利用如权利要求4所述的核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培养中作筛选标记。
全文摘要
本发明公开了一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。本发明还公开了相应的蛋白质多肽、蛋白质、质粒、植物细胞。本发明的基因可以用来在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦选择性地防除杂草。本发明也可以运用在作物的育种、植物细胞培养的筛选。
文档编号C12N15/82GK1940072SQ20061005257
公开日2007年4月4日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者沈志成 申请人:浙江大学