专利名称：高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因昆虫细胞系，尤其涉及一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用，属于转基因动物技术领域。
背景技术：
昆虫是世界上种类最多的生物群体，有着丰富的细胞遗传学系统。昆虫细胞系的主要用途表现在作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具；作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，可表达具有重大经济价值和科学意义的外源蛋白质；作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒，特别是含有外源基因的重组杆状病毒，生产生物杀虫剂。据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双 翅目昆虫。鳞翅目的细胞系来源于多种组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功能，是重要的生理代谢组织，也是杆状病毒主要的侵染、复制部位之一，具有重要的应用价值。昆虫细胞系的建立往往需要消耗大量的时间和精力。细胞在体外培养过程中，由于受到各种环境因子的影响，有时会发生自发转化，由原来的二倍体核型转变成多倍体/异倍体核型，细胞的生长特性发生改变而获得永生化。永生化的细胞在生长过程中失去接触抑制，可无限繁殖传代。这样的转化不仅时间长，而且转化率极低。建立一株细胞系往往需要培养大量原代细胞，费时费力，经常守株待兔式地等待细胞自发转化，条件难以控制，常常因污染而前功尽弃。而且体外培养细胞成功传代后，当培养到一定代数时，通常会进入生长抑制状态，生命力明显减弱，增殖能力下降，生长停滞并最终死亡。人工诱导体外培养细胞转化是获得永生化细胞的重要手段。在人工设计的诱变因素下使细胞发生转化，通常只需1-3个月就可实现，而且转化率较高，传代细胞生长周期长、性状稳定。目前发现，细胞永生化与端粒和端粒酶关系密切。端粒与端粒酶是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列，参与DNA复制，并对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。人类细胞端粒是由10-15kb的重复序列(TTAGGG)n组成；在植物中端粒以(TTTAGGG)η重复序列出现；昆虫细胞端粒一般是由6-8kb的重复序列(TTAGG)组成。目前已知，在昆虫中存在三种端粒DNA类型家蚕(Bombyx mori)的端粒DNA由重复序列(TTAGG)n构成(Okazakiet al. 1993);果妮(Drosophila melanogaster)端粒 DNA 由转座因子 HeT-Α 和 TART 组成(Biessmann et al. 1990, Levis et al. 1993);摇蚊中的端粒DNA由复杂的基因串联重复序列组成(Nielsen & EdstroEm 1993, Zhang et al. 1994)。体外培养的细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp,当缩短至一临界值时,细胞就会停止分裂,走向衰老和死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，以自身的RNA为模板合成端粒DNA，以维持端粒的长度。细胞永生化是指体外培养的细胞由于自身的改变或外部条件的影响，逃离细胞的衰老期和危机期，端粒长度始终维持稳定，从而获得无限增殖能力的过程。细胞永生化与端粒酶激活密切相关。端粒的维持依赖于端粒酶的激活。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase catalytic subunit,hTERT)能稳定端粒的长度,使细胞易于永生化(Cemi C. Telomeres, telomerase, and myc.An update [J]. Mutat Res. 2000，462 (I) :31-47.)。虽然有关将端粒酶基因应用于哺乳动物细胞永生化的报道很多，但未见涉及利用转染人端粒酶基因获得昆虫永生化细胞系的报道。通过人工诱导体外转化方法建立来源于昆虫脂肪体并表达人端粒酶逆转录酶基因的细胞系，为获得永生化细胞系提供了重要途径。
发明内容
因此，本发明的目的是针对目前尚无含有人端粒酶昆虫细胞系的不足，提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，其含有人端粒酶逆转录酶基因，为获得永生化昆虫细胞系提供了重要途径。本发明的另一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的制备方法。 本发明的再一目的是提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的应用。针对上述目的，本发明的技术方案如下本发明一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-SpexX，该细胞系的保藏号为CGMCC No. 4505。优选地，所述转基因脂肪体细胞系含有人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)。优选地,所述人端粒酶逆转录酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。本发明的又一方面提供了一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系的制备方法，包括以下步骤步骤I :培养甜菜夜蛾脂肪体细胞；步骤2 :将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体；步骤3 :将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中；和步骤4 :使所述甜菜夜蛾脂肪体细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因脂肪体细胞系。优选地，在步骤I)中，所述培养甜菜夜蛾脂肪体细胞，包括以下步骤步骤I. I :将甜菜夜蛾末龄幼虫浸没在3%次氯酸溶液中5分钟，75%乙醇溶液中10-20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干蛹表面水分；步骤I. 2 :解剖昆虫，取出甜菜夜蛾脂肪体组织；步骤I. 3 :用生理盐水清洗步骤2中获得的组织2-3次，再用细胞培养液I清洗，清洗后把该组织放入含有ImL细胞培养液I润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养24小时；步骤I. 4 :加入适量的细胞培养液I，使组织完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤I. 3同样条件下培养；步骤1.5 :每7-10天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液II，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶。优选地，在步骤2中，所述已知的表达载体为pIZT-V5_His或pIB-V5_His。
优选地，在步骤3)中，所述重组表达载体通过脂质体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中。优选地，在步骤4)中，具体通过以下步骤获得转基因昆虫细胞系步骤4. I :放入与步骤I. 3同样条件下培养至少4小时，并不时晃动。转染后换适量细胞培养液II继续在与步骤I. 3同样条件下培养；步骤4. 2 72小时后荧光倒置显微镜观察转染效果，换含有真核细胞筛选抗生素的细胞培养液III继续与步骤I. 3同样条件下培养；步骤4. 3 :在将该细胞与步骤I. 5相同培养细胞，直至获得转基因昆虫细胞系。上述整个过程都是在无菌条件下进行的；其中所述的四种细胞培养液分别是细胞培养液I是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、苯基硫脲和胎牛血清的混合物；细胞培养液II是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，细胞培养液III是昆虫细胞 培养液与青霉素、链霉素、博莱霉素(Zeocin)和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH为 6. 0-6. 8。昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液，如TNM-FH，Grace’ s, Sf900，TC-100, IPL-41, Ex-Cell 400 等等。通常，细胞培养液中青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为100U/mL ;筛选转基因细胞的培养液为上述培养液含博莱霉素(ζΘΟ( η)400μ g/mL ;转基因细胞系培养液为上述培养液含博莱霉素(zeoCin)50l·! g/mL ;动物血清含量为细胞培养液的10% (体积比)。
本发明的再一方面提供一种高产杆状病毒的转基因昆虫细胞系的应用，所述转基因昆虫细胞系在杆状病毒生产中的应用。优选地，所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。本发明中表达了人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的甜菜夜蛾脂肪体细胞系的生物学特征观察和测定I.经实验观察，该细胞系大部分为贴壁细胞，也有少量悬浮于培养液中。细胞的形状有3种类型大部分细胞圆形、少部分梭形，较少似巨噬细胞形。2. IOZCAS-SpexX对甜菜夜蛾及苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒敏感，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒；并且至少可以连续传代3代。3.按照 McIntosh and Ignoffo, 1989 (McIntosh, A. H. and C. M. IgnoffoJ. Invertebr. Pathol. 1989,54 :97 102)的方法，测定第12代细胞生长曲线和群体倍增时间。以I X 105细胞/mL的浓度接种到24孔培养板中，27°C培养，每48h测定细胞浓度，绘制生长曲线，并按公式T = tlg2/[lg(N/N0)]计算，第12代的细胞群体倍增时间为56. 98小时。其中T =在对数期平均增长一倍所需的时间t =接种到测定细胞数的时间NO =接种时的细胞数N =时刻t所测定的细胞总数4.按照 Takahashi et al. (Takahashi, Mitsuhashi and Ohtaki (1980) Develop.Growth and Differ. 22 :11-19)的方法，测定了第22代细胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色体数目 η = 31 (Hara, Tsuda,Funakoshi and Kawarabata In Vitro Cell. Dev. Biol. 1993,29A (12) 904 907)，而IOZCAS-SpexX的染色体数目在116-131之间，因此，新建立的细胞系IOZCAS-Spex X由4倍体细胞组成。5.使用 DAF-PCR 的方法(McIntosh, Grasela and Matteri (1996), Insect Mol.Biol. 5 :187 195)鉴定了细胞系IOZCAS-Spex X确是来源于甜菜夜蛾，而非其它细胞系的污染。由IOZCAS-Spex X提取的DNA与甜菜夜蛾蛹DNA、来源于甜菜夜蛾幼虫脂肪体的IOZCAS-SpexII-A的DNA扩增后主要的带型相同；而与对照，来源于草地贪夜蛾的Sf9、棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-Ι、美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl的细胞带型明显不同。6.使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并成功复苏。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中 图I为本发明所述的IOZCAS-Spex X的培养形态图，图中标尺所示为400 μ m ;图2为本发明所述的IOZCAS-Spex X的转染荧光(绿色荧光GFP标记)图，图中标尺所示为400 μ m ;图3为本发明所述的IOZCAS-Spex X感染甜菜夜蛾后获得大量的病毒多角体试验结果图，图中标尺所示为200 μ m ;图4为本发明所述的IOZCAS-SpexX感染苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒后获得大量的病毒多角体试验结果图，图中标尺所示为200 μ m ;图5为本发明所述的IOZCAS-SpexX的生长曲线；图6为本发明所述的IOZCAS-SpexX的核型； 图7为DAF-PCR鉴定IOZCAS-SpexX的DNA指纹扩增琼脂糖电泳图，图中I为甜菜夜蛾蛹(Spodoptera exigua pupa), 2为脂肪体的IOZCAS-Spex II-A, 3为棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-I，4为美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl，5为草地贪夜蛾的Sf9，6为DNA标记(DNA Marker)，7 为 IOZCAS-Spex X ；图8为含有hTERT基因的表达载体质粒pIZT-V5_His，具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Zeocin基因；图9为含有hTERT基因的表达载体质粒pIB_V5_His，具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Blasticidin基因；图10为转基因昆虫细胞系PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中I为DNA标记(DNA Marker)，2为转染hTERT基因的草地夜蛾的Sf9，3为草地夜蛾的Sf9，4为IOZCAS-Spex X 细胞系，5 为脂肪体的 IOZCAS-Spex II-A。
具体实施例方式以下实施例中所使用的技术，包括基因扩增，基因克隆，细胞转染，以及细胞培养、检测技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试齐U、细胞等，除非是说明书中特别说明，均为本领域技术人员可以通过公共途径获得的。实施例I.转基因甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞系的建立
取末龄的甜菜夜蛾幼虫浸没在3%次氯酸溶液中5分钟，75%乙醇溶液中10_20分钟，进行表面消毒。解剖该昆虫取出脂肪体组织，操作时尽量保持其完整。用生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液I (以TNM-FH为主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH = 6. 2)清洗1-2次，放入使用ImL培养液润洗过的25cm2的细胞培养瓶中，放入摄氏27°C无光照的细胞培养箱中培养24小时。然后加入3mL上述细胞培养液I，放入同样条件下培养。注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织块紧贴在细胞培养瓶底，勿使组织块悬浮在细胞培养液中。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新细胞培养液II。在此操作第7-10天后可以观察到组织块周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展。当原代细胞增殖至20天时,根据invitrogen公司Cellfectin II Reagent (Cat. no. 10362-100，10362-125)方法将本实验室构建的人端粒酶逆转录酶重组质粒转染到原代细胞中，27°C无光照的细胞培养箱中培养。转染后第三天 可通过荧光倒置显微镜观察转染效果。转染初期，部分细胞漂浮死亡，每7天半量换细胞培养液II，观察细胞增殖情况。当细胞有聚团增殖趋势时，加入400 μ g/mL博莱霉素(zeocin)筛选，成功转染了重组质粒基因的细胞贴壁生长正常，未转染的细胞则漂浮死亡。49天后当细胞增殖至将要铺满整个培养瓶时，细胞连同全部的培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液111(含SOyg/mL博莱霉素(zeocin))。细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第20天后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐缩短，传到第5代时，传代时间缩短至12天，细胞生长开始稳定，传至第22代时，传代时间已缩短至3-4天。最终该细胞系被命名为IOZCAS-Spex X。IOZCAS-Spex X已于2010年12月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4505。实施例2.人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因重组质粒pIZT_hTERT和pIB_hTERT的舰利用载体质粒pIZT-V5_His构建重组质粒pIZT_hTERT。如图8所示，载体质粒pIZT-V5-His具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Zeocin基因。将载体质粒pIZT-V5-His进行EcoR I和EcoR V限制性酶切，将hTERT基因(其序列如SEQ ID NO I所示)(来自质粒pBABE-puro-hTERT)进行SalI限制性酶切，dNTP补平、EcoRI酶切后，克隆到载体质粒中获得hTERT重组质粒pIZT-hTERT。利用载体质粒PIB-V5_Hi s构建重组质粒pIB_hTERT。如图9所示，载体质粒pIB-V5-His具有多克隆位点、杆状病毒早起启动子、V5表位和抗Blasticidin基因。将载体质粒pIB-V5-His进行EcoR I和EcoR V限制性酶切，将hTERT基因(来自质粒pBABE-puro-hTERT)进行Sail限制性酶切，dNTP补平、EcoRI酶切后，克隆到载体质粒中获得hTERT重组质粒pIB-hTERT。实施例3. IOZCAS-SpexX的牛物学特件观察和测定(I)形态特征经显微镜观察，该细胞系细胞易于形成细胞团且可忍受高密度生长环境，突破了接触抑制。如图1-2所示，细胞的形状有3种类型圆形、梭形和椭圆形。大部分细胞贴壁。(2)细胞的生长27°C下，细胞系第12代在含10%胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素、50 μ g/mL博莱霉素的TNM-FH培养液中，群体倍增时间为56. 98h。如图5所示，细胞最高密度约可达I. 3 X 106个细胞/mL。
(3)核型分析如图6所示，IOZCAS-Spex X第22代细胞是4倍体细胞，染色体数目范围 116-131 (2η = 62)。(4) DAF-PCR鉴定如图7所示，细胞系IOZCAS-Spex X确是来源于甜菜夜蛾，而非其它细胞系的污染。由IOZCAS-SpexX提取的DNA同于甜菜夜蛾蛹和脂肪体的DNA指纹扩增图谱,而不同于草地贪夜蛾的Sf9、棉铃虫脂肪体的IOZCAS-Ha-I、美洲棉铃虫蛹卵巢的BCIRL-Hz-AMl 的图谱。(5)冻存和复苏使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并可以成功复苏。实施例4.病毒敏感件IOZCAS-Spex X对甜菜夜蛾核型多角体病毒敏感将SeNPV及AcMNPV出芽型病毒粒子BV以O. 001幼虫当量/毫升的浓度接种IOZCAS-Spex X，如图3_4所示，培养7天后，通过倒置显微镜可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒。并且至少可以连续传代3代。病毒感染率分别为91. 2%和85. 4%。 实施例5.转hTERT某闵细朐中hTERT某闵的测定利用PCR技术，测定转hTERT基因的细胞系IOZCAS-SpexX中hTERT基因的存在。引物hTERT up AGC TGC GGC CCT CCT TCC TAC TCAhTERT down GAC GCT CGG CCC TCT TTT CTC TGC反应条件95°C,2min ；95°C /30S, 57°C /30S, 72°C /60S ；30 个循环72°C,5min。如图10所示，PCR检测结果证明，转基因的细胞株内存在hTERT基因。
权利要求
1.一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系，该细胞系的名称为IOZCAS-Spex X，保藏号为 CGMCC No. 4505。
2.根据权利要求I所述的转基因脂肪体细胞系，其特征在于，所述转基因昆虫细胞系含有人端粒酶逆转录酶基因。
3.根据权利要求2所述的转基因脂肪体细胞系，其特征在于，所述人端粒酶逆转录酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
4.根据权利要求I至3任一项所述的转基因脂肪体细胞系的制备方法，包括以下步骤 步骤I :培养甜菜夜蛾脂肪体细胞； 步骤2 :将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体； 步骤3 :将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中；和步骤4 :使所述甜菜夜蛾脂肪体细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因脂肪体细胞系。
5.根据权利要求4所述的转基因脂肪体细胞系的方法，其特征在于，在步骤2中，所述已知的表达载体为pIZT-V5-His或pIB-V5-His。
6.根据权利要求I至3任一项所述的转基因脂肪体细胞系的应用，所述转基因昆虫细胞系在杆状病毒生产中的应用。
7.根据权利要求6所述的转基因脂肪体细胞系的应用，其特征在于，所述杆状病毒为甜菜夜蛾核型多角体病毒或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
全文摘要
本发明提供一种高产杆状病毒的转基因脂肪体细胞系及其制备方法和应用，该细胞系的名称为IOZCAS-Spex X，保藏号为CGMCC No.4505；所述的转基因脂肪体细胞系的制备方法，包括以下步骤培养甜菜夜蛾脂肪体细胞；将含人端粒酶逆转录酶基因转化入已知表达载体中，获得重组表达载体；将所述重组表达载体导入所述的甜菜夜蛾脂肪体细胞中；和使所述甜菜夜蛾脂肪体细胞能够表达人端粒酶逆转录酶，获得转基因脂肪体细胞系；及所述转基因昆虫细胞系在杆状病毒生产中的应用。
文档编号C12R1/93GK102807968SQ201110148688
公开日2012年12月5日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者张寰, 李瑄, 秦启联, 王雁玲, 王红托, 张继红, 苗麟, 张宁, 孟茜, 朱未, 周桂灵, 杨青 申请人:中国科学院动物研究所