专利名称：一种抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抗草甘膦EPSP合成酶及其编码基因与应用，特别涉及一种人工改造合成的抗草甘膦EPSP合成酶及其编码基因GmEPSPS，以及含有该基因的表达载体及其在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。
背景技术：
草甘膦是一种内吸传导非选择性、广谱灭生性除草剂，具有理化性质稳定、高效、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。其相关作用机理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易结合形成EPSP-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，阻止PEP与EPSP合成酶的结合，这样草甘膦就竞争性 抑制莽草酸途径中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，干扰生物体内芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，导致生物死亡。植物可以通过转化导入对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和沙门氏菌CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。随着抗除草剂基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点(1)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，并形成了有机物质来锁住土壤碳并减少二氧化碳排放；同时减少机械耕作，节约燃料能源；(2)减少除草剂总使用量，使防治杂草费用下降，有效地降低农业成本，增加农产品的经济效益；解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛；小麦田的雀麦、莎草；大豆田的鸭趾草、纯叶决明以及寄生杂草；(4)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。从1996年转基因作物首次商业化至今，耐除草剂性状始终是转基因作物的主要性状。在2011年，转基因作物耐除草剂性状被运用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，种植面积为9390万公顷，占全球转基因作物种植面积的59%，比占全球转基因作物面积15%的抗虫品种(2390万公顷)高出很多，这其中大部分为抗草甘膦转基因作物品种。因此近年来包括美国和中国在内的国家草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积推广有直接的关系。我国在转基因草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。中国发明专利03826892. 2公开的一种来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的抗草甘膦基因(EPSPS基因),但由于其来源于细菌,细菌密码子偏好性与植物有较大差异，将来自细菌的EPSPS基因直接转化植物，其表达效率较低，因此，本领域有必要对来自微生物的抗草甘膦基因进行人工改造，以保证抗草甘膦基因能够在植物体内高效稳定表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗草甘膦蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，名称是GmEPSPS，(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列I的第73-504位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白质。其中，(a)所限定的蛋白为GmEPSPS的成体蛋白，不含转运肽序列；(b)所限定的蛋白为5'端带有矮牵牛CTP4叶绿体转运肽的GmEPSPS的中间体蛋白。
上述(C)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。序列表中序列I由504个氨基酸残基组成。为了便于GmEPSPS蛋白的纯化，可在由序列表中序列I的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表标签的序列
权利要求
1.蛋白质，是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I的第73-504位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子是编码权利要求I所述蛋白质的基因；所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)编码序列为序列表中序列2的第677至1975位核苷酸所示的DNA分子； 2)编码序列为序列表中序列2的第461至1975位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2的第7至1975位核苷酸所示的DNA分子； 4)序列表中序列2所示的DNA分子； 5)在严格条件下与I)-4)中任一限定的DNA分子杂交且编码权利要求I所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子或玉米Ubi-I启动子。
7.权利要求I所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用 al)调控植物或微生物抗草甘膦功能； a2)选育抗草甘膦植物或微生物品种。
8.一种培育抗草甘膦功能提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求I所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗草甘膦功能提闻。
9.一种培育抗草甘膦功能提高的转基因微生物的方法，包括将编码权利要求I所述蛋白质的基因导入目的微生物中的步骤；所述转基因微生物与所述目的微生物相比，抗草甘勝功能提闻。
10.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述微生物为大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种抗草甘膦蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)(a)由序列表中序列1的第73-504位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的GmEPSPS蛋白及其编码基因对草甘膦除草剂具有显著的抗性效果，实验证明转GmEPSPS基因烟草和转GmEPSPS基因玉米在0.15%草甘膦作用下仍能正常生长，而未转基因的烟草或玉米生长明显受抑制，叶片出现发黄、枯萎。这表明GmEPSPS能够在植物中稳定高效表达，进而用于生产抗草甘膦转基因植物。
文档编号C12N1/15GK102766609SQ20121019650
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者李新海, 杨小艳, 林清, 翁建峰, 谢树章, 雷开荣 申请人:中国农业科学院作物科学研究所, 重庆市农业科学院