专利名称：一种含有耐草甘膦基因的重组dna片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种 含有耐草甘膦基因的重组DNA片段及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的含有耐草甘膦基因的重组DNA片段及其应用。
背景技术：
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如I) AT含量较高，超过60 %，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的PolyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0. 001%或者几乎检测不到。美国 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A,et al. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol, 1997, 34 :485-496)在不改变毒蛋白氛基酸序列的前提下，分别对杀虫蛋白基因和cryIII基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不稳定元件序列，使转基因植株中毒蛋白的表达量增加了 30 100倍，高达可溶性蛋白的0. 02 1%，获得了明显的抗虫效果。杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达,表现高耐草甘膦的特性(Yichen Sun, Min Linand Yiping Wang. Novel AroA with high tolerance to Glyposate, encoded by a geneof Pseudomonas putida 4G—1 isolated from an extremeIypoIluted environment inChina. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物,特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组DNA片段。本发明所提供的重组DNA片段包括如下I)-3)的元件I)启动子；2)由所述启动子启动转录的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因(命名为mG2-aroA)的核苷酸序列为下述a)或b)
a)序列表中序列2 ；b)与序列表中序列2至少具有98%的同一性，且编码序列9所不蛋白质(命名为G2-aroA 蛋白)；3)终止序列。可用于本发明的启动子包括但不限于组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S ;西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子PF128，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、nap in, oleosin和大豆beta conglycin的启动子等。在本发明的一个实施例中，所述启动子为Ubi启动子，来源于玉米，为组成型表达启动子，其序列具体为序列表中序列5，或与序列5至少具有80%的同一性，且具有启动子功能。可用于本发明的转录终止子包括但不限于农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。所述转录终止序列具体为T-NOS双终止序列，如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有转录终止功能的序列。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段还包括OMK序列。所述OMK序列由Q序列和Kozak序列顺次连接组成，其序列具体为序列表中序列6，或与序列6至少具有80%的同一性，且具有增强子功能。所述Q序列和Kozak序列来源于烟草花叶病毒，为增强子，负责增强所述耐草甘勝基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段还包括叶绿体导肽(CTP)序列，其序列具体为序列表中序列7，或与序列7至少具有80%的同一性，且具有信号肽功能。所述叶绿体导肽(CTP)序列来源于玉米，为信号肽序列，能使所述耐草甘膦基因表达的蛋白(G2-aroA蛋白)转运到叶绿体中去。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、所述叶绿体导肽序列、所述耐草甘膦基因和所述转录终止序列顺次连接组成，命名为Ubi-0MK-CTP-mG2aroA_PoIyA-T-NOS ;其序列具体如序列表中序列10所不。其中，序列2由1338个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子。序列2的第1-1335位为编码序列，编码序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010个和核苷酸组成。序列6由67个核苷酸组成。序列7由141个核苷酸组成。序列8由491个核苷酸组成。序列9由444个氨基酸组成。序列10由4058个核苷酸组成，其中第1-2010位为Ubi启动子序列，第2022-2088位为OMK序列，第2089-2229位为叶绿体导肽(CTP)序列，第2230-3567位为mG2_aroA序列，第3568-4058位为转录终止序列。含有所述重组DNA片段的重组细胞系、转基因植物或转基因微生物也属于本发明的保护范围。所述重组细胞系可以为真核细胞，也可以为原核细胞，如植物细胞系。在本发明的一个实施例中，所述转基因植物(如玉米)包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。所述转基因微生物为转入所述重组DNA片段的农杆菌LBA4404。所述重组DNA片段在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。本发明针对原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表达较低的问题，在保持原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性的结构(如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA 二级结构、核糖体结合位点等)，增加GC含量。同时在其5’端添加Q序列和Kozak序列序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白质的序列)。启动子选用组成性启动子Ubi启动子。再则，在编码序列的3’端设计了 2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS双终止序列。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保了翻译的准确终止。另外，根据植物耐草甘膦的特殊机制，在5’起始密码子ATG前加入叶绿体导肽CTP，使目的基因表达的蛋白(即G2-aroA蛋白)转运到叶绿体中，以更好的发挥mG2-aroA基因的抗性效果。通过上述设计，使G2-aroA蛋白在玉米中高效稳定表达。实验证实，与转入原始G2-aroA基因的重组DNA片段的玉米植株相比，转入本发明所提供的含有mG2-aroA的重组DNA片段(序列10)的阳性玉米植株，其G2_aroA蛋白的表达量明显提高，每克叶片G2-aroA蛋白的表达量中可达15. 057 y g，远高于原始G2_aroA基因转基因玉米的3. 735 Ug0同时，与转入原始G2-aroA基因的重组DNA片段的玉米植株相t匕，转入本发明所提供的含有mG2-aroA的重组DNA片段(序列10)的阳性玉米植株对草甘膦的耐受性也明显提高，转入本发明所提供的含有mG2-aroA的重组DNA片段(序列10)的T6代植株在玉米5叶期喷施800ml/亩农达后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应；而转入含有G2-aroA基因的重组DNA片段的T6代植株，在800ml/亩农达处理后，药害非常严重，植株均表现黄化、畸形，后期植株生长期内大部分表现雄穗不分化、雌穗不吐丝或者植株矮小。
图I为载体pUC19-UG2的质粒图谱。图2为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。 图3为载体pS3300的质粒图谱。图4为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。
图5为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。图6为重组载体pS3300-UG0的质粒图谱图7为T6代G2_aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-15为11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图8为T6代mG2-aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-24为20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图9为T6代G2_aroA转基因玉米植株和T6代mG2_aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，A为mG2-aroA转基因玉米植株、空载体转基因植株和未转基因植株；B为mG2-aroA转基因玉米植株和G2_aroA转基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为G2_aroA转基因玉米植株；3所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；4所示一行玉米为未转基因的玉米植株。图10为双抗夹心ELISA检测G2_aroA蛋白浓度的标准曲线。图11为纯化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道I为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均为原核重组表达载体pET-28a-G2_aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5 ill、10 ill、15 ill。图12为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道I为蛋白Marker ；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、密码子优化型耐草甘膦基因的获得本实施例根据G2_aroA基因(中国专利，申请号03826892. 2，授权公告号CN100429311 C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对G2-aroA基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表I)，使G2-aroA蛋白的密码子使用频率与玉米中的使用频率接近(表I)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列
2。序列2与G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原来的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即为密码子优化型耐草甘膦基因，将其命名为mG2-aroA。密码子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用频率见表I。为方便克隆，发明人在序列2的5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入Kpn I酶切酶切位点，最终序列如序列表 中序列3所示。序列3的第7-1344位即为序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均编码序列，均编码序列表中序列9所示蛋白，将该蛋白命名为G2-aroA蛋白。表I玉米优选密码子标准
权利要求
1.重组DNA片段，包括如下1)-3)的元件 1)启动子； 2)由所述启动子启动转录的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因的核苷酸序列为下述a)或 b): a)序列表中序列2； b)与序列表中序列2至少具有98%的同一性，且编码序列9所不蛋白质； 3)转录终止序列。
2.根据权利要求I所述的重组DNA片段，其特征在于所述启动子为Ubi启动子。
3.根据权利要求2所述的重组DNA片段，其特征在于所述Ubi启动子的序列为序列表中序列5，或与序列5至少具有80%的同一性，且具有启动子功能。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组DNA片段，其特征在于所述转录终止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有转录终止功能。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组DNA片段，其特征在于所述重组DNA片段还包括OMK序列；所述OMK序列由Q序列和Kozak序列顺次连接组成。
6.根据权利要求5所述的重组DNA片段，其特征在于所述OMK序列为序列表中序列6，或与序列6至少具有80%的同一性，且具有增强子功能。
7.根据权利要求1-6中任一所述的重组DNA片段，其特征在于所述重组DNA片段还包括叶绿体导肽序列；所述叶绿体导肽序列为序列表中序列7，或与序列7至少具有80%的同一性，且具有信号肽功能。
8.根据权利要求1-8中任一所述的重组DNA片段，其特征在于所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、所述叶绿体导肽序列、所述耐草甘膦基因和所述转录终止序列顺次连接组成；所述重组DNA片段的序列具体为序列表中序列10。
9.含有权利要求1-8中任一所述重组DNA片段的重组细胞系、转基因植物或转基因微生物。
10.权利要求1-8中任一所述的重组DNA片段在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种含有耐草甘膦基因的重组DNA片段及其应用。本发明所提供的重组DNA片段包括如下1)-3)的元件1)启动子；2)由所述启动子启动转录的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因的核苷酸序列为下述a)或b)a)序列表中序列2；b)与序列表中序列2至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质；3)转录终止序列。与转入含有原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的重组DNA片段的转基因玉米相比，转入本发明所提供的重组DNA片段的转基因玉米，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高；同时对草甘膦的耐受性也明显提高。
文档编号A01H5/00GK102643840SQ20121010719
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘素霞, 姜付坤, 李雪峰, 殷亮, 邓德芝, 韩庚辰 申请人:北京奥瑞金种业股份有限公司