专利名称：谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
氮是生物体生长的必需养分之一，包括Ν03 —、ΝΗ4 +以及它们的一些同化产物，用于合成生物体所需的氨基酸和核苷酸及多种不同的含氮化合物。氮元素也是植物需求量最大的矿物质元素，而土壤中可利用的氮源比较少，自然就会成为限制农作物产量最主要的因素之一。由于外源的氮对农作物产量的提高是非常有效的，因此在集中型农业系统中，阶段性的施加无机氮肥成为提高农作物产量的重要途径。许多农作物品种之所以被耕种者选择，一部分原因就是它们对施用的氮肥有更高的利用性。然而，无机氮肥的应用会造成一系列环境问题，尤其是淡水，进而江河和海水的富营养。正因为如此，如今需要降低氮肥的使用量，并寻找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥的使用量。对于生物体的生长和发育而言，氮素的同化是十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺和天冬酰胺等有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthetase，GQ是氮同化的路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用， 催化氨的同化，在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界的无机氮元素也通过这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。盐藻UMmliella viridis)属于团藻目、多毛藻科、杜氏藻属生物，是耐盐性最强的真核单细胞藻类。不仅可在高盐海水和盐湖等生长，也能经受外界环境中盐浓度0. 5-5. 5 mol/L剧烈变化。在外界高盐的环境下，盐藻可利用环境中低浓度(毫摩尔)的N03—和NH4+。 研究盐藻的氮利用途径，有利于搞清楚高盐环境下植物氮利用途径及调控机制。因此，盐藻谷氨酰胺合成酶二基因的克隆及功能鉴定对于改善逆境下农作物的性状有重要的
眉、ο
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种谷氨酰胺合成酶基因。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供了该基因的颗粒方法。为达以上目的，本发明通过下述方案实现
一种谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。一种上述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。一种克隆上述基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。一种上述的谷氨酰胺合成酶基因在低氮环境下提高生物氮利用效率基因工程方面的应用。一种上述的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率基因工程方面的应用。本发明的互补实验验证了在盐藻中谷氨酰胺合成酶基因OV61S )所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，证明该基因能够恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。
图1和图2为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在叶绿体的可能性很大；
图3为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族；
图4为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50 (strR), Δ (glnG-glnA)229,ha-10, deoCl)中的功能互补分析图。培养基中添加谷氨酰胺，转入DvGS2和未转入DvGS2的菌株均可以正常生长；
图5为本发明的谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50(strR), Δ (glnG-glnA)2^，ha-10，deOCl)中的功能互补分析图。培养基中未添加谷氨酰胺，只有转入DvGS2的菌株可以正常生长。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一 :/^61 基因全长编码区的克隆与分析本实验室利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对文库中cDNA的序列进行大规模测序， 获得对应的EST文库(数据未发表)。通过序列比对，分离到了一个盐藻谷氨酰胺合成酶基因，命名为？。挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA 序列。测序结果表明MS2的cDNA全长1440bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及 poly(A)结构。Vector NTI9. 1. 0软件的分析结果显示该基因编码一个含385个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为42. 2kDa，等电点为5. 78。利用Cell-PLoc网站的Euk-mPLoc 2. 0以及Softberry网站的ProtComp Version 9. O对/VilS^基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在叶绿体的可能性很大，参见图1和2，这与其它物种中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。进化分析表明，本发明的基因编码的蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族，参见图3。实施例二 :/^61 在大肠杆菌突变体中的功能分析通过酶切方法，酶切位点为 Sall+Xbal (这两个酶切位点位于库质粒上)，将的全长cDNA从库质粒中切下，获得包含完整ORF的基因片段。然后将克隆到的目的片段插入到大肠杆菌组成型表达载体pEGFP-Ι中，并转入大肠杆菌突变体 ET6017(Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac) 169，flhD5301, Δ (fruK-yeiR) 725(fruA25)，relAl, rpsL150(strR)，Δ (glnG-glnA)229，ha-10, deoCl) 中°请参见文献Merida, Α. , Ε. Flores, and F. J. Florencio, Regulation of Anabaena sp. strain PCC 7120 glut amine synthetase activity in a Synechocys tis sp. strain PCC 6803 derivative strain bearing the Anabaena glnA gene and a mutated host glnA gene. J Bacteriol, 1992. 174(2) : p. 650-4.。该突变体由于缺失编码谷氨酰胺合成酶基因，所以在不添加谷氨酰胺的培养基中无法正常生长。该菌株购买于五coli Genetic Stock Center, Yale University。由图4和图5说明DvGS2能够互补大肠杆菌突变体ET6017的管酰胺合成酶缺失表型。DvGS2的表达，使得大肠杆菌突变体ET6017在不添加谷氨酰胺的培养条件下生长。该互补实验在大肠杆菌中验证了基因所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，证明该基因能够恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表 <110>上海大学
<120>谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法
<160> 2
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> HiDunaliella viridis) <400> 1
AATCGGCACGAGGATCACCATGGCCACGATGATGATGATGAAGCCTGCACAGCTGGCGCA60GCGAGGCGCTTTTGGCCGGGCGGCAGCCCCTGCAGCGGGAGGCCGTGGCCTGTCTGTCAG120GGCCAATGCCGCCCCCAAGCTGGTGCAGAAGGCTGAGTACATCTGGACCGATGGGCAGGA180GGGTGAGCCCCACAAGGGTCTGCTGTTCAATGAGCTGAGGTCTAAGACCAAGACATTCGC240CAAGGAGAACGGCCTGGACGCCTCTGAGTACCCTGACTGGAGCTACGATGGCAGCAGCAC300CAACCAGGCTGAGGGTGACAACTCTGACTGCATCATCAGGCCTGTGCGCGTGGTGCCTGA360CCCCATCCGTGGCGCTCCCCACGTGCTGGTCATGTGCGAGGTCTTCGGCCCTGATGGCCA420ACCTCACCCAAGCAACACTCGTGCCAAGCTGCGTGAGCAGCTGACCCCAAAGGCTCTGGA480
权利要求
1.一种谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种克隆根据权利要求1所述的基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因；挑选cDNA 文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。
4.一种重组表达载体，该重组载体含有根据权利要求1所述的基因。
5.一种宿主细胞，该宿主细胞根据权利要求1所述的重组载体。
6.一种根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶基因在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。
7.一种根据权利要求2所述的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。本发明的基因来源于盐藻，为SEQIDNO1所示的碱基序列，该基因具有合成谷氨酰胺合成酶的功能，并且证明了该基因能够显著提高模式生物大肠杆菌合成谷氨酰胺的能力。这也预示了所公开的全长基因及氨基酸序列，其在提高生物体的氮利用效率、增加生物体氮元素含量的植物基因工程方面具有应用价值。
文档编号C12N1/21GK102250925SQ201110148438
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者孙晓亮, 宋任涛, 屈武斐, 朱晨光, 范倩岚, 许政暟 申请人:上海大学