一种检测rage家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测人糖基终末化产物受体（RAGE）家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒，所述方法具体为：根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；以待测标本的DNA为模板，用特异性扩增引物进行PCR反应，得PCR扩增物；将所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与所述测序引物进行杂交反应，并分析结果；本发明所选取的RAGE靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测RAGE标签单核甘酸多态性基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于RAGE基因检测预测疾病的发生、发展风险。
【专利说明】一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于双重PCR结合双重焦磷酸测序技术检测RAGE家族基因标签SNP位点的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]糖基化终产物受体(RAGE)是一个细胞表面分子的免疫球蛋白超家族的有多重配体的成员。自1992年被成功分离以后，越来越多的研究表面RAGE在血管疾病的发病机制中起着重要作用。RAGE不仅在大血管病变的发生过程中起放大血管炎症，加速动脉粥样硬化的作用，还作为一个开关调控着参与血管病变的各种信号的传递过程。不同的生化因素及信号通路产生的信号分子最终都必须通过活化RAGE通路才能参与到糖尿病血管病变过程中去。近几年，RAGE在脓毒症发病机制中的作用也日益受到重视。动物实验发现，盲肠结扎穿孔所致的脓毒症模型中，RAGE+小鼠的存活率显著高于野生型小鼠。即使在致脓毒症模型24小时后注射RAGE的单克隆抗体，仍然可以显著降低小鼠的死亡率。Bopp C等也发现脓毒症患者血浆sRAGE水平显著升高，且与患者临床结局密切相关。这些研究结果提示，RAGE是脓毒症发病环节中的重要分子。
[0003] 单核甘酸多态性(SNP)是指染色体上单个核苷酸变异引起的群体中DNA序列多态性，具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。目前已发展了 20余种SNP检测方法，如直接测序法、探针杂交法、飞行质谱分析法、限制性片段长度多态性分析法等，但因这些方法的费用、准确性和适用规模等方面的缺点，局限了基因多态性与疾病发生、发展和预后的遗传关联研究。而焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记；具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的检测方法，其能够简捷、直观、准确的对RAGE标签单核苷酸多态性基因型进行检测和判读结果。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0006]一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，具体包括以下步骤:1)特异性引物的设计，即根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；2) PCR扩增，SP以待测标本的DNA为模板，用步骤I)所述的特异性扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增物；3)焦磷酸测序，即将步骤2)所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤I)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点靶单核甘酸是否具备多态性。本技术方案的创新点主要在首次采用采用焦磷酸测序法检测RAGE家族基因的单核甘酸多态性。
[0007]进一步，所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，步骤I)中，所述的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点包括:rsl800625和rs2070600位点。上述位点是通过如下方法获得的:利用HapMap(http://www.hapmap.0rg)SNP数据库(HapMapData Rel28Phase II+III, AuglO, on NCBI B36assembly, dbSNP bl26)下载 RAGE 基因及其上下游3kb范围内中国北京汉族人群(CHB) SNP数据:1)检索框输入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸3kb ；2) “Reports&Analysis”的选项中选择:Download SNPgenotype data ;3) “conf ig”中选择中国北京汉族人群(Chinese Han Bei jing, CHB),获取中国北京汉族人群RAGE家族各基因及其延伸区域内所有SNP位点。在TAGster软件包目录下打开程序运行窗口。按照构建bin和挑选标签SNP标准(最小等位基因频率≥0.05且SNP间连锁关系r2≥0.8)设置参数，运行命令“fconverCTAGster”，即可出现研究区域的bin图和对应bin的标签SNP。利用NCBI下载各基因启动子(基因上游3kb)区域SNP位点的序列。将野生型和突变型的序列分别提交到转录因子预测数据库TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html),得到可能与之结合的核转录因子,并比较SNP位点对转录因子结合的影响。综合SNP间连锁强度和生物信息学分析最终确定检测的RAGE基因的rsl800625和rs2070600位点2个标签SNP位点。
[0008]所述rsl800625位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，测序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rs2070600位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，测序引物如SEQ ID NO:6所示。
[0009]详见下表:
[0010]
【权利要求】
1.一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 1)特异性引物的设计 根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记； 2)PCR扩增 以待测标本的DNA为模板，用步骤I)所述的特异性扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增物； 3)焦磷酸测序 将步骤2)所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤I)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点是否具备多态性。
2.根据权利要求1所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:步骤1)中， 所述的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点包括:rsl800625和rs2070600 位点。
3.根据权利要求2所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于: 所述rsl800625位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，测序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rs2070600位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，测序引物如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求2所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:所述步骤2)中，所述PCR扩增为所述rsl800625位点和所述rs2070600位点组合进行双重PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:所述步骤3)中，对所述rsl800625位点和所述rs2070600位点组合进行双重焦磷酸测序。
6.用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的特异性扩增引物，RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
7.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID N0:4_5所示。
8.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述测序引物如SEQ ID NO:3所示，和/或如SEQ ID N0:6所示。
9.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记所述特异性扩增引物的生物素。
【文档编号】C12Q1/68GK103642920SQ201310659976
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】曾灵, 蒋建新, 杜娟, 王海燕, 顾玮, 岳彩黎 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院