鸡隐性白基因的快速鉴定方法
【专利摘要】本发明提供了一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法，包括以下步骤：步骤（1）提取待鉴定鸡的基因组DNA；步骤（2）以所述基因组DNA为摸板，用引物F1、引物F2、引物R1和引物R2组成的引物组合物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；F1引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，R1引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；步骤（3）将所述PCR扩增产物进行电泳，依据电泳图谱中出现的条带数及大小判定基因分型的结果。本发明能够快速、准确地鉴定出隐性白羽基因，达到缩短育种时间的目的。
【专利说明】鸡隐性白基因的快速鉴定方法
【技术领域】[0001]本发明涉及一种基因的分子鉴定方法，具体地，涉及一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法。
【背景技术】
[0002]家禽的羽色种类很多，羽色是一个品种的重要特征，我国家禽品种审定条例把稳定一致的羽毛特征作为品种审定的基本条件之一。我国肉鸡产业经过几十年的发展，已经进入了一个由量变到质变的关键时期，中国消费者不喜欢白羽鸡，中国本地优质黄羽肉鸡越来越受到消费者的青睐。在20世纪90年代，我国大量从国外引进隐性白羽鸡，主要用于与国内的鸡种进行配套，以三元杂交为主的方式生产优质黄羽肉鸡。
[0003]白羽分为二类，显性白羽和隐性白羽，其中TYR基因(酪氨酸酶基因)控制的隐性白羽是其中一种。TYR基因是一种含铜的氧化还原酶，在黑色素合成的起始过程中的一种关键的起催化作用的限速酶。隐性白羽的形成是因为在TYR基因的第四内含子插入了 7.7kb的内源白血病病毒，从而抑制了羽毛中的色素沉着。隐性白羽基因是白化基因的复等位基因，而非隐性白羽鸡是缺失了这7.7kb片段的纯合型或杂合型。
[0004]隐性白羽鸡在优质鸡配套上的应用对我国优质鸡产业的发展起到了巨大的推动作用。羽色虽为质量性状，但遗传较为复杂，传统的育种方法是根据杂交后代鸡的表型性状留种，进行测交检测，繁殖扩群等步骤，需要一个较长的过程，为了适应市场的快速变化，缩短育种时间，本方法尝试建立一种可以快速鉴定隐性白羽基因的方法，从而达到缩短育种时间的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足而提供一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法，本发明能够快速准确地鉴定出隐性白羽基因，达到缩短育种时间的目的。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现，一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法，包括以下步骤:
[0007]步骤(1)提取待鉴定鸡的基因组DNA ；
[0008]步骤(2)以所述基因组DNA为摸板，用引物F1、引物F2、引物Rl和引物R2组成的引物组合物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，Rl引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0009]步骤(3)将所述PCR扩增产物进行电泳，依据电泳图谱中出现的条带数及大小判定基因分型的结果:如果得到592bp和891bp两条PCR产物，样本为隐性白羽基因纯合子；如果仅得到460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因纯合子；如果同时得到592bp、891bp和460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因杂合子。
[0010]优选的，所述基因组DNA的提取过程具体如下:鸡翅静脉采血2ml，4000r/min离心，倒掉上部黄色血清，底部即为红细胞；取ΙΟμ I所述红细胞加入470 μ I细胞裂解液、10 μ I质量体积百分比为10%的SDS和10 μ I浓度为10mg/ml的蛋白酶K，所述细胞裂解液由 0.lmol/L NaClUOmmol/L Tris-Cl 和 ρΗ8.0 的 IOOmmoI/L EDTA 组成，55°C空气浴摇床过夜；再加入500 μ I Tris饱和酹,上下颠倒lOmin, 10000r/min离心IOmin,吸取上层水置于另一个EP管中；在吸得的上层水中加入等体积的Tris饱和酚、氯仿、异戊醇混合液，所述酹、氯仿和异戍醇的体积比为24:23 然后上下颠倒lOmin, 10000r/min离心IOmin,吸取上层水置于另一个EP管中；加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，所述氯仿和异戊醇的体积比为23:1，然后上下颠倒lOmin，10000r/min离心lOmin，吸取上层水至于另一个EP管中；加入2倍体积的_2(TC预冷的无水乙醇,横向剧烈震荡3min, 10000r/min离心10min,EP管管底可见白色DNA沉淀，倒掉上清无水乙醇；加入Iml体积比为70%的乙醇，悬浮、洗涤DNA沉淀，8000r/min离心5min,倒掉乙醇,8000r/min离心15s,吸去乙醇,将EP管倒置在滤纸上直至管中的乙醇完全蒸发掉；加50 μ I双蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，即得。
[0011]优选的，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的条件为:94°C 5min ;然后94°C 30s，55°C 30s, 72°C 55s，30 个循环；最后 72°C IOmin0
[0012]优选的，步骤(3)中，所述电泳的具体过程如下:取5μ I PCR所述扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶120V电泳15min。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明的方法中仅有4条引物，但组成了 3对，其中F1R2和F2R1是用于检测隐性白羽等位基因，FlRl用于检测有色羽等位基因，F1R2目的片段长度为891bp，F2Rl目的片段长度为592bp，FlRl目的片段长度为460bp，如果得到592bp和891bp两条PCR产物，样本为隐性白羽基因纯合子；如果仅得到460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因纯合子；如果同时得到592bp、891bp和460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因杂合子。因此，对于隐性白羽基因纯合子的鉴定起到了双重作用，更加确保鉴定结果的准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0015]图1是本方法的PCR扩增产物的电泳结果图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0017]本实施例涉及一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法，包括以下步骤:
[0018]步骤(1)提取待鉴定鸡的基因组DNA
[0019]鸡翅静脉采血2ml (采血前用496EDTA润湿注射器管壁)，4000r/min离心，倒掉上部血清(黄色)，底部即为红细胞，取10 μ I红细胞加入470 μ I细胞裂解液(0.lmol/L NaCl,I Ommo I/L Tris-Cl, 100mmol/L EDTA ρΗ8.0)、10μ1 SDS( 10%)和 10 μ I 蛋白酶 K( 10mg/ml)，55°C空气浴摇床过夜；加500 μ I Tris饱和酹,上下颠倒lOmin, 10000r/min离心IOmin,小心吸取上层水置于新的EP管中，在吸得的上层水中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(体积比为24:23:1)混合液，上下颠倒10min，10000r/min离心lOmin，小心吸取上层水置于另一个EP管中；加入等体积的氯仿、异戊醇(体积比为23:1)混合液，上下颠倒lOmin，1000Or/min离心lOmin，小心吸取上层水至于另一个EP管中；加2倍体积无水乙醇(_20°C预冷)，横向剧烈震荡3min, 10000r/min离心lOmin,管底可见白色DNA沉淀,小心倒掉上清无水乙醇；加入lml70%乙醇,悬浮、洗漆DNA沉淀,8000r/min离心5min,倒掉乙醇；8000r/min离心15s，用吸管小心吸去乙醇，将EP管倒置在滤纸上直至管中的乙醇完全蒸发掉；加50 μ I双蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，IOmin即可获得基因组DNA原液；
[0020]步骤(2)以基因组DNA为摸板，用Fl引物、F2引物、Rl引物、R2引物组成的引物组合物进行PCR扩增反应，从而得到PCR扩增产物，各个引物的核苷酸序列如下:
[0021]Fl 引物:如 SEQ ID NO:1 所示；
[0022]F2 引物:如 SEQ ID NO:2 所示；
[0023]Rl 引物:如 SEQ ID NO:3 所示；
[0024]R2 引物:如 SEQ ID NO:4 所示；
[0025]PCR 反应体系(25 μ I ^nT=Premix Taq 12.5 μ 1，引物 I μ 1*4，DNA 模版 I μ 1，水
7.5 μ 1，合计 25μ I ；
[0026]PCR 扩增反应的条件为:94°C 5min;然后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 55s，30 个循环；最后 72 °C IOmin ；
[0027]步骤(3)取5 μ I PCR上述扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶120V电泳15min，依据电泳图谱中出现的条带数及大小判定基因分型的结果:通过在插入病毒的前后端设计4条引物(3对)，其中F1R2和F2R1是用于检测隐性白羽等位基因，FlRl用于检测有色羽等位基因，F1R2目的片段长度为891bp，F2R1目的片段长度为592bp，FlRl目的片段长度为460bp，如果得到592bp和891bp两条PCR产物，样本为隐性白羽基因纯合子(aa);如果仅得到460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因纯合子(AA);如果同时得到592bp、891bp和460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因杂合子(Aa)，如图1所示。
[0028]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员·可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【权利要求】
1.一种鸡隐性白基因的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤(1)提取待鉴定鸡的基因组DNA ； 步骤(2)以所述基因组DNA为摸板，用引物F1、引物F2、引物Rl和引物R2组成的引物组合物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，Rl引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，R2引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 步骤(3)将所述PCR扩增产物进行电泳，依据电泳图谱中出现的条带数及大小判定基因分型的结果:如果得到592bp和891bp两条PCR产物，样本为隐性白羽基因纯合子；如果仅得到460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因纯合子；如果同时得到592bp、891bp和460bp的PCR产物，样本为非隐性白羽基因杂合子。
2.根据权利要求1所述的鸡隐性白基因的快速鉴定方法，其特征在于，所述基因组DNA的提取过程具体如下:鸡翅静脉采血2ml，4000r/min离心，倒掉上部黄色血清，底部即为红细胞；取10 μ I所述红细胞加入470 μ I细胞裂解液、10 μ I质量体积百分比为10%的SDS和10 μ I浓度为10mg/ml的蛋白酶K,所述细胞裂解液由0.lmol/L NaCl、10mmol/L Tris-Cl和pH8.0的100mmol/L EDTA组成，55°C空气浴摇床过夜；再加入500 μ I Tris饱和酚，上下颠倒lOmin，10000r/min离心lOmin，吸取上层水置于另一个EP管中；在吸得的上层水中加入等体积的Tris饱和酚、氯仿、异戊醇混合液，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为24:23:1，然后上下颠倒10min，10000r/min离心lOmin，吸取上层水置于另一个EP管中；加入等体积的氯仿、异戊醇混合液，所述氯仿和异戊醇的体积比为23:1，然后上下颠倒lOmin，10000r/min离心lOmin，吸取上层水至于另一个EP管中；加入2倍体积的_20°C预冷的无水乙醇，横向剧烈震荡3min，10000r/min离心lOmin，EP管管底可见白色DNA沉淀，倒掉上清无水乙醇；加入Iml体积比为70%的乙醇，悬浮、洗涤DNA沉淀，8000r/min离心5min，倒掉乙醇，8000r/min离心15s，吸`去乙醇，将EP管倒置在滤纸上直至管中的乙醇完全蒸发掉；加50 μ I双蒸水，置55°C水浴中至DNA完全溶解，即得。
3.根据权利要求1所述的鸡隐性白基因的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的条件为:94°C 5min ;然后94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 55s, 30个循环；最后72°C IOmin。
4.根据权利要求1所述的鸡隐性白基因的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述电泳的具体过程如下:取5μ I PCR所述扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶120V电泳15min。
【文档编号】C12Q1/68GK103667486SQ201310659568
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】汤琳琳 申请人:上海市农业科学院