采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法，其中该方法包括芜菁花叶病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和实时浊度检测以及电泳检测，确定样品是否带有TuMV病毒。本发明根据芜菁花叶病毒的基因保守区设计了RT-LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测芜菁花叶病毒的方法。为芜菁花叶病毒的快速检测提供了新的手段。
【专利说明】采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒学【技术领域】，特别是涉及一种采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法。
【背景技术】
[0002]芜菁花叶病毒是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的成员之一，其寄主范围很广，可侵染43科156属的300多种植物，包括油菜、白菜、甘蓝、花椰菜等重要蔬菜，平均每年可造成蔬菜减产5-10%。该病害危害严重及防治困难，一直是蔬菜生产上的一个重要问题。要防治病毒病首先要对症下药。关于该病毒的检测方法，目前普遍采用的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、血清学技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。
[0003]环介导等温核酸扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增祀序列(Notomietal,2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据芜菁花叶病毒基因保守区设计了 LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测芜菁花叶病毒的方法。为芜菁花叶病毒的快速检测提供了新的手段。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法，其中该方法包括芜菁花叶病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和实时浊度检测以及电泳检测，确定样品是否带毒，所述RT-LAMP反应采用的引物组如下:
[0005]引物组，用于TuMV病毒的RT-LAMP反应:
[0006]外引物(F3和 B3):
[0007]SEQ ID N0.1:5’ -CGGAACCTCCCCGAACAT-3’:
[0008]SEQ ID N0.2:5’ -ATCGAGCTAAGCTCATGTCG-3’:
[0009]内引物(FIP和 BIP):
[0010]SEQ ID N0.3:5’ -GTTTGGCGTGGTCAATGAGCGAAACGGAATGTGGGTGATGA-3’:
[0011]SEQ ID N0.4:5’ -GGCCCATTTCAGTGACGTAGCTCTGAAGACCATATCGTGGCA-3’:
[0012]在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法，其包括如下步骤:
[0013]I)病毒总RNA的提取:
[0014]提取待测样品的总RNA ；
[0015]2) RT-LAMP 反应:[0016]使用外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；
[0017]3)浊度检测:
[0018]对扩增产物进行浊度观察，确定样品是否感染所述病毒；
[0019]4)电泳检测:
[0020]对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，确定样品是否感染TuMV病毒。
[0021]在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒的方法，其包括如下步骤:
[0022]I)病毒总RNA的提取:
[0023]提取待测样品的总RNA;
[0024]2) RT-LAMP 反应:
[0025]使用外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；
[0026]3)浊度观察:
[0027]对扩增产物进行浊度观察，确定样品是否感染所述病毒；
·[0028]4)电泳检测:
[0029]对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，确定样品是否感染TuMV病毒。
[0030]在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中使用的引物浓度比例为:外引物(F3和B3):内引物(FIP和BIP) =0.2-0.4:1.2-1.6 ;优选地，外引物(F3和 B3):内引物(FIP 和 BIP) = I:4o
[0031]在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的反应温度优选为50-62°C ;使用的反应温度更优选为62°C。
[0032]在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的Mg2+浓度优选为高于或等于5mM，更优选为5mM。
[0033]芜菁花叶病毒病常与其它病毒复合侵染，本发明经过优化和摸索实验条件建立了芜菁花叶病毒的RT-LAMP检测方法，极大地提高检测效率，降低检测成本。本发明的方法具有快速、灵敏、高度特异性等特点。本发明的方法已经成功地应用于室内和田间芜菁花叶病毒病害复合侵染的同步检测。本发明证明了 RT-LAMP是一种检测植物病毒的有效手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1:RT_LAMP实时浊度检测反应体系灵敏度；
[0035]图2:RT-LAMP反应结果浊度观察图；
[0036]图3 =RT-LAMP反应结果琼脂糖凝胶电泳图，Ml:DM2000,1-6:pMD18-T_TuMV质粒稀释 Ing / μ l、100pg / μ l>10pg / μ l>lpg / μ l>100fg / μ l>10fg / μ I 做模板，7:阴性对照；
[0037]图4 =RT-PCR 结果电泳图，Ml:DM2000,1-6:pMD18-T_TuMV 质粒稀释 Ing / μ 1、IOOpg / μ 1、IOpg / μ 1、Ipg / μ 1、IOOfg / μ 1、IOfg / μ I 做模板，7:阴性对照；【具体实施方式】
[0038]为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。
[0039]材料与试剂
[0040]油菜健康叶片，病株叶片分别采自中国陕西杨凌、安康、汉中等地，采集叶片保存于-80°C冰箱中。
[0041]主要试剂:
[0042]Bst DNApolymerase 购自 NEB 公司；
[0043]Betaine, MgSO4 购自 Sigma 公司；
[0044]RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；
[0045]M-MLV反转录酶购自Promega公司；
[0046]Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；
[0047]SYBR Green I 购自 Invitrogen 公司；
[0048]大肠杆菌(Escherichia,coli) JM109, DNA 标准 Markerl 购自 Voson 公司；
[0049]胶回收试剂盒购自Bioteke公司。
[0050]实施例1
[0051]1.引物设计
[0052]首先本发明人从NCBI上下载了芜菁花叶病毒的全基因组序列，使用Primer4.0 (http: / / primerexplorer.jp / e / v4_manual / index, html)设计了多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了引物。引物组有4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物参见SEQ ID N0.1-4。RT-PCR的引物，本发明使用庄木等的引物，参见SEQ ID N0.5-6。所有引物的信息见表1。
[0053]表1引物序列SEQ ID N0.1-4的信息:
[0054]
【权利要求】
1.一种采用反转录环介导等温扩增技术检测芜菁花叶病毒(TuMV)的方法，其中该方法包括芜菁花叶病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和实时浊度检测以及电泳检测，所述RT-LAMP反应采用的引物组如下: 引物组，用于TuMV病毒的RT-LAMP反应: 外引物(F3和B3):
SEQ ID N0.1:5’ -CGGAACCTCCCCGAACAT-3’:
SEQ ID N0.2:5’ -ATCGAGCTAAGCTCATGTCG-3’: 内引物(FIP和BIP):
SEQ ID N0.3:5’-GTTTGGCGTGGTCAATGAGCGAAACGGAATGTGGGTGATGA-3’:
SEQ ID N0.4:5’ -GGCCCATTTCAGTGACGTAGCTCTGAAGACCATATCGTGGCA-3’:。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述引物组包含所述全部4组引物SEQ ID N0.1-4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中该方法包括如下步骤: 1)病毒总RNA的提取: 提取待测样品总RNA` ；
2)RT-LAMP 反应: 使用外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行RT-LAMP反应，得到扩增产物； 3)浊度检测: 对扩增产物进行浊度观察，确定样品是否感染所述病毒； 4)电泳检测: 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，确定样品是否感染TuMV病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中使用的引物浓度比例为:外引物(F3和B3):内引物(FIP和BIP) =0.2-0.4:1.2-1.6。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的引物浓度为外引物(F3和B3):内引物(FIP和BIP) =1:4。
6.权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的反应温度为50-62。。。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中，TuMV引物使用的反应温度为62°C。
8.权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的Mg2+浓度为高于或等于5mM。
9.权利要求8所述的方法，其中RT-LAMP反应中的Mg2+浓度为5mM。
【文档编号】C12Q1/68GK103789449SQ201310659524
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】赵磊, 郝兴安, 吴云锋 申请人:西北农林科技大学