昆虫抗性转基因草坪草的制作方法

专利名称：昆虫抗性转基因草坪草的制作方法
技术领域：
本发明包括一种转基因草坪草，该种植物具有攻击草坪草的某种昆虫的 抗性。本发明也包括产生昆虫抗性转基因草坪草的方法。本发明还提供了 转基因草的应用，来保护草坪使之免于昆虫攻击。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌是芽孢型，棒状，革兰氏阳性细菌，与所说的蜡样芽胞 杆菌相近。我们发现了大量的苏云金芽胞杆菌菌株，它们组成了苏云金芽 胞杆菌亚种，如苏云金芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种，苏云金
芽胞杆菌鲇泽亚种等等，这是根据最初由Bonnefoi和de Barjac于1963 年提出的分类方案来分类的。苏云金芽胞杆菌在细胞内晶体的产生上，明 显区别于其它的芽胞杆菌，这些晶体是不溶性蛋白质沉淀物，其中许多对 于不同种类的昆虫具有杀虫的活性。在孢子形成的过程中，苏云金芽胞杆 菌合成大量这种蛋白质，然后这些蛋白质结晶成许多类型的晶体。
苏云金芽胞杆菌中编码这种晶体蛋白的基因，由于其晶体产生的表现型 被称为"cry"。随后被命名为crylAa的第一个cry基因是由Schn印f和 Whiteley约在20年前克隆的(1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78， 2893-2897)。此后，发表了许多其它的cry基因克隆的报告。
苏云金芽胞杆菌产生了许多种晶体蛋白，其在对昆虫的专一性是不同 的，甚至在一个菌株内也是不同的。大多数苏云金芽胞杆菌产生晶体杀虫 蛋白对于抵抗鳞翅类是很有效的。另外，有一种苏云金芽胞杆菌菌株，它 能产生具有能抵抗双翅目和鞘翅目类昆虫的晶体杀虫蛋白。在苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白中，己经知道Cry3， Cry7， Cry8， Cry9， Cry43对于抵抗 鞘翅目类昆虫是有效的。其中，据报道Cry8Ca对于抵抗金龟子是有效的 (0hba et al. ， 1992， J. Appl. Microbiol. 14， 54-57) 。 2003年，Asano 等人(2003， Biological Control 28 (2003)， 191-196)发现了一种新的苏 云金芽胞杆菌菌株，叫做SDS-502，它对于抵抗金龟子类的古铜丽金龟，东 方丽金龟，和豆金龟子显示出非常高水平的有效性。豆金龟子， 一种日本丽 金龟，在美国有着特别的重要性。它偶然的被引入了美国，变成了一种对 于草地和公园植物种类如观赏性植物严重有害的昆虫。这种昆虫的幼虫食 草根，这会导致对草坪草的严重毁坏。成年日本丽金龟食不同的庄稼和包 括玫瑰和草莓类植物的观赏植物。这个基因对于SDS-502菌株的高郁李抗 性是非常重要的，它已经被分离出来，被命名为cry8Da。编码cry8Da这个 基因的蛋白质被发现具有抵抗日本丽金龟的高比活性，它至少是Cry8Ca和 Cry43Aa比活性的两倍高，Cry8Ca和Cry43Aa是两种其它的苏云金芽胞杆 菌，它们具有日本丽金龟和其它甲虫抗性的晶体蛋白。
最近，采用所选的苏云金芽胞杆菌cry基因在庄稼植物中表达来进行昆 虫防治。从表达crylAb基因的玉米和表达crylAc基因的棉花中获得了技 术和商业上的成功。然而，据报道无论是转基因草坪草还是观赏植物都不 具有这种昆虫抗性。有报道称，经转化的草坪草具有真菌抗性和除草抗性 (e.g., Cho， et al. ， 2000， Plant Cell R印orts 19, 1084-1089)，但是 没有表明草坪草或观赏植物的转化。这是因为其中有许多未解决的难题。 例如，在高活性草坪草细胞中，高转化率对于引入昆虫抗性是非常重要的， 但是，技术上的难题阻碍了成功转化草坪草细胞的进行。此外，高效率的 从转化细胞再生成完整植物对于产生一个抵抗幼虫和成年日本丽金龟的转 基因草坪草和转基因观赏植物是也是具有决定性的。这两点证明了产生一
9个完整的转基因草坪草植物或完整的观赏植物的过程中，存在一些严重的 技术上的困难，阻碍了过程的发展。
此外，技术上的困难还体现在产生可转化植物细胞或愈伤组织上，缺乏一 个有效的昆虫抗性基因，特别是一个高效抵抗圣甲虫类昆虫的基因，这个 困难是产生昆虫抗性转基因草坪草和其它观赏植物另外一个主要的障碍。
本专利的一个申请者发现了苏云金芽胞杆菌的一个cry基因，cry8Da，它 编码一个对金龟子有高效抗性的蛋白质(参见U. S. Patent Application No. 20030017967，该文献通过引用而被合并于此)。本发明克服了产生了具有 昆虫抗性的转基因草坪草技术上的困难，证明了昆虫抗性可以引入草坪草， 接下来这种转化的草坪草具有生长成具有昆虫抗性的完整植物的能力。

发明内容
本发明包括一种转基因草坪草，该种植物具有攻击草坪草的某种昆虫的 抗性。本发明也包括产生昆虫抗性转基因草坪草的方法。本发明还提供了 转基因草的应用，来保护草坪使之免于昆虫攻击。
本发明采用了一种方法，这种方法能产生具有再生成完整草坪草植物的 能力的高效(可转化)草坪草愈伤组织。
在另一个实施例中，提供了具有昆虫抗性基因cry8Da转基因草，这是 在苏云金芽胞杆菌SDS—502菌株中发现的。
在一个实施例中，提供了不同的苏云金芽胞杆菌昆虫抗性基因，用来转 化成活性草愈伤组织。这些苏云金芽胞杆菌基因与抵抗不同昆虫种类昆虫 抗性作比较。cry8Da基因对于金龟子具有专一性，另一个苏云金芽胞杆菌 基因crylCa与粘虫复合物，如甜菜粘虫的抗性作比较，在本发明中也发现 了其应用。
在另一个实施例中，提供了区别转化草细胞和非转化细胞的不同标记。
10在另一个实施例中，提供了一个含有昆虫抗性基因的转基因草坪草。这
个昆虫抗性基因可以从苏云金芽孢杆菌中获得，例如，cry8Da是来自苏云 金芽孢杆菌SDS502菌株。
在另一个实施例中，昆虫抗性基因与选自南部蒙面金龟子，无斑金龟； 草坪草蒙面金龟子，多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿金 龟；玫瑰金龟子，蔷薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子；棕色金龟 子,雌性金龟子；栗褐色金龟子,斑喙丽金龟；东方丽金龟，东方异丽金龟；日 本丽金龟，豆金龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟；绿金龟，古铜异丽金龟；黑 草坪草金龟,黑绒金龟；贪夜蛾，甜菜夜蛾；粘虫,美洲粘虫；土蚕,球菜夜蛾； 杂色地老虎,杂色夜蛾；颗粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾,麦牧野螟；西方 菌苔蛾，西方草螟；和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟中的昆虫抗性作比较。
昆虫抗性基因可以从对草坪草有害昆虫致病的细菌中获得。在一个实 施例中，这个基因可从选自苏芸金芽胞杆菌，日本甲虫芽胞杆菌，如缓死 芽孢杆菌(Paenibacilluslentimorbus)，幼虫芽孢杆菌菌株的微生物中获得。
这种昆虫抗性基因可编码对昆虫活性蛋白质，可从以下基因选择， CrylAal, CrylAa2， CrylAa3， CrylAa4， CrylAa5， CrylAa6， CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO， CrylAall， CrylAal2， CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl， CrylAb2， CrylAb3， CrylAb4， CrylAb5, CrylAb6， CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAblO， CrylAbll， CrylAbl2， CrylAbl3， CrylAbl4， CrylAbl5， Cry固6， CrylAcl， CrylAc2, CrylAc3, CrylAc4， CrylAc5， CrylAc6， CrylAc7， CrylAc8， CrylAc9， CrylAclO， CrylAcll， CrylAcl2， CrylAcl3， CrylAcl4， CrylAcl5， CrylAdl， CrylAd2， CrylAel， CrylAfl， CrylAgl， CrylAhl， CrylAil， CrylBal， CrylBa2， CrylBa3， CrylBa4, CrylBbl， CrylBcl， CrylBdl, CrylBd2， CrylBel， CrylBe2， CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal，CrylCa2，CrylCa3，CrylCa4，CrylCa5，
CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8，CrylCa9，CrylCalO，CrylCbl，CrylCb2，
CrylDal，CrylDa2，CrylDbl，CrylDb2，CrylEal，CrylEa2，CrylEa3，
CrylEa4，CrylEa5，CrylEa6,CrylEbl，CrylFal，CrylFa2，CrylFbl，
CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4，CrylFb5,CrylGal，CrylGa2，CrylGbl，
CrylGb2,CrylGc，CrylHal，CrylHbl,Cryllal，Crylla2，Crylla3，
Crylla4，Crylla5，Crylla6，Crylla7,Crylla8,Crylla9，CrylIalO，
Cryllall，Cryllbl，Cryllcl，Cryllc2，Crylldl，Cryllel，Cryllfl，
Cryljal，Cryljbl，Cryljcl，Cryljc2，Cryljdl，CrylKal，Cry2Aal，
Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5,Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，
Cry2Aa9，Cry2Aal0，Cry2Aal1Cry2Abl，Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，
Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Acl，Cry2Ac2，Cry2Ac3，Cry2Adl，Cry2Ael，
Cry3Aal，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，Cry3Aa5，Cry3Aa6,Cry3Aa7，
Cry3Bal，Cry3Ba2，Cry3Bbl，Cry3Bb2，Cry3Bb3，Cry3Cal，Cry4Aal，
Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2，Cry4Ba3，Cry4Ba4,Cry4Ba5，
Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal，Cry6Aal，Cry6Aa2，Cry6Bal，
Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal，Cry8Bal，Cry8Bbl，Cry8Bcl，
Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2，Cry8Da3，Cry8Eal，Cry9Aal，
Cry9Aa2,Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2，Cry9Dal，Cry9Da2，Cry9Eal，
Cry9Ea2，Cry9Ebl，Cry9Ecl， CrylOAal， CrylOAa2，(二rylOAa3，CryllAal，
CryllAa2,CryllAa3，CryllBal，CryllBbl， Cryl2Aal，Cryl3Aal，
Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，Cryl7Aal， Cryl8Aal，Cryl8Bal，
Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，Cry20Aal， Cry21Aal，Cry21Aa2，
Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，Cry22Abl， Cry22Ab2，Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，Cry26Aal，Cry27Aal，Cry28Aal，
Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，Cry30Bal，，Cry31Aal，Cry31Aa2,
Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，Cry32Dal，Cry33Aal，Cry34Aal，
Cry34Aa2，Cry3杨l，Cry34Acl，Cry34Ac2，Cry34Bal，Cry35Aal，
Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，Cry35Acl，Cry35Bal，Cry36Aal，
Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，Cry40Aal，Cry40Bal，Cry41Aal，
Cry41Abl，Cry42Aal， Cry43Aal， Cry43Bal， Cry楊a， Cry45Aa，Cry46Aa，
Cry47Aa， CytlAal， CytlAa2， CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal， Cyt2Aal， Cyt2Aa2， Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5， Cyt2Ba6， Cyt2Ba7， Cyt2Ba8， Cyt2Ba9， Cyt2Bbl， Cyt2Bcl， Cyt2Cal， Vip3A(a) and Vip3A(b). and Vip3a(b)。
这种昆虫抗性基因可从选自沙雷菌类，发光杆菌类和致病杆菌类的微 生物中获得。这种沙雷菌类包括变形斑沙雷菌，嗜虫沙雷氏菌，荧光假单 孢菌，嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌。
这种昆虫抗性基因可包括来自于苏云金芽孢杆菌蓓蓓(buibui)菌株 的cry8Ca基因，来自于日本甲虫芽胞杆菌或苏云金芽孢杆菌crylCa基因 的cry43A基因。
本发明进一步指出了通过将一种或多种昆虫抗性基因引入到草坪草 中，来减少或消除任何喷射到草坪草上化学或生物上杀虫剂的方法。
这种转基因草坪草可以选自碱地鼠尾粟(Sporobolus airoides); 窄颖赖草(Leymus angustus) ^ 多花黑麦草(Xolium multiflorum) 5 百 喜草(Paspalum notatum);披碱草杂交的大麦(Elyhordeum);狗牙根 (Cynodon dactylon) 须芒草(AndropogorO ;雀麦(Bromus) 5黍(Panicum miliaceum);冈!j夷竹(Microstegium);养麦(Eriogonum);野牛草(Buchloe
13dactyloides) 喜湿薦草(Phalaxis叫uatica) 5力口州雀麦 (California brome);阿拉斯加雀麦(Bromus sitchensis);加拿大早熟禾(Poa compressa); 金黄草(Phalaxis); 紫羊茅(Festuca rubra); 草
(Echinochloa) 5剪股颖(rostis tenuis) 5大麦(Hordeum vulgare); 小麦(Triticum aestivum);匍每剪股颖(Agrostis stolonifera); 苹 状看麦娘(Alopecurus arundinaceus);扁禾惠冰草(Agropyron cristatum); 披碱草(Elymus dahuricus); 毛花雀稗(Paspalum dilatatum);羊茅
(Festuca); 丝状疣羊茅(Festuca filiformis);糝子(Eleusine coracana) 鸭茅状磨擦禾(Tripsac咖)5甜高粱(Sorghum bicolor); 牧草(Bouteloua); 无芒雀麦(Bromus stamineus) 硬羊茅(Festuca trachyphylla);假高粱(Sorghastrumnutans) 5中间偃麦草(Thinopyxum intermedium); 食用稗(Echinochloa esculenta); 草地早熟禾 (Poa pratensis) 5 狼尾草(Pennisetum clandestinum) ^ 杂色黍(Panicum coloratum); 知风草(Eragrostis); 多毛雀麦Bromus coramutatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原看麦娘(Alopecurus pratensis); 草地黑麦草(Lolium pmtense);粟草(Milium);燕麦(Avena);鸭 茅(Dactylis glomerata); 黑黍(Pennisetum americanum); 多年生黑 麦草(Lolium perenne) 5 草原草(Bromus wildenowii) 5 北美草原牧 草(Koeleria macrantha) 5 鼠尾羊茅(Vulpia myuros);紫羊茅(Festuca rubra);小糠草(Agrostis gigantea);哈定草(Phalaris axundinacea); 粗莲早熟禾(Poa trivialis) 5 高冰草(Thinopyrum ponticum) 5俄罗 斯新麦草(Psathyrostachys juncea); 黑麦(Secale cereale); 黑麦 草(Lolium) 5 羊茅(Festuca ovina); 紫羊茅(Festuca rubra) 5 籽 粒苋(Bromus inermis);双色高粱(Sorghum bicolor);河边冰草(Elymuslanceolatus);苏丹草(Sorghum bicolor);賴卩枝稷(Panicum virgatum); 高羊茅(Xolium arundinaceum); 高燕麦草(Arrhenatherum elatius) 5 长穗偃麦草(Thinopy羅ponticum); 猫尾草(Phleum pratense);小 黑麦(Triticosecale rimpaui); 发草(Deschampsia caespitosa); 蓝茎冰草(Pascopyrum smithii); 小麦(Triticum);芽草(Agropyron) 和披碱草(Elymus)。
在另一个实施例中，产生昆虫抗性草坪草的方法包括a)将包含一个 或多个昆虫抗性基因的一个或多个质粒引入一个或多个草坪草愈伤组织， 其中所述的愈伤组织是转化物；b)培养愈伤组织；c)愈伤组织生长为成 熟的草坪草；d)测试成熟草坪草的昆虫抗性。
详细说明
A发明概况
本发明提供了来自不同杆菌微生物如来自苏云金芽孢杆菌SDS-502菌 株的cry8Da基因的昆虫抗性基因转化而来的转基因草坪草和观赏植物。最 终转化的草坪草和观赏植物具有了昆虫捕食抗性。本发明还提供了来自于 杆菌微生物如由SDS—502菌株的cry8Da基因的昆虫抗性基因转化而来的 草坪草和观赏植物的方法。
杀虫晶体蛋白如cry8Da是大量蛋白的聚集物(约130 149k道尔顿)， 实际上，它是一个原毒素，它必需经过活化才能起作用。在正常条件下， 这个晶体蛋白是高不溶解的，所以一般来讲，它对人类，高等动物和大多 数昆虫是安全的。然而，在高PH (约^=9.5以上)的还原条件下，它是 可溶的，这个条件通常存在于鳞翅类幼虫的中肠中。因此，苏云金芽孢杆 菌的晶体蛋白是高度专一的杀虫剂。
一旦它在昆虫的肠中溶解，这个原毒素由肠蛋白酶分开生产约60k道尔顿的活性毒素。这个毒素术语叫A-内毒素。它连接中肠上皮细胞，在细
胞膜上产生小孔来保持离子平衡。因此，肠道迅速被固定化，上皮细胞溶 解，幼虫停止生长，经由血液PH平衡，肠道PH降低。
转基因植物如由编码杀虫蛋白的基因如cry8Da基因转化的草坪草和观 赏植物通过表达这个晶体蛋白来抵抗昆虫侵袭和捕食以得到保护，晶体蛋 白的作用与晶体蛋白作为植物生物杀虫剂的外源应用是一样的。这样，昆 虫抗性与转基因植物作比较，结果表明，野生植物很正常的成为昆虫喜欢 捕食的目标。
B常规技术
本发明的实践应用除了特别指出的，将广泛应用分子生物学，微生物 学细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，这些在技术的技能之内。 这些技术在文献中已经完全解释说明了，例如，在细胞生物学中实验手 册(J.E. Cellis， ed.， 1998);分子生物学最新实验指导(F. M. Ausubel et al.， eds， 1987); 分子生物学精编实验指南(Wiley and Sons， 1999)。 此外，商业上采用的测试试剂盒和试剂的实验操作完全根据实验册规定的 操作方法来操作，除了特别指出的。
C定义
此处采用的"外源DNA片段"，"异源序列"，"异源核苷酸"或"异 源基因"是来自于与特定宿主细胞或生物体不同的来源，或者说，如果来 自于相同的来源，多聚核苷酸或氨基酸序列就要被修改。因此， 一个宿主 细胞或生物体的异源基因包括特定宿主细胞的一个内源基因，但是它必需 来自于不同的来源或者被修改。本发明异源序列的修改是通过不同DNA片 段连接到一起来构建一个异源基因。或者是一个异源基因可由核苷酸合成 来产生。这个术语指的是一个DNA片段，这个片段是细胞外来的或异源的，或细胞同源的，或在通常不存在元素的宿主细胞核苷酸内的一个异源和同
源基因序列的联合体。当外源DNA片段被表达时，它们产生外源多肽。
术语"基因"被广泛应用，指的是与生物体功能有关的任何DNA片段。 基因包括需表达的编码序列或调节序列，还有具有组合功能的序列，如本 发明中的例子，两个基因经由一个连接序列合并来构建一个单个新基因， 这个基因具有许多复杂的生物功能。基因也包括非表达的DNA片段，这片 段具有许多种表达如其它蛋白质的识别序列基因的功能。基因可由许多种 来源来获得，包括目的基因的克隆，如任何活体，或由已知或推测序列信 息合成，还包括根据所希望获得的特性来设计的人工序列。
术语"转基因"，当它用于描述一个细胞或多细胞生物体时，指的是 这个细胞或生物体复制了一个异源核苷酸或表达了由异源核苷酸编码的一 个肽或蛋白质。转基因细胞或生物体可含有细胞本身(非重组体)不存在 的基因。转基因细胞和生物体除了被修改和由人工方式再导入的基因还可 以含有细胞或生物体本身就有的基因。这个术语也包含了含有以不将核苷 酸从细胞或生物体移除的形式修改的细胞内源性核苷酸的细胞或生物体； 这种修改包括由基因替代，定点变异和相关技术来获得。
术语"昆虫抗性"意思是与抵抗有害昆虫攻击(例如，细胞或多细胞 生物体的昆虫侵袭或昆虫捕食)相对照的一种基因，细胞或多细胞生物体 的一种特性。这种特性包括杀虫，击退昆虫和抑制昆虫捕食的能力。在昆 虫抗性的例子中，包括的特性有由于植物产生的一种或多种昆虫活性(例 如，杀虫的或昆虫顿态)复合物，或由植物产生的一种或多种驱虫剂或喂 食抑制剂复合物，有害昆虫不以植物为食。
术语"昆虫活性"在此的意思是一种具有杀虫，抵抗昆虫或抑制昆虫 喂食能力的基因，这是蛋白质的一种特性。它指的是对某种昆虫具有非常高的专一性或者具有一个广普的活性。在广谱昆虫活性基因或蛋白的例子 中，这种活性指的是植物能以许多种昆虫种类为目标或者说对这些昆虫具 有抵抗的活性，甚至对于非昆虫类如蜘蛛也有抵抗的活性，但是它必需具 有抵抗某种种类昆虫的能力，这是本发明预期到达的目标，使得草坪草和 观赏植物免于昆虫的攻击。 D本发明的方法和应用
本发明涉及到具有有害昆虫抗性的转基因草坪草的生产和应用。
采用一些不同的方法，本发明产生了许多具有很强抵抗金龟子攻击转
基因草坪草的能力，但是本发明的方法和应用并不是有限的，它还适用于
其它适合的昆虫抗性基因转化的草坪草对有害昆虫的控制。
为了产生昆虫抗性转基因草坪草，申请者改善了产生转化草坪草愈伤
组织的效率和由转化的愈伤组织再生成完整植物的效率。申请者开展了不
同培养条件的广泛调査，发现高效率产生一些昆虫抗性转基因片段活性愈
伤组织的一些条件。为了产生昆虫抗性转基因草坪草，申请者采用了以一
个合理的速率产生高效活性能再生的草愈伤组织的条件。申请者的没有转 基因草具有昆虫抗性活性的实验和事实指出可以再生成完整植物的高活性
(例如，可转化的)草坪草愈伤组织的诱导是一个重要的突破。
在一个实施例中，采用两个载体来转化活性草坪草。在一个载体中，
pBI221， 一个昆虫活性基因连同花椰菜花叶病毒35S启动子和根癌农杆菌 Ti质粒胭脂碱合成酶终止子一起被克隆。应当注意，除了 pBI221以外，许 多载体可以在它们整合到宿主植物基因的时候采用，这个在载体中被克隆 的昆虫抗性基因具有一个适合的启动子和终止子。任何一个转化载体的适 当选择都可以由人们采用技术中的 一般技能来完成。
多数的启动子对于表达转基因植物中的一个基因是有用的。技术中熟练的技工就可以从已知的数据库中获得有用的植物启动子。例如，植物 CARE : 植物启动子和顺式调控元件的数据库在
http:〃sphinx. rug. ac. be:8080/PlantCARE/网页中有最近的明细。 (Lescot, et al. ， 2002， Nucl. Acids Res. ， 30， 325-327)
在转基因植物中表达的昆虫抗性基因可以是一个结合蛋白。例如，原 生质体靶向引导序列可添加到昆虫抗性蛋白中来。或者说，昆虫活性蛋白 可由chroloplast靶向序列结合来使基因在chroloplast中表达。
在另一个实施例中，采用了两个载体包括PBI221，另外一个载体，GFP (绿色荧光蛋白)基因与相同的35S启动子和N0S终止子一起被克隆。这 两个载体混合起来覆盖金粉。覆盖金粉的DNA由基因枪注射到活性草细胞 中。显示出绿色荧光的转化的草细胞被切开，进一步培养直到生长成完整 植物体。在这个例子中，GFP作为一个"报道"基因。当转化发生时，它由 绿色荧光蛋白报道。报道基因另一个例子是gus基因。文献报道的大肠杆 菌(EC 3.2.1.31)的葡糖苷酸酶(GUS)在转化植物中，能够作为标记基 因提供期望的特性。Gus基因和其它报道基因对于技术上熟练的人们来说是 相当了解了。
本发明不仅仅局限于选择转化草细胞的GFP报道基因。在另一个例子 中，采用了双丙氨膦除草剂抗性基因(bar)。这个方法也产生了一个昆虫 抗性草片段。这是一个采用选择基因的例子。只有转化草细胞可以在专门 的组织培养基中生存(因此所选择)。其它可以用来产生昆虫抗性转基因 草的除草剂抗性基因包括草甘磷抗性(例，3-烯酰(基)丙酮酸莽草酸5-磷 酸酶)基因，溴草腈抗性(例，溴草腈水解酶)基因，磺胺类药物抗性(例， 二氢蝶酸合酶)基因，和磺脲类抗性(例，乙酰乳酸合酶)基因。此外， 抗生素抗性基因例如卡那徽素和均霉素抗性基因也可以采用。另一方面，
19代谢相关的基因也可釆用来选择转化草细胞。例如，编码磷酸甘露糖异构
酶的大肠杆菌的manA基因(Miles et al.， 1984， Gene 32, 41-48)可以转 化甘露糖-6-磷酸为果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸接下来可被植物细胞利用。 当被放入含有唯一糖原甘露糖的培养基中时，非转化细胞又转化细胞过渡 生长。植物转化中这些选择标记基因的采用对于技术中般熟练的技工是熟 知的。
在本发明中，采用基因枪技术转化活性草坪草愈伤组织，在下文的例 子中有叙述。此外，也采用农杆菌介导，花器浸蘸法，原生质体和电穿孔 转化技术方法。这些转化方法对于技术中般熟练的技工是熟知的。
再生的完整的植物被移植到盆栽的泥土中来接收受日本丽金龟幼虫的 攻击。日本丽金龟幼虫选择性的捕食那些缺乏昆虫抗性的植物(例如，那 些没有被适合的昆虫抗性基因转化的植物)，但是它并不捕食那些由适合 昆虫抗性基因转化的植物(见下文)。比较昆虫保护的水平，由昆虫抗性 基因转化为草坪草的昆虫保护水平与采用非转化草坪草植物的化学杀虫剂 (倍硫磷)获得的保护水平一样高。
在另一个例子中，本发明证明了申请者的方法可以产生两个其它草类 的昆虫抗性转基因片段，茅花黑麦草和多年生黑麦草。
昆虫抗性草可由任何下面的草类来获得。尽管是非限制性的，适当的 列出其一般的名字和拉丁文名字，如下碱地鼠尾粟(Sporobolus airoides); 窄颖赖草(Leymus angustus); 多花黑麦草(Lolium multiflorum); 百喜草(Paspalum notatum); 大麦(Elyhordeum); 狗牙根(Cynodon dactylon); 须芒草(Andropogon); 雀麦(Bromus); 泰(Panicummiliaceum); 刚夷十亇(Microstegium); 养麦(Eriogonum); 野牛草(Buchloe dactyloides); 喜湿藹草(Phalaris叫uatica) 5 力口
20州雀麦 (California brome)， 阿拉斯力口雀麦(Bromus sitchensis); 力口 拿大早熟禾(Poa compressa); 金黄草(Phalaris); 紫羊茅(Festuca rubra); 稗草(Echinochloa); 剪股颖(rostis tenuis) 5 大麦(Hordeum vulgare); 小麦(Triticum aestivum); 匍匍剪股颖 (Agrostis stolonifera); 華状看麦娘 (Alopecurus arundinaceus); 扁稳冰 草(Agropyron cristatum) 5 披碱草(Elymus dahuricus); 毛花雀稗
(Paspalum dilatatum); 羊茅(Festuca); 丝状疣羊茅(Festuca filiformis); 糝子(Eleusine coracana); 甲鸟茅状磨擦禾(Tripsacum); 甜高粱(Sorghum bicolor); 牧草(Bouteloua); 无芒雀麦(Bromus stamineus) 5 硬羊茅(Festuca trachyphylla) 5 假高粱(Sorghastrum nutans) 5 中间偃麦草(Thinopyrum intermedium) 5 食用稗(Echinochloa esculenta) 5 草地早熟禾 (Poa pratensis) ^ 狼尾草(Pennisetum clandestinum); 杂色黍(Panicum coloratum); 失口风草(Eragrostis); 多毛雀麦Bromus commutatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原 看麦娘(Alopecurus pratensis); 草i也黑麦草(Loliumpratense); 粟 草(Milium);燕麦(Avena);鸭茅(Dactylis glomerata); 黑黍
(Pennisetum americanum) 5 多年生黑麦草(Xolium perenne) 5 草原 草(Bromus wildenowii) ^ 北美草原牧草(Koeleria macrantha) 5 鼠 尾羊茅(Vulpiamyuros); 紫羊茅(Festuca rubra); 小糠草(Agrostis gigantea) 5 哈定草(Phalaxis arundinacea) 5 禾且蓬早熟禾(Poa trivialis); 高冰草(Thinopyrum ponticum); 俄罗斯新麦草
(Psathyrostachys juncea) 5 黑麦(Secale cereale) 5 黑麦草(Xolium); 羊茅(Festuca ovina); 紫羊茅(Festuca rubra); 籽粒苋(Bromus inermis );双色高粱(Sorghum bicolor); 河边冰草(Elymuslanceolatus); 苏丹草(Sorghum bicolor) 5 柳枝稷(Panicum virgatum); 高羊茅(Lolium arundinaceum); 高燕麦草(Arrhenatherum elatius); 长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum); 猫尾草(Phleum pratense); 小 黑麦(Triticosecale rimpaui); 发草(Deschampsia caespitosa); 蓝 茎冰草(Pascopyrum smithii ); 小麦(Triticum); 芽草(Agropyron); 和披碱草(Elymus)。
一旦具有昆虫抗性特性的一个转基因草片段产生，这个特性可以由杂 交技术转移到其它草片段中，这些对于技术中一般熟练的技工是熟知的。
本发明的另一方面，草坪草的昆虫抗性由苏云金芽孢杆菌昆虫活性毒 素来完成，如下文的例子所述。在这个例子中，采用一个编码cry8Da蛋白 的苏云金芽孢杆菌基因cry8Da。这个基因被克隆到一个载体中，用来转化 来自于茅花黑麦草和多年生黑麦草活性草细胞。为了产生抵抗金龟子的草 坪草，可采用除cry8Da外的苏云金芽孢杆菌昆虫活性基因。例如，可采用 cry8Da， cryl8' s和cry43Aa。这些基因可以由苏云金芽胞杆菌日本亚种 (cry8Ca)和日本甲虫孢子杆菌，如，缓死芽孢杆菌(cryl8's和cry43Aa) 分离出来。另一个例子说明了在转化载体中怎样克隆cry43Aa。这些基因属 于苏云金芽孢杆菌cry基因种类，尽管一些来自于非苏云金芽孢杆菌(例 如cry18禾口 cry43Aa)。
其它有效抵抗金龟子的微生物的毒素包括那些来自于其它杆菌如幼虫 芽孢杆菌和来自于非杆菌细菌的。例如，沙雷菌属某种，如变形斑沙雷菌 和嗜虫沙雷氏菌(Hurst et al. ， 2004， J. Bacteriol. 186， 5116-5128); 发光杆菌，如荧光假单孢菌；(Hurst et al. ， 2004， J. Bateriol. 186， 5116-5128， and Bowen et al. ， 1998， Science, 280, 2129—2132)，和 致病杆菌如嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌(Brillard et al.， 2001， Appl.Environ. Microbiol" 67， 2515-2525)，这些是已知的用来产生对昆虫致 病的蛋白，在本发明中打算采用。
申请者发明的范围不仅仅局限于金龟子。贪夜蛾和甜菜夜蛾是很有害 的草坪草害虫。采用本发明的方法，鳞翅类的昆虫抗性可被导入到草坪草
中。这个昆虫活性基因可从苏云金芽孢杆菌中分离出来，并在草坪草中表 达来产生一种或多种昆虫活性蛋白。例如，本发明打算采用下面的苏云金
芽孢杆菌昆虫活性蛋白，包括::CrylAal，CrylAa2，CrylAa3，CrylAa4，
CrylAa5，CrylAa6，CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO，CrylAal 1，
CrylAal2，CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl，CrylAb2，CrylAb3，CrylAb4，
CrylAb5,CrylAb6，CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAbl0，Cry固l，
Cry固2，CrylAbl3,,CrylAbl4,Cry脂5， CrylAbl6，CrylAcl，CrylAc2，
CrylAc3，CrylAc4，CrylAc5，CrylAc6，CrylAc7，CrylAc8，CrylAc9，
Cry 1 Ac 10，CrylAcll,,CrylAcl2，CrylAcl3，CrylAcl4，CrylAcl5， CrylAdlCrylAd2，CrylAel，CrylAfl，CrylAgl，CrylAhl，CrylAil，CrylBal，
CrylBa2，CrylBa3，CrylBa4，CrylBbl，CrylBcl，CrylBdl'CrylBd2，
CrylBel，CrylBe2，CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal，CrylCa2，
CrylCa3，CrylCa4，CrylCa5，CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8，CrylCa9，
CrylCalO，CrylCbl，Cry脂，CrylDal，CrylDa2,CrylDbl，CrylDb2，
CrylEal，CrylEa2，CrylEa3，CrylEa4，CrylEa5，CrylEa6，CrylEbl,
CrylFal，CrylFa2，CrylFbl，CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4，CrylFb5，
CrylGal，CrylGa2，CrylGbl，CrylGb2，CrylGc，CrylHal,CrylHbl，
Cryllal，Crylla2，Crylls3,Crylla4，Crylla5，Crylla6，Crylla7，
Cryl风Crylla9，Crylla10，Cryllall，Cryllbl，Cryllcl，Cryllc2，
Crylldl，Cryllel，Cryllfl，Cryljal，Cryljbl，CrylJ"cl，Cryljc2，
23Cryljdl,Cry歸，Cry2Aal，Cry2Aa2，Cry2Aa3，Cry2Aa4，Cry2Aa5，
Cry2Aa6，Cry2Aa7，Cry2Aa8，Cry2Aa9，Cry2Aal0，Cry2Aal1,Cry2Abl，
Cry2Ab2，Cry2Ab3，Cry2Ab4，Cry2Ab5，Cry2Ab6，Cry2Acl，Cry2Ac2，
Cry2Ac3，Cry2Adl，Cry2Ael，Cry3Aal，Cry3Aa2，Cry3Aa3，Cry3Aa4，
Cry3Aa5，Cry3Aa6，Cry3Aa7，Cry3Bal，Cry3Ba2，Cry3Bbl，Cry3Bb2，
Cry3Bb3，Cry3Cal，Cry4Aal，Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2，
Cry4Ba3，Cry4Ba4,Cry衡5，Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal，
Cry6Aal,Cry6Aa2，Cry6Bal，Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal，
Cry8Bal，Cry8Bbl，Cry8Bcl，Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2，
Cry8Da3，Cry8Eal，Cry9Aal，Cry9Aa2，Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2，
Cry9Dal，Cry9Da2，Cry9Eal，Cry犯a2，Cry犯bl，Cry犯cl，CrylOAal,
CrylOAa2，CrylOAa3，CryllAal,CryllAa2，CryllAa3，CryllBal，
CryllBbl，Cryl2Aal，Cryl3Aal，Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，
Cryl7Aal，Cryl8Aal，Cryl8Bal，Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，
Cry20Aal，Cry21Aal，Cry21Aa2，Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，
Cry22Abl，Cry22Ab2，Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，
Cry26Aal，Cry27Aal，Cry28Aal，Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，
Cry30Bal，，Cry31Aal，Cry31Aa2，Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，
Cry32Dal，Cry33Aal，Cry34Aal，Cry34Aa2，Cry34Abl，Cry34Acl，
Cry34Ac2，Cry34Bal，Cry35Aal，Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，
Cry35Acl，Cry35Bal，Cry36Aal，Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，
Cry40Aal，Cry40Bal，Cry41Aal，Cry41Abl，Cry42Aal，Cry43Aal，
Cry43Bal， Cry44Aa， Cry45Aa， Cry46Aa, Cry47Aa， CytlAal， CytlAa2 CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal， Cyt2Aal， Cyt2Aa2Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5， Cyt2Ba6， Cyt2Ba7, Cyt2Ba8，Cyt2Ba9，Cyt2Bbl，Cyt2Bcl，Cyt2Cal，Vip3A(a) and Vip3A(b).and Vip3a(b)。采用本发明的方法来表达植物细胞中的蛋白，可 以在草坪草或观赏植物中产生上面列出的蛋白。(例如，通过克隆编码以上 蛋白的基因到适合载体和转化植物细胞，这在上面和下面有详细的描述)。 在另一方面，本发明提供了一个保护草坪草使其免于昆虫攻击的方法。 根据一个实施例，被普遍称为蛴螬的甲虫幼虫可应用本发明来控制。蛴螬 是甲虫的幼虫期阶段，如南部蒙面金龟子，无斑金龟；草坪草蒙面金龟子， 多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿金龟；玫瑰金龟子，蔷 薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子；棕色金龟子，雌性金龟子；栗 褐色金龟子，斑喙丽金龟；东方丽金龟，东方异丽金龟；日本丽金龟，豆金 龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟；绿金龟，古铜异丽金龟；黑草坪草金龟， 黑绒金龟。
除了这些金龟子以外，本发明还产生了具有抗蛾子和蝴蝶幼虫活性的转 基因草坪草片段。例如，可获得地蚕和黏虫抗性如甜菜黏虫，甜菜夜蛾； 黏虫，美洲粘虫；土蚕，球菜夜蛾；苹果银蛾，杂色夜蛾；颗粒夜蛾，地 老虎还有抵抗紫苜蓿蛾，麦牧野螟；西部大草坪蛾，西方草螟；和斯佩 里菌苔蛾，斯佩里草螟。
另一方面，提供了昆虫抗性观赏植物。表一举例说明了本发明采用的一 些观赏植物。
表一 易于被成年日本丽金龟攻击的景观植物 学名 通用名 鸡爪槭(Acer palmatum) 日本槭 紫叶挪威槭(Acer plananoides) 挪烕枫欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum) 灰色桦树(Betula populifolia) 美洲版栗(Castanea dentata) 木槿(Nibiscus syriacus) 黑核杉"Juglans nigra) 苹果属(Malus species) 悬铃木(Platanus acerifolia) 钻天杨(Populus nigra italica) 李属 (Primus species) 蔷薇属(Rosa species) 黄棒(Sassafras albidum) 美洲花揪(Sorbus americana) 美洲l椴树(Tilia americana) 美洲输树(Ulmus americana) 英国榆树(Ulmus procera) 葡萄属(Vitis species )
那些生长迅速而且对甲虫特别有吸弓I力的植物是最难保护的。玫瑰开花 迅速而且对甲虫特别有吸引力。当甲虫量很多时，采用掐掉小芽和喷射杀 虫剂来保护叶子或者用网覆盖玫瑰，使得甲虫不能入内。
甲虫喜爱某种杂草和非经济型植物，如蕨菜，接骨木，野蔷薇，印度锦 葵，黄樟，常春藤，荨麻，野生葡萄和野生夏季葡萄。当毁坏这些昆虫侵 袭连续源时，这些植物就被消除。
以上列出的植物(表一)和其它植物采用技术中熟练技工熟知的标准分 子生物学和植物学方法由昆虫抗性基因转化，使植物生长，由接受昆虫攻
26
马栗树 杨叶桦 美国栗子
白槿、木槿
海棠、苹果
二球悬铃木 意大利白杨
樱桃、黑梅、李子、桃子 玫瑰
黄樟 美国花楸 美国菩提树 美国榆树
英国榆树 食用葡萄击来确定昆虫抗性，在例子中举例说明了这种转基因草坪草，如下。
下面的例子显示出本发明可以用来产生具有昆虫抗性的转基因草坪草。 技术中的那些熟练的技工可以知道当特定的实施例被图解和描述时，它们 不限制这个发明。


图一描述了转化的草坪草的PCR分析，显示的是以2kb带形式的cry8Da 基因(右侧3条泳道)。左泳道是一个大小标记。左边第二泳道是非转基因 草的阴性对照。
图二描述的是一张含有一些转基因草坪草片段盆栽的图片。这盆盆栽 含有两只处在第三龄期的日本丽金龟幼虫，允许它们在盆栽里消耗草坪草 为期一个月。 一些植物显示出抗性，而另一些植物被昆虫毁坏。
图3A—3D显示的是SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:10的序列。
具体实施例方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。 实施例l:克隆cry8Da基因
根据Asano等((2003)， Biological Control 28， 191-196，这文献由 于整体上应用而合并与此)发表的文章描述的方法，从苏云金芽孢杆菌SDS 一502菌株中克隆cry8Da基因。含有活性区域的cry8Da基因的一个片段以 以下两个序列作引物和以克隆的cry8Da基因作为模版进行PCR扩增， 5， -GGATCCCATGAGTCCAAATMTCAAMTG (SEQ ID N0:1) 5， -CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC (SEQ ID NO:2) PCR在含有10pg模版DNA和适当浓度的其它成分的一个lOOul反应混 合物中进行(对于技术中熟练技工熟知的)。在一个例子中，PCR混合物包 含lOullOX缓冲液，2uld-NTP， 2. 5ul引物1 (20uM) ， 2. 5ul引物2 (20uM)，2ul耐热性DNA聚合酶，lul模版DNA和80ul水。根据给定的质粒制造说 明书PCR中的循环温度为96。 C (30秒)45° C (45秒)72° C (l分钟30 秒)，循环25次。PCR扩增基因片段在pGEM-T-Easy (美国威斯康辛州麦迪 逊Promega公司)中被克隆，克隆的基因被依次证明了 cry8Da基因的序列， 如美国专利申请20030017967发表的(这个文献由于整体引用而合并与此)。 pGEM-T-Easy中PCR扩增的cry8Da基因利用pGEM-T-Easy提供的位点和 PBI221克隆的位点，由BamHI和Sacl切断这些位点已经由BamHI和Sacl 切断移除gusA基因。产物质粒来自于pBI221，其中，cry8Da基因由叫做 pBI221-8Dl (SEQ IDN0:3)的克隆，并在植物转化中采用。在植物转化中 采用的质粒pBI221-8Dl和其它质粒，p35S-GFP，购买自Clonetech (美国 加利福尼亚洲Mountain View)。
实施例2:克隆除cry8Da以外的甲虫活性基因
Cry43Aa基因(基因库序列号AB115422)编码一个金龟子蛋白质毒素， 如古铜异丽金龟和豆金龟子。这些是对草坪草严重有害的害虫，它们的捕 食行为能引起相当大的毁坏。Cry43Aa基因从日本甲虫芽胞杆菌菌株中克 隆，这个菌株是从患病的绿金龟和古铜异丽金龟分离出来的。全长的 cry43Aa基因以两个以下序列为引物进行PCR扩增。 5， -GGATCCATGAATCAGTATCATMCCAAAACG (SEQ ID NO :4) 5， -CCCGGGTTACTTTTCCATACAAATCMTTCCAC (SEQ ID NO :5) 在PCR反应混合物中，采用由含有约lOOngDNA的B. polilliae Hime菌株 配制的lul基因组DNA 。
cry8Ca基因(基因库序列号U04366)也编码一个金龟子蛋白质毒素。 cry8Ca基因在Bacillus thrungiensis蓓蓓(buibui) 菌株中克隆，这 个菌株是从日本国际贸易和工业部工业科学与技术机构发酵研究所中获得
28的。全长的cry8Ca基因以两个下列序列为引物进行PCR扩增。 5， -GGATCCATGAGTCC嵐TMTCAAAATGAG (SEQ ID NO :6) 5， -CCCGGGTTACTCTTCTTCTAACACGAGTTCTAC (SEQ ID NO :7)
在PCR反应混合物中，采用由含有约100ngDNA的B. thrungiensis蓓 蓓(buibui)菌株配制的lul基因组DNA 。
PCR扩增的cryAa和cryCa基因在pBI221中克隆，如实施例1中所描 述的，在抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例IO中描述 的，如下。
实施例3:克隆crylCa基因
CrylCa基因僅因库序列号X07518)编码一个黏虫复合物的蛋白毒素，
如甜菜夜蛾，秋粘虫，美洲粘虫等。这些是对草坪草的严重有害的害虫， 能引起相当大的毁坏。CrylCa基因在B. thringiensis subsp. aizawai HD133菌株中克隆，这个菌株是从美国伊利诺州北方研究中心农业调研服务 美国农业部中获得的。全长的crylCa基因以两个以下序列为引物进行PCR 扩增，
5， -GGATCCCATGGAGGAMATAATCAAAATCAATGC (SEQ ID NO :8)
5， -CCCGGGTTATTCCTCCATAAGGAGTMTTCC (SEQ ID NO :9)
在PCR反应混合物中，采用由含有100ngDNA的HD_133菌株配制的lul基
因组DNA。 PCR扩增的crylCa基因在pBI221中克隆，如实施例1中所描述
的，在抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例10中描述的，如下。
实施例4:富含GC的cry8Da的合成
合成的cry8Da基因(SEQ ID NO: 10)是从美国加利福尼亚洲Menlo Park Phyllom LLC公司中获得。在这个基因中，GC和AT含量的比率被修改来增
29加天然存在的苏云金芽孢杆菌cry8Da序列的GC含量。苏云金芽孢杆菌基 因利用富含AT的密码子多过如动物和植物的真核生物。在合成的cry8Da 中，肽序列没有改变。合成的基因具有BamHI和NotI位点，这些位点可以 直接克隆到被限制性内切酶酶切的PBI221中。基因在pBI221中克隆，在 抗甲虫活性测试之后，在草坪草转化中采用，如实施例10中描述的，如下。 实施例5愈伤组织诱导
在例子中采用茅花黑麦草和多年生黑麦草两种草坪草。将草的种子浸 渍到1%的次氯酸钠中15分钟，以将种子表面灭菌。在不育的种子中，将 种皮除去，去皮的种子浸渍到蒸馏水中过夜。种子由1%的次氯酸钠再处理 15分钟。在第二次次氯酸钠处理后，切开种子，将种胚分离出来。胚在基 于MS培养基的愈伤组织诱导培养基中培养(Murashige and Skoog， 1962， Physiol. Plant, 15， 473-497)。在这个愈伤组织诱导培养基中，硝酸铵 浓度减小到原始的MS培养基配方的50X，再加入3%的蔗糖。在实验中， 不同的植物生长调节物质被测试以得到最好的结果，如表2所示。表2说 明了由30个茅花黑麦草胚样品诱导的大量愈伤组织和大量的愈伤组织都可 以再生成完整的植物。 表2:草坪草愈伤组织诱导和再生
PGR (植物生长调节剂)CuS04 (愈伤组织诱导率)(%)愈伤组织再生 D2 - 27 (90) 6 D2 + 19 (63) 1 D2/B001 - 21 (70) 6 D2/B001 + 24 (80) 8 *
30D2/B01-21(70)3
D2/B01+19(63)1
D2/T001—21 (70)5
D2/T001+17 (57)3
D2/T01-15(60)4
D2/T01+15(60)3
DC2 -25(83)1
DC2 +21(70)3
DC2細1—15 (50)3
DC2/B001+23 (77)3
DC2/B01—17 (57)2
DC2/B01+18 (60)3
DC2/T001-17 (57)1
DC2/T001+12 (40)3
DC2/T01一16 (53)1
DC2/T01+17 (57)2
PGR解植物生长激素
D2: 2 mg/1 2， 4- 2， 4 一二氯苯氧乙酸(2, 4-D) DC2: 2 mg/l二氯甲氧苯酸(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸) 细胞因子
B01/B001: 0.01 or 0.001 mg/1节氨基嘌呤(BAP) T01/T001: 0.01 or 0.001 mg/1 TDZ (苯基噻二唑脲)CuS04 +表明CuS04浓度增加了原始MS培养基的50X。 CuS04 -表明没有增加。 *采用这个组合来诱导转化中采用的愈伤组织
实验中，申请者采用的MS培养基中2， 4 一二氯苯氧乙酸(2， 4-D)和苄 氨基嘌呤(BAP)的浓度分别为2mg/l，0.001mg/1。硫酸铜的浓度增加了 50 %。培养基含有0. 25%的Gelrite (美国宾夕法尼亚纪北威尔士 Merck公 司)。胚在24 ° C条件下，愈伤组织诱导培养基中每天光照16小时，培养 2个星期，直到愈伤组织形成。每三个星期，将愈伤组织转移到新鲜的培养 基中持续到转化为止。 实施例6:转化
转化采用基因枪转化技术来完成。实验设计基于由日本北海道基因枪 (GIE-III IDER)制造前沿科学提供的使用者手册。在愈伤组织诱导培养基 中生长的愈伤组织，浸渍在高渗透压(HOP)，含有愈伤组织诱导培养基的全 部成分和0. 5M甘露醇的培养基中过夜。浸渍在高渗透压培养基的愈伤组织 被切成lnmi3的小尺寸。在一个转化中采用约有40块愈伤组织，将其放入愈 伤组织诱导培养基中。用不同量(lug—4ug)的pBI221—8Dl和p35S—GEP 在4ul乙醇中覆盖不同量的(10g到40ug)的金粉(1.5 3.0微米)，在样 品上12cm处向愈伤组织块注射一次或两次。采用GFP作为转化率的指示剂， 发现2ug产生的最高转化率的DNA覆盖了 100ug金粉。注射一次和两次转 化率没有明显差别。因此，许多大规模实验在此条件下进行。在一次转化 中要采用草坪草种子的1600块愈伤组织。 实施例7:再生转化的愈伤组织被转移到新鲜培养基中。每块愈伤组织被放到培养基
中间距约lcm。几天内，转化细胞显示出GFP荧光。 一周内，将显示出很强 的GFP荧光的细胞群从每块愈伤组织中切下来，移植到一个再生培养基中。 除了没有添加激素以外，这个再生培养基与愈伤组织诱导培养基相同。转 化细胞在24 ° C的条件下每天光照16小时进行培养。每两个星期，将细 胞转移到新鲜的培养基中。在四个星期内，3株GFP阳性茅花黑麦草片段生 长成带有叶子和根的完整植物。 实施例8:转化愈伤组织的选择方法
除了 GFP以外，双丙氨瞵抗性(bar)基因也可被采用作为转化细胞 的选择标记。双丙氨瞵是谷氨酰胺合成酶抑制剂，bar基因编码的这个酶草 胺膦酰基转移酶使得双丙氨瞵失去活性。Bar基因由PGTV-BAR(Becker， et al.， 1992， Plant Mol. Biol. 20， 1195-1197)连同采用如下引物进行PCR 的启动子和终止子中获得，
5， -CCGGMTTCGATCATGAGCGGAGMTTMGG (SEQ ID NO: 11) 5， -CCGGMTTCATCTTGAAAGAMTATAGTTTAAAT (SEQ ID NO :12) 该基因在Stratagene公司的pBluescriptII-SK+中克隆，被用来转化草坪 草愈伤组织和pBI221-8Dal质粒。 一些由双丙氨瞵选择的转化草细胞生长 成双丙氨瞵抗性的完整植物。上面描述的昆虫攻击显示出一些植物对日本 丽金龟的确有抗性。在另一个实施例中，采用潮霉素B对转化草细胞进行 选择。在这个例子中，潮霉素B抗性基因由NOS启动子和终止子来进行克 隆。
实施例9:转化草植物的PCR分析
当转化愈伤组织生长成完整植物时，从每个植物中取一部分叶子，根
据试剂盒中的说明书(美国加州巴伦西亚Qiagen公司)采用Qiagen公司的微量植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit)从叶子样本中提取DNA。 样本中cry8Da基因采用以下序列为引物进行PCR扩增分析， 5， -GGATCCCATGAGTCCAAATAATCAAMTG (SEQ ID NO: 13) 5, -CCCGGGTCACACATCTAGGTCTTCTTCTGC (SEQ ID NO:14)
如果cry8Da基因存在于模板DNA样本(植物叶子提取)中，那这些 引物可以产生2kb的扩增片段。所有的叶子样本都来源于GFP阳性愈伤组 织部分，由插入植物基因组的cry8Da基因的PCR分析显示出这2kb片段(图 1)。四个片段，其中三个来自于茅花黑麦草， 一个来自于多年生黑麦草， 它们由PCR分析选择出来，来进行昆虫抗性测试。 实施例10:昆虫抗性测试
将来自于转化愈伤组织的再生完整植物转移到含有盆栽肥料的15厘 米直径的盆栽中。每个盆栽植入约6种植物。每个盆栽中，放入2个收集 自草地的第三龄期的日本丽金龟幼虫，允许它们以草根为食，为期一个月。 昆虫捕食了对昆虫没有抗性的植物的根(如，没有由昆虫抗性基因转化)， 从而杀死植物。然而，那些经PCR分析(实施例9)对cry8Da成阳性的植 物显示出对日本丽金龟的抗性而生存下来(图2)。保护植物的水平不比采 用化学杀虫剂好，但与其相似。在这个例子中，采用的倍硫磷有机磷酸盐 杀虫剂为0. 45 AI (活性成分)g/cm2。
通过第一次昆虫抗性测试和每个盆栽中5只第三龄期的日本丽金龟测 试而生存下来的一种植物采用更多的昆虫攻击进行进一步的测试。含有 cry8Da的草片段在更多昆虫攻击的第二次昆虫抗性测试也能生存下来。一 个月的测试之后，所有5只昆虫在含有非转化草的盆栽中生存下来，而在 大多数转基因盆栽没有生存的昆虫。
权利要求
1. 一种转基因草坪草，它包含一个昆虫抗性基因。
2.根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因来 自于苏云金芽孢杆菌。
3. 根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包 含的cry8Da来自于苏云金芽孢杆菌SDS—502菌株。
4. 根据权利要求1所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因与 昆虫的抗性作比较，这些昆虫选自南部蒙面金龟子，无斑金龟；草坪 草蒙面金龟子，多毛犀金龟和西北黑头金龟子；六月或五月甲虫，绿 金龟；玫瑰金龟子，蔷薇鳃角金龟；欧洲金龟子，欧洲鳃角金龟子； 棕色金龟子，雌性金龟子；栗褐色金龟子，斑喙丽金龟；东方丽金龟， 东方异丽金龟；日本丽金龟，豆金龟子；大豆金龟子，红铜丽金龟； 绿金龟，古铜异丽金龟；黑草坪草金龟，黑绒金龟；贪夜蛾，甜菜夜 蛾；粘虫，美洲粘虫；土蚕，球菜夜蛾；杂色地老虎，杂色夜蛾；颗 粒地老虎，地老虎；紫苜蓿蛾，麦牧野螟；西方菌苔蛾，西方草螟； 和斯佩里菌苔蛾，斯佩里草螟。
5. 根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因由对草坪草 有害昆虫致病的细菌获得。
6. 根据权利要求3所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因由选择自苏 云金芽胞杆菌，日本甲虫芽胞杆菌，例如，缓死芽孢杆菌，和幼虫芽 胞杆菌的微生物获得。
7. 根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的基因编码昆虫活性蛋白，这些基因选择自CrylAal, CrylAa2， CrylAa3， CrylAa4，CrylAa5， CrylAa6， CrylAa7， CrylAa8， CrylAa9， CrylAalO, CrylAal 1，CrylAal2， CrylAal3， CrylAal4， CrylAbl， CrylAb2， CrylAb3， CrylAb4，CrylAb5， CrylAb6， CrylAb7， CrylAb8， CrylAb9， CrylAblO， CrylAbl 1，CrylAbl2， CrylAbl3， CrylAbl4， CrylAbl5， CrylAbl6， CrylAcl，CrylAc2， CrylAc3， CrylAc4， CrylAc5， CrylAc6， CrylAc7， CrylAc8，CrylAc9， CrylAclO， CrylAcll， CrylAcl2， CrylAcl3， CrylAcl4，CrylAcl5， CrylAdl， CrylAd2， CrylAel，CrylAfl，CrylAgl，CrylAhl，CrylAil， CrylBal，CrylBa2， CrylBa3，CrylBa4，CrylBbl,CrylBcl，CrylBdl， CrylBd2，CrylBel, CrylBe2，CrylBfl，CrylBf2，CrylBgl，CrylCal， CrylCa2，CrylCa3， CrylCa4，CrylCa5，CrylCa6，CrylCa7，CrylCa8， CrylCa9，CrylCalO， CrylCbl，CrylCb2，CrylDal，CrylDa2，CrylDbl， CrylDb2，CrylEal， CrylEa2，CrylEa3，CrylEa4，CryiEa5，CrylEa6， CrylEbl，CrylFal， CrylFa2，CrylFbl，CrylFb2，CrylFb3，CrylFb4， CrylFb5，CrylGal， CrylGa2，CrylGbl，CrylGb2:，CrylGc，CrylHal， CrylHbl，Cryllal， Crylla2，Crylla3，Crylla4，Crylla5，Crylla6， Crylla7， Crylla8， Crylla9， Crylla10， Cryllall， Cryllbl，Cryllcl， Cryllc2， Crylldl， Cryllel， Cryllfl， Cryljal， Cryljbl，Cryljcl， Cryljc2， Cryljdl， CrylKal， Cry2Aal， Cry2Aa2， Cry2Aa3，Cry2Aa4， Cry2Aa5， Cry2Aa6， Cry2Aa7， Cry2Aa8， Cry2Aa9， Cry2Aal0，Cry2Aal1， Cry2Abl， Cry2Ab2， Cry2Ab3， Cry2Ab4， Cry2Ab5， Cry2Ab6，Cry2Acl， Cry2Ac2， Cry2Ac3， Cry2Adl， Cry2Ael， Cry3Aal， Cry3Aa2，3Cry3Aa3，Cry3Aa4， Cry3Aa5， Cry3Aa6， Cry3Aa7， Cry3Bal，Cry3Ba2,Cry3Bbl，Cry3Bb2， Cry3Bb3， Cry3Cal， Cry4Aal， Cry4Aa2，Cry4Aa3，Cry4Bal，Cry4Ba2， Cry4Ba3， Cry4Ba4， Cry4Ba5， Cry5Aal，Cry5Abl，Cry5Acl，Cry5Bal， Cry6Aal， Cry6Aa2， Cry6Bal， Cry7Aal，Cry7Abl，Cry7Ab2，Cry8Aal， Cry8Bal， Cry8Bbl， Cry8Bcl， Cry8Cal，Cry8Ca2，Cry8Dal，Cry8Da2， Cry8Da3， Cry8Eal， Cry9Aal， Cry9Aa2，Cry9Bal，Cry9Cal，Cry9Ca2， Cry9Dal， Cry9Da2， Cry犯al， Cry犯a2，Cry9Ebl，Cry犯cl，CrylOAal，CrylOAa2， CrylOAa3， CryllAal, CryllAa2，CryllAa3，CryllBal，CryllBbl， Cryl2Aal， Cryl3Aal，Cryl4Aal，Cryl5Aal，Cryl6Aal，Cryl7Aal， Cryl8Aal， Cryl8Bal，Cryl8Cal，Cryl9Aal，Cryl9Bal，Cry20Aal， Cry21Aal， Cry21Aa2，Cry21Bal，Cry22Aal，Cry22Aa2，Cry22Abl， Cry22Ab2， Cry22Bal，Cry23Aal，Cry24Aal，Cry25Aal，Cry26Aal， Cry27Aal， Cry28Aal，Cry28Aa2，Cry29Aal，Cry30Aal，Cry30Bal" Cry31Aal， Cry31Aa2，Cry32Aal，Cry32Bal，Cry32Cal，Cry32Dal， Cry33Aal， Cry34Aal，Cry34Aa2，Cry34Abl，Cry34Acl，Cry34Ac2， Cry34Bal， Cry35Aal，Cry35Aa2，Cry35Abl，Cry35Ab2，Cry35Acl， Cry35Bal， Cry36Aal，Cry37Aal，Cry38Aal，Cry39Aal，Cry40Aal， Cry40Bal， Cry41Aal，Cry41Abl，Cry42Aal，Cry43Aal， Cry43Bal， Cry44Aa， Cry45Aa， Cry46Aa， Cry47Aa，CytlAal， CytlAa2， CytlAa3， CytlAa4， CytlAa5， CytlAbl， CytlBal，Cyt2Aal， Cyt2Aa2， Cyt2Bal， Cyt2Ba2， Cyt2Ba3， Cyt2Ba4， Cyt2Ba5，Cyt2Ba6， Cyt2Ba7， Cyt2Ba8， Cyt2Ba9， Cyt2Bbl， Cyt2Bcl， Cyt2Cal，Vip3A (a)和Vip3A (b)和Vip3a (b)。
8. 根据权利要求1所述的昆虫抗性基因，其中所述的昆虫抗性基因由选自沙雷菌类，发光杆菌类，致病杆菌类的微生物获得。变形斑沙雷菌，嗜虫沙雷氏菌，荧光假单孢菌，嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌
9. 根据权利要求8所述的沙雷菌类，其中所述的种类包括变形斑沙雷菌和嗜虫沙雷氏菌。
10. 根据权利要求8所述的发光杆菌类，其中所述的种类包括荧光假单孢菌。
11. 根据权利要求8所述的致病杆菌类，其中所述的种类包括嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌。
12. 根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括来自于苏云金芽胞杆菌蓓蓓(buibui)菌株的cry8Ca基因。
13. 根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括来自于日本甲虫芽胞杆菌的c:ry43A基因。
14. 根据权利要求1中所述的转基因草坪草，其中所述的昆虫抗性基因包括苏云金芽胞杆菌crylCa基因。
15. 根据权利要求1中所述的转基因草坪草，包含有SEQIDN0:10的多聚核苷酸序列。
16. —种减少或消除任何针对草坪草的化学或生物的杀虫剂喷射的方法，这种方法通过在草坪草中引入一个或多个昆虫抗性基因来控制虫害。
17.根据权利要求1或6中所述的转基因草坪草，其中所述的草种类选择自碱地鼠尾粟(Sporobolus airoides);窄颖赖草(Leymusangustus);多花黑麦草(Loliummultiflorum);百喜草(Paspalumnotatum);披碱草杂交的大麦(Elyhordeum);狗牙根(Cynodondactylon);须芒草(Andropogon);雀麦(Bromus);黍(Panicummiliaceum);冈瞎竹(Microstegium);荞麦(Eriogonum);野牛草(Buchloe dactyloides);喜湿藹草(Phalaris aquatica);力口州雀麦 (California brome);阿拉其Jf力口雀麦(Bromus sitchensis);加拿大早熟禾(Poa compressa);金黄草(Phalaris);紫羊茅(Festucarubra); 草(Echinochloa);剪股颖(rostis tenuis);大麦(Hordeum vulgare); 小麦(Triticum aestivum);匍匍剪股颖(Agrostis s.tolonifera ); 苹状看麦娘 (Alopecurusarundinaceus) 5扁穗冰草(Agropyxon cristatum) 5披碱草(Elymusdahuricus);毛花雀稗(Paspalum dilatatum);羊茅(Festuca);丝状疣羊茅(Festuca filiformis); 糝子(Eleusine comcana);鸭茅状磨擦禾(Tripsacum);甜高粱(Sorghum bicolor);牧草(Bouteloua);无芒雀麦(Bromus stamineus);硬羊茅(Festucatrachyphylla);假高粱(Sorghastrum nutans);中间偃麦草(Thinopyrum intermedium); 食用稗(Echinochloa esculenta) 5草地早熟禾 (Poa pratensis);狼尾草(Pennisetum clandestinum) 5杂色黍(Panicum coloratum) 5知风草(Eragrostis) 5 多毛雀麦Bromus co腿utatus); 牛尾草(Festuca pratensis); 草原看麦娘(Alopecurus pratensis);草地黑麦草(Lolium pratense);粟草(Milium);燕麦(Avena);鸭茅(Dactylis glomerata);黑黍(Pennisetum americanum); 多年生黑麦草(Xolium perenne);草原草(Bromus wildenowii);北美草原牧草(Koeleria macrantha);鼠尾羊茅(Vulpia myuros);紫羊茅(Festuca rubra);小糠草(Agrostis gigantea); 哈定草(Phalaris arundinacea); 粗茎早熟禾(Poa trivialis) 5 高冰草(Thinopyrum ponticum);俄罗斯新麦草(Psathyrostachys juncea); 黑麦(Secale cereale);黑麦草(Xolium);羊茅(Festuca ovina);紫羊茅(Festuca rubra);茅子粒苋(Bromus inermis); 双色高粱(Sorghum bicolor) 5 河边冰草(Elymus lanceolatus); 苏丹草(Sorghum bicolor); 賴卩枝稷(Panicum virgatum) 5 高羊茅(Xolium axundinaceum); 高燕麦草(Arrhenatherum elatius);长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum);猫尾草(Phleum pratense); 小黑麦(Triticosecale rimpaui);发草(Deschampsia caespitosa);蓝茎冰草(Pascopyrum smithii);小麦(Triticum);芽草(Agropyron)和披碱草(Elymus)。
18. —种产生昆虫抗性草坪草的方法，包括a) 将包含一个或多个昆虫抗性基因的一个或多个质粒引入草坪草愈伤组织，其中所述的愈伤组织是转化了的；b) 培养所述的愈伤组织；c) 使所述的愈伤组织生长成成熟草坪草；d) 测试所述的成熟草坪草的昆虫抗性。
全文摘要
本发明涉及到具有草坪草有害昆虫抗性的转基因草坪草。叙述了产生这种昆虫抗性转基因草坪草片段的方法。本发明还涉及到这种昆虫抗性转基因草坪草的应用，来消除或减少喷射型杀虫剂的使用，来保护草坪草免于受到昆虫的毁坏。
文档编号C12N15/82GK101505589SQ200680039410
公开日2009年8月12日 申请日期2006年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者广田贡, 浅野真一郎 申请人:菲龙有限责任公司